[摘要] 目的 探究環(huán)狀RNA hsa_circ_0085576 對口腔鱗狀細胞癌（OSCC） 細胞遷移和侵襲的影響及其分子機制。方法 使用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR） 和蛋白印跡法檢測OSCC細胞中hsa_circ_0085576、微小RNA-498 （miR-498） 以及B細胞特異性莫洛尼鼠白血病病毒整合位點1 （BMI-1） 的表達水平。使用CCK-8、劃痕實驗、Transwell 實驗以及qRT-PCR、蛋白印跡法分別檢測SCC-15 細胞增殖活力、遷移及侵襲能力以及相關(guān)基因和蛋白的相對表達量。結(jié)果 OSCC細胞中hsa_circ_0085576 與BMI-1 表達上調(diào)，miR-498 表達下調(diào)（Plt;0.05）。下調(diào)hsa_circ_0085576 表達或過表達miR-498 后SCC-15 細胞的增殖活性、劃痕愈合率、侵襲細胞數(shù)目以及細胞周期蛋白D1、波形蛋白表達水平下調(diào)，miR-498 和E-鈣黏蛋白表達水平上調(diào)（Plt;0.05）；抑制miR-498 表達可減弱下調(diào)hsa_circ_0085576 表達對OSCC細胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用；上調(diào)BMI-1 表達可減弱過表達miR-498 對OSCC 細胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用。結(jié)論 下調(diào)hsa_circ_0085576 表達可通過激活miR-498/BMI-1 軸抑制OSCC細胞增殖、遷移及侵襲。

[關(guān)鍵詞] 環(huán)狀RNA hsa_circ_0085576； 微小RNA-498； B 細胞特異性莫洛尼鼠白血病病毒整合位點1； 口腔鱗狀細胞癌

[中圖分類號] R730.2 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/gjkq.2024007

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC） 是頭頸部最常見的腫瘤之一，5年生存率不足50%[1]。腫瘤轉(zhuǎn)移和免疫抑制是OSCC預(yù)后不良的主要原因[2]。目前OSCC進展的分子機制仍不完全清楚。環(huán)狀RNA （circular RNA，circRNA）在癌癥（包括OSCC） 進程中起著至關(guān)重要的作用[3-4]。腺苷二磷酸核糖基化因子鳥苷酸激酶1（adenosine diphosphate ribosylation factor guanylatekinase 1，ASAP1） 在多種腫瘤中表達上調(diào)，已被證明是多種腫瘤的惡性指標[5-7]。研究[8]發(fā)現(xiàn)：在OSCC中，ASAP1表達上調(diào)，介導(dǎo)癌細胞的侵襲性表型，且ASAP1 mRNA較高的表達水平與較短的無進展生存趨勢呈正相關(guān)。hsa_circ_0085576是宿主基因ASAP1經(jīng)剪接環(huán)化而成的circRNA。據(jù)報道[9]：hsa_circ_0085576在腎透明細胞癌中表達上調(diào)，沉默其表達可靶向上調(diào)微小RNA（microRNA，miR）-498，抑制腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。miR-498可以作為抑癌因子發(fā)揮作用[10-11]。然而， hsa_circ_0085576和miR-498在OSCC中的表達及生物學(xué)功能仍不清楚。B細胞特異性莫洛尼鼠白血病病毒整合位點1 （B-cell-specific Moloney murine leukemia virusintegration site 1，BMI-1） 是一種表觀遺傳蛋白，是正常干細胞自我更新和維持癌癥干細胞功能所必需的。研究[12]發(fā)現(xiàn)：BMI-1在OSCC中高表達，且與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，為OSCC的關(guān)鍵治療靶點。此外，BMI-1被證實為miR-498的靶基因[13]?；诖?，筆者推測hsa_circ_0085576、miR-498和BMI-1在OSCC中可能形成circRNA/miRNA/mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)OSCC的進展，因此本研究探討hsa_circ_0085576在OSCC細胞增殖、遷移和侵襲中的作用及機制，以期為OSCC的治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 細胞來源

正常人口腔角質(zhì)形成細胞（normal oral keratinocytes，NOK）、OSCC細胞（HSC-3、SCC-15和CAL-27），均購自美國ATCC細胞中心，貨號依次為：YS552C、YS1061C、YS1185C和YS1716C。

1.2 主要試劑與儀器

Trizol （總RNA提取試劑）、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerasechain reaction， qRT-PCR） 試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑以及放射免疫沉淀測定（radioimmunoprecipitation assay， RIPA）裂解液均購于美國Thermo Fisher Scientific公司；細胞計數(shù)試劑（cell counting kit-8，CCK-8） 細胞增殖檢測試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；hsa_circ_0085576 小干擾RNA （small interfering，siRNA），包括si-hsa_circ_0085576-1、si-hsa_circ_0085576-2、si-hsa_circ_0085576-3，miR-498 模擬物和miR-498抑制物，BMI-1過表達載體質(zhì)粒及其陰性對照，以及實驗中所涉及的引物均購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Transwell小室購于美國Corning 公司； 一抗BMI-1、細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、波形蛋白（Vimentin）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin） 以及甘油醛3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase， GAPDH） 均購于英國Abcam公司。細胞培養(yǎng)箱、核酸定量熒光計、酶標儀購于美國Thermo公司（型號分別為BB150-2TCS、Qubit 4、MK3）；熒光定量PCR儀、凝膠成像儀購于美國Bio-Rad公司（型號分別為CFX96、Gel Doc EZ）； 顯微鏡購于日本OLYMPUS公司（型號為Ⅸ71）。

1.3 研究方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組

采用含胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco’s modifiedeagle medium，DMEM） 于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)NOK、HSC-3、SCC-15和CAL-27細胞。NOK細胞為對照組，通過檢測不同OSCC細胞中的基因表達水平，篩選合適的細胞進行后續(xù)干擾實驗細胞。當細胞融合度達到80%左右時，以Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明為依據(jù)對SCC-15細胞進行分組轉(zhuǎn)染。首先，在SCC-15細胞中分別轉(zhuǎn)染siRNA空白質(zhì)粒（設(shè)為si-NC組） 和hsa_circ_0085576-1、sihsa_circ_0085576-2、si-hsa_circ_0085576-3 （分別設(shè)為干擾1組、干擾2組、干擾3組）。其次，在干擾2組基礎(chǔ)上分別轉(zhuǎn)染miR-498抑制物陰性對照（干擾2+miR inhibitor組） 和miR-498抑制物（干擾2+miR-498 inhibitor組）。再次，分別在SCC-15細胞中轉(zhuǎn)染miR-498模擬物陰性對照（miR mimics組） 和miR-498模擬物（miR-498 mimics組）。最后，在miR-498 mimics組基礎(chǔ)上分別轉(zhuǎn)染空白載體質(zhì)粒（miR-498 mimics+Ctrl組） 和BMI-1過表達載體質(zhì)粒（miR-498 mimics+BMI-1組）。

1.3.2 qRT-PCR 檢測基因表達

參照Trizol說明書分別提取NOK、HSC-3、SCC-15、CAL-27細胞以及各組轉(zhuǎn)染后的SCC-15細胞中總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成cDNA 進行qRT-PCR 檢測。采用2-Δ Δ Ct 計算hsa_circ_0085576、miR-498及BMI-1的mRNA相對表達量。qRT-PCR所用的引物序列見表1，其中U6為miR-498 的內(nèi)參對照， GAPDH 為hsa_circ_0085576、BMI-1的內(nèi)參對照。

1.3.3 CCK-8 檢測細胞增殖活力

收集各組轉(zhuǎn)染后細胞，以每孔3×103個細胞的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁生長到70%～90%時，每孔加入10 μL CCK-8溶液，避光孵育2 h后在酶標儀中檢測各孔細胞的吸光度值（以此表示細胞增殖活力）。

1.3.4 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

收集各組轉(zhuǎn)染后細胞， 以每孔1×106個細胞的密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后采用移液管尖在每孔中間劃直線。添加無血清的DEME培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。在培養(yǎng)劃痕0 h和24 h時分別使用顯微鏡觀察并拍照，測量劃痕寬度。劃痕愈合率（%） =（0 h 劃痕寬度－24 h 劃痕寬度）÷0 h 劃痕寬度×100%。

1.3.5 Transwell 實驗檢測細胞侵襲數(shù)量

收集各組轉(zhuǎn)染后細胞，使用無血清培養(yǎng)基將細胞密度調(diào)整為每毫升1×106個，吸取300 μL加入到Transwell上室（含有基質(zhì)膠），下室中加入500 μL正常培養(yǎng)基， 培養(yǎng)24 h后取出小室， 用棉簽拭去上室中未侵襲的細胞， 添加4%多聚甲醛固定后，加入1%結(jié)晶紫染色，磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered solution，PBS） 沖洗后于倒置顯微鏡下觀察并拍照， 隨機選擇5 個視野進行細胞計數(shù)。

1.3.6 蛋白印跡法（Western blot） 檢測相關(guān)蛋白的表達水平

使用RIPA裂解液分別提取NOK、HSC-3、SCC-15、CAL-27細胞以及各組轉(zhuǎn)染后的SCC-15細胞中的總蛋白，測定蛋白濃度后，采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 分離蛋白并轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶封閉后添加一抗BMI-1、Cyclin D1、Vimentin、E-cadherin及GAPDH，低溫孵育過夜，然后加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP） 標記的二抗孵育2 h，顯影，在凝膠成像儀中拍照，使用Image J軟件分析條帶灰度值。目的蛋白的相對表達水平=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.3.7 雙熒光素酶報告基因檢測

使用starBase數(shù)據(jù)庫（https：//starbase.sysu.edu.cn/index.php） 預(yù)測hsa_circ_0085576或BMI-1與miR-498的結(jié)合位點。將具有miR-498 結(jié)合位點的野生型（wild type，WT） hsa_circ_0085576或BMI-1 3’ -非翻譯區(qū)（untranslatedregions，UTR） 的cDNA片段插入到熒光素酶報告載體pmirGLO中， 分別命名為WThsa_circ_0085576 和WT-BMI-1。hsa_circ_0085576和BMI-1 3’UTR的突變是通過使用基因突變試劑盒（Takara公司，日本） 改變miR-498的互補結(jié)合位點來進行的，插入到熒光素酶報告載體pmirGLO中構(gòu)建突變體（mutant，MUT），命名為MUT-hsa_circ_0085576 和MUT-BMI-1。在24 孔板中培養(yǎng)SCC-15細胞（每孔1×104個細胞），并使用Lipofectamine 2000 將構(gòu)建的hsa_circ_0085576或BMI-1 3’ -UTR 報告載體與miR-498 模擬物（miR-498 mimic） 或陰性對照（negative control，NC） 模擬物（miR-NC） 共轉(zhuǎn)染SCC-15 細胞并孵育48 h，收獲細胞后用PBS洗滌，裂解緩沖液裂解，使用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)測量熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 25.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，使用Shapiro-Wilk檢驗評估數(shù)據(jù)的正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標準差表示。多組間比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗，檢驗水準為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 hsa_circ_0085576、miR-498、BMI-1 在OSCC細胞中的表達情況

圖1 結(jié)果表明， 與NOK細胞相比，HSC-3、SCC-15和CAL-27細胞中hsa_circ_0085576與BMI-1 mRNA表達增高（Plt;0.05），miR-498的表達降低（Plt;0.05），且OSCC各細胞系中BMI-1的蛋白水平也高于NOK細胞（Plt;0.05）。

由圖1可見，SCC-15細胞中3個基因表達趨勢與NOK細胞差異最大，故后續(xù)選擇SCC-15細胞作為研究這3個基因的OSCC細胞載體。

2.2 下調(diào)hsa_circ_0085576 表達對miR-498 與BMI-1 表達的影響

各組miR-498與BMI-1的相對表達量見圖2和表2。與si-NC組相比，干擾1、2、3組的hsa_circ_0085576 （Plt;0.05） 和BMI-1的蛋白表達降低（Plt;0.05），miR-498的表達增高（Plt;0.05）；其中干擾2組的干擾效率最高，故之后選擇此組細胞作為后續(xù)研究對象。

2.3 下調(diào)hsa_circ_0085576 和miR-498 表達對SCC-15 細胞增殖、遷移、侵襲和BMI-1 的影響

如圖3所示：與si-NC組相比，干擾2組SCC-15細胞的增殖活性、劃痕愈合率、侵襲細胞數(shù)目以及Cyclin D1、Vimentin、BMI-1蛋白表達水平均降低，miR-498和E-cadherin蛋白表達水平增高（Plt;0.05）；與干擾2組相比，干擾2+miR-498 inhibitor組SCC-15細胞的增殖活性、劃痕愈合率、侵襲細胞數(shù)目以及Cyclin D1、Vimentin、BMI-1蛋白表達水平均增高，miR-498和E-cadherin蛋白表達水平降低（Plt;0.05）。

2.4 過表達miR-498 和BMI-1 對SCC-15 細胞增殖、遷移、侵襲的影響

過表達miR-498和BMI-1對SCC-15細胞的影響如圖4所示：與miR mimics組相比，miR-498 mimics組SCC-15細胞的增殖活力、劃痕愈合率、侵襲細胞數(shù)目以及BMI-1、Cyclin D1、Vimentin蛋白表達水平均降低，E-cadherin蛋白表達水平增高（Plt;0.05）；與miR-498 mimics組相比，miR-498 mimics+BMI-1組SCC-15細胞的增殖活力、劃痕愈合率、侵襲細胞數(shù)目以及BMI-1、Cyclin D1、Vimentin蛋白表達水平均增高，E-cadherin蛋白表達水平降低（Plt;0.05）。

2.5 hsa_circ_0085576、miR-498 和BMI-1 的靶向關(guān)系驗證

使用starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測了hsa_circ_0085576與miR-498的結(jié)合位點，結(jié)果見圖5A。雙熒光素酶報告基因測定以驗證hsa_circ_0085576與miR-498 的相互作用， 結(jié)果顯示： 與miR-NC和WThsa_circ_0085576共轉(zhuǎn)染組相比，miR-498 mimic和WT-hsa_circ_0085576共轉(zhuǎn)染組細胞的熒光素酶活性顯著降低（Plt;0.05）；然而，與miR-NC和MUThsa_circ_0085576共轉(zhuǎn)染組相比，miR-498 mimic和MUT-hsa_circ_0085576共轉(zhuǎn)染組細胞的熒光素酶活性無顯著變化（Pgt;0.05），結(jié)果見圖5B。

使用StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-498在BMI-1上的潛在結(jié)合位點，結(jié)果見圖5C。雙熒光素酶測定miR-498與BMI-1的相互作用，結(jié)果顯示：與miRNC和WT-BMI-1共轉(zhuǎn)染組相比，miR-498 mimic和WT-BMI-1共轉(zhuǎn)染組細胞的熒光素酶活性顯著降低（Plt;0.05）；然而與miR-NC和MUT-BMI-1共轉(zhuǎn)染組相比，miR-498 mimic和MUT-BMI-1共轉(zhuǎn)染組細胞的熒光素酶活性無顯著變化（Pgt;0.05），見圖5D。

3 討論

失調(diào)的circRNA可以作為癌癥進展中的促癌或抗癌因子。circRNA通過“海綿”miRNA發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，被認為是競爭性內(nèi)源性RNA[14-15]。已有研究[9]證實：hsa_circ_0085576可作為競爭性內(nèi)源性RNA與miR-498直接相互作用，減弱其對靶基因的抑制作用，進而影響腎細胞癌細胞的增殖、遷移、侵襲過程。miR-498在多數(shù)腫瘤中充當抑癌基因，如miR-498在食管癌中下調(diào)，其過表達可通過抑制巨噬細胞自噬和M2樣極化從而抑制食管癌進展[10]；上調(diào)miR-498表達能夠抑制胃癌細胞的增殖、遷移和EMT[13]。本研究發(fā)現(xiàn)：miR-498在OSCC細胞中呈低表達， 而過表達miR-498 和沉默hsa_circ_0085576均可上調(diào)miR-498和E-cadherin表達，降低SCC-15細胞的增殖、遷移和侵襲能力以及Cyclin D1、Vimentin表達，該結(jié)果表明miR-498是OSCC中的抑癌基因。為了進一步驗證hsa_circ_0085576的作用機制，本研究采用生物信息學(xué)網(wǎng)站對hsa_circ_0085576的靶miRNA進行分析， 發(fā)現(xiàn)miR-498序列存在與hsa_circ_0085576互補的結(jié)合位點，雙熒光素酶結(jié)果證實hsa_circ_0085576可作為miR-498的“海綿”，并采用miR-498 inhibitor轉(zhuǎn)染以下調(diào)miR-498表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制miR-498表達可在一定程度上減弱hsa_circ_0085576沉默對SCC-15細胞惡性行為的抑制作用。這一結(jié)果提示：miR-498介導(dǎo)hsa_circ_0085576對OSCC細胞惡性行為具有調(diào)控作用。

BMI-1和miRNA之間的相互作用已經(jīng)被證實，二者可以共同影響人類癌癥的生物學(xué)過程，如miR-218可直接與BMI-1相互作用，抑制BMI-1表達，進而抑制肝癌細胞的生長過程[16]。有研究[13，17]證實，BMI-1是miR-498的直接靶基因，二者呈負相關(guān)。在本研究中，BMI-1在OSCC細胞中呈高表達，與miR-498表達趨勢相反。外源添加miR-498mimics可降低SCC-15細胞中BMI-1的表達，抑制Cyclin D1、Vimentin表達以及細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并促進E-cadherin表達；雙熒光素酶結(jié)果證實BMI-1為miR-498的靶基因，這與既往的研究結(jié)果一致，表明miR-498可靶向負調(diào)控BMI-1。此外，在過表達miR-498的基礎(chǔ)上上調(diào)BMI-1可減弱miR-498過表達對OSCC細胞惡性行為的抑制作用。這一結(jié)果提示：過表達miR-498可通過靶向下調(diào)BMI-1進而抑制SCC-15細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，沉默hsa_circ_0085576可通過上調(diào)miR-498抑制BMI-1表達，從而抑制OSCC細胞增殖、遷移和侵襲，進而抑制OSCC的惡性進展。本研究為OSCC的靶向治療提供了思路。在未來的研究中需擴大樣本量，進一步分析hsa_circ_0085576的臨床意義并結(jié)合體內(nèi)動物實驗及多個OSCC細胞系中對本結(jié)論進行多方面驗證。此外，本研究僅選擇BMI-1作為miR-498的靶基因進行了探究，并未對其他靶基因進行驗證，后續(xù)將針對以上不足進行更深入的研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。

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（ 本文編輯 吳愛華 ）

[基金項目] 2021 年度河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究課題計劃（20210802）