鄔波，王譯晗，馬旭，焦遞進(jìn)，王佳媛，吳鐵倫

（1. 遼寧省骨關(guān)節(jié)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110044；2. 沈陽市骨科醫(yī)院關(guān)節(jié)外科；3. 病理科）

髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良（developmental dysplasia of the hip，DDH）是一種常見的發(fā)育障礙性疾病，具有長期慢性疼痛和髖關(guān)節(jié)活動(dòng)受限等主要病理特征。這種疾病治療的一般標(biāo)準(zhǔn)是早期發(fā)現(xiàn)和早期治療，90%的病例可使病情恢復(fù)正常［1-2］。晚期DDH 需要手術(shù)治療嚴(yán)重的發(fā)育不良和髖關(guān)節(jié)脫位［3-5］。然而即使晚期 DDH 手術(shù)成功后，文獻(xiàn)報(bào)道，在45 年隨訪中仍有46%的患者需要全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)治療骨性關(guān)節(jié)炎［4］。因此，DDH 患者最終將會(huì)發(fā)展為退變性髖關(guān)節(jié)炎。本文對DDH 患者血清和滑膜中炎性因子進(jìn)行分析研究，闡述DDH 的病變機(jī)制，探討DDH 發(fā)展為髖關(guān)節(jié)炎與血清和滑膜中炎性因子的相關(guān)性，為DDH 的保守治療提供理論指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以2017 年9 月至2019 年9 月在我院行人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)患者50 例為研究對象，取血清、滑膜標(biāo)本，其中 DDH 患者 25 例為觀察組和股骨頸骨折患者25 例為對照組。DDH 患者包括男 8 髖，女 17 髖，年齡 44 ～ 68 歲，平均 55.3歲；股骨頸骨折患者包括男7 髖，女18 髖，年齡50～69 歲，平均 59.3 歲。2 組患者在性別、年齡等方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）Crowe 分型Ⅰ-Ⅱ型的髖臼發(fā)育不良患者；（2）髖臼疼痛，需行手術(shù)治療者；（3）X線片髖關(guān)節(jié)沒有嚴(yán)重的退行性改變，日常髖關(guān)節(jié)沒有明顯疼痛感覺。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的患者；（2）既往經(jīng)歷過髖部手術(shù)的患者。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者自愿捐贈(zèng)標(biāo)本并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 HE 染色液（Baso，珠海貝索）；生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測試劑盒SP-9001（ZSGB-BIO，北京中杉金橋）；抗 IL-6 抗體、抗基質(zhì)金屬蛋白酶 3（matrix metalloproteinase3，MMP-3）抗體和抗金屬蛋白酶組織抑制因子-1（tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1）抗體（Bioss，北京博奧森）；Olympus 顯微鏡及CellSens standard 圖像采集系統(tǒng)。

1.3 方法

1.3.1 組織學(xué)觀察 關(guān)節(jié)置換后切取髖關(guān)節(jié)滑膜，共計(jì)50 個(gè)標(biāo)本。將標(biāo)本置于10%甲醛溶液中固定，12%中性EDTA-2Na 常溫脫鈣1.5 min，經(jīng)梯度脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后作厚度為4 μm的連續(xù)切片。切片行 HE 染色（具體操作詳見說明書），觀察2 組滑膜的病理改變情況。

1.3.2 免疫組化分析 采用免疫組化SP 法對2組石蠟切片進(jìn)行IL-6、MMP-3 和TIMP-1 免疫組化染色分析。切片脫蠟至水，0.125%胰蛋白酶37℃下行抗原修復(fù)20 min，用體積分?jǐn)?shù)為3%的H2O2室溫阻斷5 min，山羊血清封閉 15 min，在一抗IL-6（1∶350）、MMP-3（1∶200）或 TIMP-1（1∶400）中 4 ℃孵育過夜。沖洗后，分別與生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 反應(yīng)1 h 以及鏈霉卵白素反應(yīng)1 h，最后用含有DAB 的緩沖液顯色，脫水透明，中性樹膠封片。免疫組化切片置于 100 倍Olympus顯微鏡下觀察，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取5 個(gè)不重疊視野，測定5 個(gè)積分光密度（ integral optical density，IOD）值取平均值，利用 Image-Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行圖像分析，半定量測定IL-6、MMP-3和 TIMP-1 的 IOD，比較 2 組 IL-6、MMP-3 和TIMP-1 的蛋白表達(dá)情況。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 抽取患者靜脈血2 ml，離心分離血清，將血清標(biāo)本加入至包被有兔多克隆抗人 IL-6、MMP-3 或 TIMP-1 抗體的 96 孔微滴定量板中，37 ℃孵育l h。洗滌緩沖液洗3 次，加入酶標(biāo)二抗（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1 ml，37 ℃孵育 l h。洗滌 3 次，加入臨時(shí)配制的 TMB底物溶液 0.1 ml，37 ℃ 孵育 15 min。2 mol／L 硫酸終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀450 nm 下檢測吸收率。用標(biāo)準(zhǔn)重組人類 IL-6、MMP-3 或 TIMP-1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)血清標(biāo)本檢測3 次，取平均值記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察 HE 染色發(fā)現(xiàn)，對照組滑膜未見明顯增生，被覆細(xì)胞排列較為規(guī)則，少量炎性細(xì)胞浸潤，滑膜下層血管組織無明顯病理改變。DDH 組滑膜呈乳頭狀增生，被覆細(xì)胞增生，表面纖維素滲出，大量炎性細(xì)胞浸潤，滑膜下層新生血管形成，血管擴(kuò)張，見圖1。

2.2 免疫組化結(jié)果分析 IL-6 免疫組化染色于細(xì)胞核和細(xì)胞之中，MMP-3 和TIMP-1 免疫組化均染色于細(xì)胞質(zhì)中；觀察組滑膜中IL-6 及MMP-3的棕色物質(zhì)表達(dá)較對照組顯著增加，見圖2。觀察組滑膜中IL-6、MMP-3 的IOD 值顯著高于對照組（P＜0.05）；2 組 TIMP-1 的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表 1。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果 觀察組血清中的IL-6及MMP-3 均較對照組顯著增加（P＜0.05），2 組血清TIMP-1 比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

3 討論

DDH 即髖關(guān)節(jié)發(fā)育異常，通常會(huì)導(dǎo)致一系列的有害影響，從中度髖臼發(fā)育不良到股骨頭半脫位或脫位［6］。中國每年有1%～5%的新生兒受到DDH 影響，不同人群中女性與男性比例在4∶1 ～10∶1 之間［7］。其主要解剖學(xué)特征包括髖關(guān)節(jié)變淺，松弛關(guān)節(jié)囊，關(guān)節(jié)間隙縮小和髖關(guān)節(jié)紊亂，導(dǎo)致慢性疼痛，髖關(guān)節(jié)周圍炎癥，滑膜增生和髖臼肥大［8］。DDH 初期以保守治療為主，通常需口服氨糖類藥物及減輕負(fù)重，緩解關(guān)節(jié)疼痛。對于晚期診斷的DDH，一般治療無法使髖關(guān)節(jié)恢復(fù)正常，會(huì)導(dǎo)致髖關(guān)節(jié)的持續(xù)退變，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨的退行性病變及髖關(guān)節(jié)炎，給醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來長期的負(fù)擔(dān)［9］。當(dāng) DDH 患者關(guān)節(jié)磨損嚴(yán)重，疼痛影響日常工作生活時(shí)，需行關(guān)節(jié)置換手術(shù)治療。

圖1 觀察組和對照組患者髖關(guān)節(jié)滑膜HE 染色結(jié)果（×200）

圖2 觀察組及對照組免疫組化染色結(jié)果（×200）

表 1 2 組患者 IL-6、MMP-3 和 TIMP-1 免疫組化染色的IOD 值比較

表2 2 組患者血清中 IL-6、MMP-3 及 TIMP-1的表達(dá)水平比較

DDH 病變機(jī)制復(fù)雜，細(xì)胞外基質(zhì)降解是DDH重 要 的 病 理 改 變 之 一［10］。基 質(zhì) 金 屬 蛋 白 酶（MMPs）是細(xì)胞外鋅依賴性內(nèi)肽酶的大家族，其在生理和病理?xiàng)l件下催化細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和降解，TIMPs 作為MMPs 的抑制劑起到平衡MMPs 的作用［11-12］。本研究結(jié)果顯示，觀察組中 MMP-3的表達(dá)較對照組顯著增加，高出正常值的1 倍，2組中TIMP-1 的表達(dá)未見明顯差異。同時(shí)，MMP-3在觀察組與對照組之間差異較TIMP-1 在2 組間的差異大，因此推斷MMP-3 的作用超過了TIMP-1的作用，二者間的平衡被破壞而加劇了關(guān)節(jié)軟骨的降解，提示在臨床診斷時(shí)患者血清中MMP-3 含量超出正常值1 倍時(shí)，有發(fā)展為骨性關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)，可提示DDH 患者在軟骨代謝層面上存在嚴(yán)重的關(guān)節(jié)退變，需藥物或減輕負(fù)重等保守治療方法進(jìn)行干預(yù)。本研究結(jié)果為研究DDH 患者關(guān)節(jié)軟骨代謝調(diào)節(jié)及病程向骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)展等方面提供了一種新的視野。

DDH 被認(rèn)為是骨性關(guān)節(jié)炎的主要因素之一，但與傳統(tǒng)骨性關(guān)節(jié)炎的病程進(jìn)展有所不同，本研究結(jié)果顯示，觀察組滑膜呈乳頭狀增生，被覆細(xì)胞增生，表面纖維素滲出，大量炎性細(xì)胞浸潤，滑膜下層新生血管形成，血管擴(kuò)張，提示DDH 患者的滑膜具有滑膜炎癥，有進(jìn)一步發(fā)展為骨性關(guān)節(jié)炎的可能。而IL-6 是T 淋巴細(xì)胞分泌的一種炎性促進(jìn)細(xì)胞因子，異常升高促進(jìn)成纖維細(xì)胞和基質(zhì)小分子的降解，破壞軟骨的結(jié)構(gòu)和功能［13］。本研究中觀察組滑膜和血清中的IL-6 的表達(dá)較對照組有明顯增加，DDH 組血清中IL-6 的含量高出對照組2 倍以上，本研究結(jié)果提示DDH 患者向骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)展的過程與IL-6 具有一定的相關(guān)性，說明IL-6 在DDH 的發(fā)病發(fā)展中起著重要作用，與MMP-3 及TIMP-1 共同作用導(dǎo)致DDH 的病程進(jìn)展，為輔助指導(dǎo)臨床進(jìn)行保守治療干預(yù)的提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

綜上所述，DDH 患者關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)軟骨退變指標(biāo)MMP-3、TIMP-1 及炎性指標(biāo)IL-6 可以輔助診斷DDH 的病程進(jìn)展，作為DDH 患者的臨床診斷炎性指標(biāo)。本課題組將對DDH 的病理改變及發(fā)展機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究，為DDH 患者病程的臨床診斷提供理論支持，提示患者加強(qiáng)防護(hù)，縮短患者入院診斷時(shí)間，縮減診斷流程，以提高保髖手術(shù)的療效。