摘要：目的 研究CDHR2 通過PI3K/Akt 信號(hào)通路抑制乳腺癌細(xì)胞生長和細(xì)胞周期的作用機(jī)制。方法 利用生物信息學(xué)分析CDHR2在乳腺癌中的表達(dá)及生存預(yù)后情況，并利用免疫組化驗(yàn)證，采用qRT-PCR、Western blot檢測(cè)5株乳腺癌細(xì)胞株與正常乳腺上皮細(xì)胞中CDHR2的表達(dá)，并分析CDHR2的表達(dá)情況。篩選出CDHR2表達(dá)量低的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231及MCF7進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達(dá)CDHR2，分為NC組（空白質(zhì)粒對(duì)照）和CDHR2組（CDHR2質(zhì)粒過表達(dá)組）。利用CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)、EdU增殖實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)探究CDHR2 對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長和細(xì)胞周期的影響，通過Western blotting 檢測(cè)CDHR2 過表達(dá)對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路和周期通路蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果 生物信息學(xué)分析顯示在乳腺癌及癌旁中CDHR2表達(dá)量均較低且兩者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），但高表達(dá)CDHR2乳腺癌患者預(yù)后更好（Plt;0.05）。免疫組化、qRT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)提示，CDHR2在乳腺癌組織及乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)均顯著下調(diào)（Plt;0.01），CDHR2可以抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及阻滯乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期（Plt;0.01），CDHR2能夠抑制PI3K和Akt磷酸化蛋白表達(dá)、抑制周期蛋白Cyclin D1的表達(dá)。結(jié)論 過表達(dá)CDHR2可能通過PI3K/Akt信號(hào)通路抑制乳腺細(xì)胞生長及阻滯乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期。

關(guān)鍵詞：乳腺癌；CDHR2；PI3K/Akt 通路；增殖；細(xì)胞周期

乳腺癌已超過肺癌成為世界上最常見的癌癥和第五大癌癥死亡原因［1］，盡管乳腺癌的治療理念隨著醫(yī)學(xué)對(duì)腫瘤的不斷深入認(rèn)識(shí)而逐漸提高，但乳腺癌的發(fā)病機(jī)制至今仍不明確，乳腺癌患者的長期生存率也不理想。乳腺癌患者根據(jù)不同的激素受體表達(dá)情況可進(jìn)分為luminal A、luminal B、HER-2 過表達(dá)型以及三陰型4 種類型乳腺癌。對(duì)于乳腺癌患者而言，保乳手術(shù)、乳腺癌改良根治術(shù)和放療是最常見的治療方法。同時(shí)，還可根據(jù)乳腺癌的分期、分子分型、淋巴結(jié)分期等進(jìn)行個(gè)體化化療、靶向治療和激素治療等全身性輔助治療［2］。但目前的臨床治療存在一定局限性，比如激素受體陽性乳腺癌患者存在內(nèi)分泌耐藥且復(fù)發(fā)率較高等問題，人類表皮生長因子受體2（ HER2）陽性型存在靶向治療耐藥［3］，三陰性乳腺癌患者的早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高，且靶標(biāo)部位不明確，腫瘤異質(zhì)性強(qiáng)，患者只能選擇化療。由于不同的乳腺癌亞型在基因表達(dá)模式、治療策略的選擇以及對(duì)治療的反應(yīng)和預(yù)后等方面存在差異。因此，為進(jìn)一步了解乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，改進(jìn)治療方法和延長生存期。尋找理想的靶點(diǎn)和新型生物標(biāo)志物對(duì)于早期診斷、改善預(yù)后和開展腫瘤分子靶向治療具有重要意義［4］。

鈣粘蛋白相關(guān)家族成員2（CDHR2）也被命名為PCDH24屬于原鈣粘蛋白家族，PCDH家族在鈣依賴性細(xì)胞粘著中扮演重要角色［5］。在許多人類癌癥（包括乳腺癌，白血病，胃癌，結(jié)直腸癌，食道癌和肺癌）中已經(jīng)報(bào)道了一些PCDH家族成員（例如PCDH8，PCDH9，PCDH10，PCDH17 和PCDH20）的表達(dá)喪失［6-9］，表明 PCDH可以作為人類癌癥的腫瘤抑制劑，但目前CDHR2在乳腺癌中尚未有研究。本研究通過闡明CDHR2 抑制PI3K/Akt通路抑制乳腺癌細(xì)胞的生長，并進(jìn)一步阻滯乳腺癌細(xì)胞周期，有望為乳腺癌治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

選取南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院手術(shù)切除的10例乳腺癌組織及其相應(yīng)癌旁正常組織，納入標(biāo)準(zhǔn)：初次確診為乳腺癌；治療前未進(jìn)行放療、化療及免疫治療。本研究通過南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：2022-070）。MCF10A、MDAMB-231、MCF7、HCC1937、T47D和SKBR3 細(xì)胞系均由南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。

主要試劑：PBS 粉末、Tween20/TBS 溶液（20×TBST，北京雷根公司）；RIPA蛋白裂解液（Strong）、蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑（康為世紀(jì)公司）；RPMIDMEM培養(yǎng)基（Biological Industries）；MCF10A細(xì)胞專用培養(yǎng)基（武漢普諾塞公司）；南美源胎牛血清（上海微科公司）；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen）；PAGE 凝膠快速制備試劑盒、蛋白預(yù)染Marker、ECL發(fā)光顯影劑（上海雅酶公司）；PVDF 膜（Millipore）；RNA提取試劑盒（FOREGENE），細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購自Dojindo（日本同仁化學(xué)）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析

本研究采用GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http： //gepia.cancer-pku.cn/）對(duì)CDHR2 在乳腺癌組織和正常乳腺上皮組織中表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)比，通過兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析兩組間表達(dá)差異情況，樣本量包括癌組織1085 例，正常組織112 例。利用Kaplan-MeierPlotter （https：//kmplot.com）對(duì)CDHR2 與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行分析。使用STRING（https：//cn.string-db.org）對(duì)CDHR2與PI3K、AKT、CCND1及其他可能存在的蛋白進(jìn)行相互結(jié)合作用預(yù)測(cè)，網(wǎng)站參數(shù)設(shè)置：Homosapiens，confidence（0.15）。

1.2.2 免疫組化

將組織切片置于烤箱60 ℃烘烤120 min，經(jīng)二甲苯及梯度濃度酒精脫蠟脫水后，向切片滴加適量3% H2O2以阻滯內(nèi)源性過氧化物酶，室溫靜置15 min，去離子水洗3次，檸檬酸鈉抗原修復(fù)液高溫處理8 min，于室溫條件下自然冷卻，室溫下山羊血清封閉30 min，加入CDHR2 抗體（1∶2000）4 ℃處理下過夜。PBS清洗3次，將組織切片與帶有HRP結(jié)合的二抗孵育30 min，DAB顯影，細(xì)胞核用蘇木素進(jìn)行染色，免疫組化評(píng)分：染色強(qiáng)度分為0～3分，陰性0分，弱陽性1分，陽性2分，強(qiáng)陽性3分。染色范圍1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分，最終評(píng)分=染色強(qiáng)度評(píng)分×染色范圍評(píng)分。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

乳腺上皮細(xì)胞MCF10A使用專用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF7、HCC1937、T47D、SKBR3 均使用含10% 胎牛血清的RPMI DMEM培養(yǎng)，將細(xì)胞放置在37 ℃、5%CO2條件下靜置培養(yǎng)。每3 d 傳代1 次，當(dāng)細(xì)胞生長狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，用胰酶消化、離心后使用培養(yǎng)基重懸得到單細(xì)胞懸液，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 qRT-PCR

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，提取實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中總RNA，檢測(cè)濃度和純度合格后取2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用相對(duì)量化方法，通過比較2-ΔΔCt來計(jì)算基因的倍數(shù)變化，將GAPDH作為內(nèi)參。引物從生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列：GAPDH 正向引物CAATGACCCCTTCATTGACC；GAPDH 反向引物GACAAGCTTCCCGTTCTCAG；CDHR2 正向引物CCCCGAAGTTCCTAGCCAAC；CDHR2 反向引物GTCTTCCGCTACCAACCAGA。

1.2.5 Western blot 實(shí)驗(yàn)

計(jì)算所提取細(xì)胞蛋白含量30 μg，以3∶1 的比例蛋白與上樣緩沖液4×SDS進(jìn)行混合，置于95 ℃金屬浴鍋10 min后放置于冰上2 min。制膠后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，使其在80 V 電壓下保持30 min，而分離膠在120 V下保持90 min。轉(zhuǎn)膜采用濕式轉(zhuǎn)膜法至PVDF膜。置于含有5% BSA的 TBST密封液的平板中，于室溫下培養(yǎng)1 h。將一抗用封閉劑稀釋，于室溫孵育1 h，4 ℃孵育1夜。TBST 洗膜3次，5 min/次。孵育二抗1 h后，TBST洗膜3次，5 min/次，即可加入ECL顯色試劑顯影拍照記錄。CDHR2多克隆抗體（1∶1000）、GAPDH單克隆抗體（1∶50 000）、Akt S473 單克隆抗體（1∶1000）、Cyclin D1 多克隆抗體（1∶5000）、β-Tubulin多克隆抗體（1∶12 000），PI3K T458多克隆抗體（1∶1000，CST）。

Western blotting灰度值分析選用Image J軟件協(xié)助定量分析，對(duì)所有條帶進(jìn)行灰度測(cè)定后，獲得對(duì)應(yīng)研究基因和內(nèi)參的區(qū)域像素值之和，以研究基因/內(nèi)參基因之比。最后將目的蛋白灰度值除以內(nèi)參蛋白的灰度值，進(jìn)行歸一化處理。

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

通過上海吉?jiǎng)P公司訂購CDHR2過表達(dá)質(zhì)粒，當(dāng)MCF-7 和MDA-MB231 細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期、細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)，消化MCF-7 和MDA-MB231 細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；向六孔板各孔中接種5×105個(gè)細(xì)胞；轉(zhuǎn)移培養(yǎng)皿至恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）。待細(xì)胞貼壁后按照Lipofectamine ?2000 轉(zhuǎn)染說明書轉(zhuǎn)染至MCF-7和MDA-MB231細(xì)胞。將處理后的細(xì)胞分別為對(duì)照組（NC組）及過表達(dá)CDHR2組（CDHR2組），轉(zhuǎn)染六孔板放至恒溫37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱放置6～8 h 后更換新的完全培養(yǎng)基，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，可收集瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行Western blotting實(shí)驗(yàn)及其他功能試驗(yàn)。

1.2.7 CCK-8實(shí)驗(yàn)

CCK8試劑盒購自南京諾唯贊生物公司，將MDA-MB-231 及MCF7 細(xì)胞離心計(jì)數(shù)接種于96孔板中，2000個(gè)細(xì)胞每孔，在貼壁后0、24、48、72、96 h檢測(cè)細(xì)胞活力。然后每孔加CCK8試劑10 uL，在37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定各孔的吸光度（A），A值反映了腫瘤細(xì)胞的增殖能力。每組重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，取平均值，記錄生長曲線。

1.2.8 EdU實(shí)驗(yàn)

采用銳博的Edu 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，首先以1∶1000比例對(duì)Edu溶液（試劑A）進(jìn)行稀釋，用細(xì)胞培養(yǎng)基將其配制為50 μmol/L Edu培養(yǎng)基；在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育2 h，去除細(xì)胞中的培養(yǎng)基；用PBS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清洗，每次清洗5 min，清洗3次；在每孔中添加50 μL細(xì)胞固定液（即PBS中含有4%的POM），在室溫下孵育30 min，去除固定液；添加50 μL 2 mg/mL甘氨酸，在脫色搖床溫養(yǎng)5 min，然后丟棄甘氨酸（用于中和的聚甲醛）；在每孔中再添加100 μL的PBS，洗滌5 min 的脫色搖床，將PBS 除去；在每孔中添加100 μL 滲透劑（PBS，0.5%Trition-X-100），在脫色搖床孵育10 min，然后用PBS 洗滌5 min 1 次；在每孔中添加100 μL 的Apollo染色劑，避光，在脫色搖床室溫育20 min，棄染；添加100 μL滲透劑（PBS，0.5%Trition-X-100），在脫色器中洗滌2～3次，每次10 min，除去滲透劑；在每個(gè)孔中添加DAPI 100 μL，在光照下，在脫色搖床室溫育5 min，除去染色反應(yīng)溶液；每孔用100 μL PBS沖洗。

1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，PBS洗3遍；加胰酶消化，加含有血清的培基終止消化；移入離心管中靜置，離心lt;500 r/min，棄上清； 將細(xì)胞重新懸浮在0.5 mL 1×PBS 中，并快速注入3.5 mL70%預(yù)冷乙醇中攪拌，室溫4 ℃保存1夜，次日將經(jīng)乙醇提取的細(xì)胞進(jìn)行離心，棄去上清，用1×PBS沖洗3次，除去殘余酒精。應(yīng)用含有0.2 mg RNase A 的1 mL PI/Triton X-100染色液（20 μg PI/0.1% Triton X-100）重懸細(xì)胞，37 ℃ 染色15 min。應(yīng)用流式細(xì)胞儀BDFACSCalibur測(cè)定細(xì)胞周期。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究用 SPSS 統(tǒng)計(jì)24.0 和GraphPad Prism9.0進(jìn)行繪圖，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間的比較，單因素方差分析用于比較多組數(shù)據(jù)的差異，生存曲線用Logrank比較，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CDHR2在乳腺癌患者中的表達(dá)及生存預(yù)后

通過TCGA數(shù)據(jù)集對(duì)CDHR2表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在乳腺癌及癌旁中CDHR2 表達(dá)量均較低且兩者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05，圖1），Kaplan-MeierPlotter在線數(shù)據(jù)分析CDHR2在乳腺癌患者中的生存預(yù)后，發(fā)現(xiàn)在三陰型、luminal A型、luminal B型、Her2過表達(dá)型乳腺癌患者中，CDHR2高表達(dá)患者預(yù)后更好，其中CDHR2 過表達(dá)的三陰型、luminal A型、luminal B型乳腺癌患者，其總生存期（OS）均高于低表達(dá)CDHR2 的乳腺癌患者（Plt;0.05，圖2）。免疫組化顯示CDHR2蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)（圖3，Plt;0.0001）。

2.2 CDHR2在乳腺癌細(xì)胞系及正常人乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平

qRT-PCR結(jié)果顯示CDHR2 在乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)較正常人乳腺上皮細(xì)胞MCF10A相比顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01，圖4）。Western blotting檢測(cè)結(jié)果提示，CDHR2在乳腺癌細(xì)胞中，尤其是在MDA-MB-231、MCF7細(xì)胞中表達(dá)水平較低（圖5）。

2.3 過表達(dá)CDHR2轉(zhuǎn)染結(jié)果驗(yàn)證

選取MDA-MB-231及MCF7兩株細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，首先過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞系，qRT-PCR測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CDHR2的表達(dá)量，在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231 及MCF7 中，CDHR2 的表達(dá)量要遠(yuǎn)高于對(duì)照組（Plt;0.001，圖6）。

2.4 過表達(dá)CDHR2抑制乳腺癌細(xì)胞增殖

CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在MDA-MB-231及MCF7細(xì)胞中，CDHR2 高表達(dá)組在第3、4、5 天的增殖活力顯著降低（Plt;0.01，圖7）。相較于對(duì)照組，CDHR2過表達(dá)組MDA-MB-231 及MCF7細(xì)胞中的S期細(xì)胞比例顯著減少（Plt;0.01，圖8）。

2.5 過表達(dá)CDHR2抑制乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，過表達(dá)CDHR2基因能使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，且過表CDHR2后乳腺癌細(xì)胞的S期細(xì)胞比例明顯減少，最終改變?nèi)橄侔┘?xì)胞增殖能力，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01，圖9）。

2.6 CDHR2 通過PI3K/Akt 通路抑制乳腺癌細(xì)胞生長和細(xì)胞周期

Western blotting檢測(cè)PI3K/Akt通路和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示：相較于對(duì)照組，過表達(dá)CDHR2 可以抑制p-PI3K和p-Akt蛋白的表達(dá)，同時(shí)對(duì)周期蛋白Cyclin D1的表達(dá)也具有抑制作用（Plt;0.001，圖10）。

2.7 CDHR2相互結(jié)合作用蛋白

STRING在線工具對(duì)CDHR2 可能存在的相互結(jié)合作用蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖11），顯示CDHR2 與CDC42、CDHR5 基因存在相關(guān)性（r=0.115，0.328）。

3 討論

乳腺癌是全世界女性最常見的癌癥類型［10］，發(fā)病率呈逐年上升，且呈年輕化發(fā)展趨勢(shì)，其病死率在女性惡性腫瘤患者中僅次于肺癌。乳腺癌根據(jù)激素受體進(jìn)行分子分型總共4種。第1種類型是luminal A類型，表示雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR）為陽性，而HER-2受體表達(dá)為陰性。第2種是luminal B型，即ER和PR均為陽性，而HER-2 也呈陽性。第3 種是HER-2 過表達(dá)型，ER 陰性，PR 陰性和HER-2 陽性。第四種類型是ER，PR 和HER-2 均為陰性，也稱為三陰型乳腺癌［11］。隨著腫瘤手術(shù)、放化療、分子治療等進(jìn)展［12， 13］，乳腺癌總體預(yù)后有了較好的改善，但其復(fù)雜的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

鈣粘蛋白相關(guān)家族成員2（CDHR2）也被命名為PCDH24屬于原鈣粘蛋白家族，PCDH 家族在鈣依賴性細(xì)胞粘著中扮演重要角色［5， 14］。在許多人類癌癥（包括乳腺癌，白血病，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，胃癌，結(jié)直腸癌，食道癌和輻射誘發(fā)的肺癌）中已經(jīng)報(bào)道了一些 PCDH 家族成員（ 例如 PCDH8，PCDH9，PCDH10，PCDH17 和PCDH20）的表達(dá)喪失，表明PCDH可以作為人類癌癥的腫瘤抑制劑［15-17］。研究表明，CDHR2在上皮細(xì)胞側(cè)壁的接觸抑制過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，并可能導(dǎo)致接觸抑制起到抑癌作用。CDHR2是一種與多種癌癥相關(guān)的蛋白，其在多種癌癥中發(fā)揮著重要的抑制或促進(jìn)作用。例如CDHR2在肝癌和結(jié)腸癌中低表達(dá)，在肝癌中通過AKT失活以及COX-2表達(dá)下調(diào)來實(shí)現(xiàn)保護(hù)作用［18］，在HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)升高誘導(dǎo)接觸抑制，從而完全消除體內(nèi)腫瘤的形成［19］。一致的是，CDHR2可以抑制β-連環(huán)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制和腫瘤生長停滯在結(jié)直腸癌［20］。然而，CDHR2在乳腺癌癌中的作用及其機(jī)制還知之甚少。

本研究首先通過TCGA數(shù)據(jù)集對(duì)CDHR2 表達(dá)進(jìn)行分析，由于CDHR2相對(duì)表達(dá)量較低，因此在乳腺癌及癌旁中CDHR2表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，查閱已有文獻(xiàn)報(bào)道，CDHR2 在乳腺癌中亦可能作為抑癌基因起效［15-17］。進(jìn)一步使用Kaplan-Meier Plotter 在線數(shù)據(jù)分析CDHR2 在三陰型、luminal A型、luminal B型、Her2過表達(dá)型乳腺癌患者中的生存預(yù)后，我們發(fā)現(xiàn)在4種乳腺癌類型中趨勢(shì)均為CDHR2高表達(dá)患者預(yù)后更好，但在Her2過表達(dá)型乳腺癌患者的生存曲線尚不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與Her2 過表達(dá)型乳腺癌患者樣本數(shù)量有關(guān)，亦或者CDHR2在三陰型乳腺癌或luminal型乳腺癌中發(fā)揮作用更加顯著，但總的來說CDHR2高表達(dá)有利于乳腺癌患者的生存預(yù)后。但總的來說CDHR2 高表達(dá)有利于乳腺癌患者的生存預(yù)后。于是我們利用免疫組化、Western blotting 和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了CDHR2在乳腺癌組織及細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，在表達(dá)較低的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 和MCF7 中成功過表達(dá)CDHR2，通過CCK-8 實(shí)驗(yàn)和EdU 實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)CDHR2能抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖能力，進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CDHR2 能夠使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，從而抑制乳腺癌細(xì)胞生長。這提示CDHR2在乳腺癌中是一個(gè)抑癌基因。

PI3K/Akt 是調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、遷移、生存及凋亡的重要途徑，該通路的異常激活可導(dǎo)致多種腫瘤細(xì)胞的存活和增殖［21-23］。CCND1，即G1/S特異性細(xì)胞周期蛋白，調(diào)節(jié)從G1 期向S期過渡的細(xì)胞周期過程［24］。越來越多的研究表明，許多基因通過調(diào)節(jié) CCND1 影響腫瘤細(xì)胞的活力和遷移［25］。有研究表明CDCA2 通過激活 PI3K/AKT途徑調(diào)節(jié) CCND1 的表達(dá)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖［26］。另外，有研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因在多種疾病中可以作用于PI3K/AKT信號(hào)通路進(jìn)而影響細(xì)胞周期［27］。本研究通過Western blotting 發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CDHR2 可以抑制p-PI3K和p-Akt 蛋白的表達(dá)，下調(diào)蛋白Cyclin D1的表達(dá)，據(jù)此，我們提出假說：CDHR2 可能通過調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)途徑，下調(diào) CyclinD1的表達(dá)，進(jìn)而影響乳腺癌細(xì)胞的增殖和周期。

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用在細(xì)胞的 DNA復(fù)制，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)變異，分子運(yùn)輸以及識(shí)別和修飾外來分子等方面發(fā)揮著重要作用［28-30］。我們通過String在線分析CDHR2 的候選相互作用蛋白。后續(xù)研究中我們可以著眼于蛋白間相互作用，進(jìn)一步探究細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的分子基礎(chǔ)CDHR2調(diào)控細(xì)胞周期的具體機(jī)制。

綜合而言，本研究證實(shí)了CDHR2在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平及重要作用，有望為乳腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Siegel RL， Miller KD， Wagle NS， et al. Cancer statistics， 2023[J].CA Cancer J Clin， 2023， 73（1）： 17-48.

[2] Kawiak A. Molecular research and treatment of breast cancer[J]. IntJ Mol Sci， 2022， 23（17）： 9617.

[3] An JS， Peng C， Tang HL， et al. New advances in the research ofresistance to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer[J]. Int JMol Sci， 2021， 22（17）： 9644.

[4] Barzaman K， Karami J， Zarei Z， et al. Breast cancer： biology，biomarkers， and treatments[J]. Int Immunopharmacol， 2020， 84：106535.

[5] Pancho A， Aerts T， Mitsogiannis MD， et al. Protocadherins at thecrossroad of signaling pathways[J]. Front Mol Neurosci， 2020，13： 117.

[6] Yu JS， Koujak S， Nagase S， et al. PCDH8， the human homolog ofPAPC， is a candidate tumor suppressor of breast cancer[J].Oncogene， 2008， 27（34）： 4657-65.

[7] Harada H， Miyamoto K， Yamashita Y， et al. Prognostic signature ofprotocadherin 10 methylation in curatively resected pathologicalstage I non-small-cell lung cancer[J]. Cancer Med， 2015， 4（10）：1536-46.

[8] Haruki S， Imoto I， Kozaki KI， et al. Frequent silencing ofprotocadherin 17， a candidate tumour suppressor for esophagealsquamous cell carcinoma[J]. Carcinogenesis， 2010， 31（6）： 1027-36.

[9] Fang S， Huang SF， Cao J， et al. Silencing of PCDH10 inhepatocellular carcinoma via de novo DNA methylation independentof HBV infection or HBX expression[J]. Clin Exp Med， 2013， 13（2）： 127-34.

[10]Lei SY， Zheng RS， Zhang SW， et al. Global patterns of breast cancerincidence and mortality： a population-based cancer registry dataanalysis from 2000 to 2020[J]. Cancer Commun， 2021， 41（11）：1183-94.

[11] Chodosh LA. Breast cancer： current state and future promise[J].Breast Cancer Res， 2011， 13（6）： 113.

[12]McDonald ES， Clark AS， Tchou J， et al. Clinical diagnosis andmanagement of breast cancer[J]. J Nucl Med， 2016， 57（Suppl 1）：9S-16S.

[13]Griguolo G， Pascual T， Dieci MV， et al. Interaction of host immunitywith HER2-targeted treatment and tumor heterogeneity in HER2-positive breast cancer[J]. J Immunother Cancer， 2019， 7（1）： 90.

[14]Vega-Benedetti AF， Loi E， Moi L， et al. Clustered protocadherinsmethylation alterations in cancer[J]. Clin Epigenetics， 2019， 11（1）： 100.

[15] Imoto I， Izumi H， Yokoi S， et al. Frequent silencing of the candidatetumor suppressor PCDH20 by epigenetic mechanism in non-smallcelllung cancers[J]. Cancer Res， 2006， 66（9）： 4617-26.

[16]Wang CL， Yu GZ， Liu JC， et al. Downregulation of PCDH9 predictsprognosis for patients with glioma[J]. J Clin Neurosci， 2012， 19（4）：541-5.

[17]Zhen YL， Pavez M， Li XY. The role of Pcdh10 in neurologicaldisease and cancer[J]. J Cancer Res Clin Oncol， 2023， 149（10）：8153-64.

[18]Xia ZY， Huang MJ， Zhu QQ， et al. Cadherin related family member2 acts As A tumor suppressor by inactivating AKT in humanhepatocellular carcinoma[J]. J Cancer， 2019， 10（4）： 864-73.

[19]Okazaki N， Takahashi N， Kojima SI， et al. Protocadherin LKC， anew candidate for a tumor suppressor of colon and liver cancers， itsassociation with contact inhibition of cell proliferation[J].Carcinogenesis， 2002， 23（7）： 1139-48.

[20]Ose R， Yanagawa T， Ikeda S， et al. PCDH24-induced contactinhibition involves downregulation of beta-catenin signaling[J].Mol Oncol， 2009， 3（1）： 54-66.

[21]Luo J， Yao JF， Deng XF， et al. 14， 15-EET induces breast cancer cellEMT and cisplatin resistance by up-regulating integrin αvβ3 andactivating FAK/PI3K/AKT signaling[J]. J Exp Clin Cancer Res，2018， 37（1）： 23.

[22]Spangle JM， Dreijerink KM， Groner AC， et al. PI3K/AKT signalingregulates H3K4 methylation in breast cancer[J]. Cell Rep， 2016， 15（12）： 2692-704.

[23]Xu JC， Chen TY， Liao LT， et al. NETO2 promotes esophageal cancerprogression by inducing proliferation and metastasis via PI3K/AKTand ERK pathway[J]. Int J Biol Sci， 2021， 17（1）： 259-70.

[24]Wang Q， He GP， Hou MM， et al. Cell cycle regulation by alternativepolyadenylation of CCND1[J]. Sci Rep， 2018， 8（1）： 6824.

[25]Hermosilla VE， Salgado G， Riffo E， et al. SALL2 represses cyclinsD1 and E1 expression and restrains G1/S cell cycle transition andcancer-related phenotypes[J]. Mol Oncol， 2018， 12（7）： 1026-46.

[26]Feng YF， Qian WW， Zhang Y， et al. CDCA2 promotes theproliferation of colorectal cancer cells by activating the AKT/CCND1 pathway in vitro and in vivo[J]. BMC Cancer， 2019， 19（1）： 576.

[27]Xie ZZ， Li W， Ai JG， et al. C2orf40 inhibits metastasis and regulateschemo-resistance and radio-resistance of nasopharyngeal carcinomacells by influencing cell cycle and activating the PI3K/AKT/mTORsignaling pathway[J]. J Transl Med， 2022， 20（1）： 264.

[28]Zhong Y， Yang LT， Xiong F， et al. Long non-coding RNA AFAP1-AS1 accelerates lung cancer cells migration and invasion byinteracting with SNIP1 to upregulate c-Myc[J]. Signal TransductTarget Ther， 2021， 6（1）： 240.

[29]Kar G， Gursoy A， Keskin O. Human cancer protein-proteininteraction network： a structural perspective[J]. PLoS Comput Biol，2009， 5（12）： e1000601.

[30]Cho HJ， Hwang YS， Yoon J， et al. EphrinB1 promotes cancer cellmigration and invasion through the interaction with RhoGDI1[J].Oncogene， 2018， 37（7）： 861-72.

（編輯：吳錦雅）

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