摘要：目的 探討龍葵活性成分澳洲茄堿對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞PC9 增殖、凋亡的影響。方法 體外培養(yǎng)PC9 細(xì)胞，設(shè)對照組（0 μmol/L）及澳洲茄堿不同劑量組（0、2、5、10、15、20、25 μmol/L），CCK-8 試劑盒檢測澳洲茄堿對PC9 細(xì)胞的增殖抑制作用；TMRE 檢測線粒膜電位；caspase3/7 活性試劑盒聯(lián)合GreenNuc ? Caspase-3/Annexin V-mCherry 染色檢測caspase-3 活性；Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測細(xì)胞凋亡率；給藥處理或者使用PTEN抑制劑后，Western blot 檢測細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)量。結(jié)果 與對照組相比，經(jīng)澳洲茄堿干預(yù)24、48、72 h后，PC9細(xì)胞的活力均明顯降低（Plt;0.05）；經(jīng)澳洲茄堿干預(yù)24 h后，細(xì)胞線粒體膜電位明顯降低，而細(xì)胞凋亡比例明顯升高（Plt;0.05）；caspase-3/7活力、活細(xì)胞Caspase-3活性及cleaved caspase-3蛋白表達(dá)均顯著升高（Plt;0.01）；PI3K和Akt磷酸化水平降低（Plt;0.05）；而PTEN、Bax蛋白表達(dá)上調(diào)（Plt;0.05）；抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達(dá)下調(diào)（Plt;0.05）。結(jié)論 澳洲茄堿可通過調(diào)控Bcl-2/Bax/caspase-3通路及其上游蛋白活性而抑制PC9細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。

關(guān)鍵詞：澳洲茄堿；肺癌；Bcl-2/Bax/caspase-3 通路；同源性磷酸酶-張力蛋白；細(xì)胞凋亡

全球肺癌的新發(fā)病率及死亡率高居惡性腫瘤榜首［1， 2］。多數(shù)肺癌患者確診時(shí)已屬中晚期，癌細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)根除治療的機(jī)會，而非手術(shù)治療（放療、化療、靶向治療、免疫治療）普遍存在其病理類型的局限性，如放療/化療抵抗、耐藥、毒副作用明顯等。因此，我們需要探索促進(jìn)肺癌發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移的非特異性分子機(jī)制，確定新的臨床治療靶點(diǎn)，提高治療中晚期肺癌患者的治療效率。

龍葵是重要的抗癌藥物，別名苦葵、山辣椒、天茄子等，在我國各地均有分布。文獻(xiàn)報(bào)道表明，龍葵具有較廣泛、效果較明顯的抑制腫瘤生長的作用，龍葵主要抑瘤活性成分有生物堿、多糖、糖蛋白等，龍葵所含的這三類物質(zhì)在抗腫瘤方面都有較多的研究，其中較有前景的是其生物堿。澳洲茄堿（SS，C45H73O16N）是龍葵的主要活性成分之一，屬于甾體生物堿中的膽甾烷衍生物［3， 4］，其水解后分解出苷元澳洲茄胺，進(jìn)而發(fā)揮化學(xué)活性，具有明確的抗腫瘤作用［5， 6］。既往研究表明［7-14］，澳洲茄堿對不同腫瘤細(xì)胞系，如小鼠黑色素瘤（B16F10），人結(jié)腸癌（HT29），人乳腺癌（MCF-7），人宮頸腺癌（HeLa），人肝細(xì)胞肝癌（HepG2）和人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（MO59J，U343和U251）、人非小細(xì)胞肺癌（A549、Calu-1）具有明顯的抗增殖作用。然而，澳洲茄堿在肺癌治療中的效果及其分子機(jī)制研究仍有欠缺。

PI3K/Akt 通路的持續(xù)活化，在肺癌及其他腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡中，起到了至關(guān)重要的作用［15］。PTEN是一種抑癌基因，負(fù)反饋調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路活性［16， 17］。caspase-3 是細(xì)胞凋亡途徑的關(guān)鍵執(zhí)行者，cleavedcaspase-3 是其活化狀態(tài)，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl-2 和Bax是Bcl-2蛋白家族的兩個(gè)重要成員，在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。Bcl-2 是一種抗凋亡蛋白，抑制caspase-3 活化；而Bax是一種促凋亡蛋白，促進(jìn)caspase-3活化［18， 19］。最近研究發(fā)現(xiàn)［13］，澳洲茄堿可能通過抑制caspase-3 通路，進(jìn)而誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，但具體分子機(jī)制尚未做深入研究。由此，本實(shí)驗(yàn)擬從PI3K/Akt信號通路及其上下游因子出發(fā)，探討澳洲茄堿對肺癌PC9細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞

人肺腺癌細(xì)胞PC9由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院李龍妹博士贈送。PC9，貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗（100 μg/mL 鏈霉素、100 U/L青霉素）的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2。當(dāng)細(xì)胞匯合度為80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代或鋪板。

1.1.2 藥物

澳洲茄堿（純度≥98.98%，上海陶素生化科技，分子式為C45H73NO16，相對分子質(zhì)量為884.07），凍干粉狀態(tài)下-20 ℃冰箱保存。藥物儲存液制備：采用細(xì)胞級DMSO 將澳洲茄堿粉末10 mg 溶解，制備成50 mmol/L儲存液，分裝后-20℃保存?zhèn)溆茫瑢?shí)驗(yàn)時(shí)采用完全培養(yǎng)基將其稀釋為實(shí)驗(yàn)所需的藥物濃度。

1.1.3 主要試劑

DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶（Gibco）；磷酸鹽緩沖液（PBS，HyClone）；預(yù)染蛋白Marker、BCA蛋白檢測試劑盒（Thermo）；線粒體膜電位檢測試劑盒（TMRE）、GreenNuc?活細(xì)胞caspase-3活性檢測試劑盒（碧云天）；caspase-3/7 活力檢測試劑盒（Promega）；CCK8 試劑盒（翌圣）；Annexin V-FITC/PI（聯(lián)科生物）；cleaved caspase-3、PTEN、PI3Kp85、p-PI3Kp85、Akt、p-Akt、Bcl2、Bax、GAPDH抗體、蛋白上樣緩沖液、總蛋白裂解液（CST）；發(fā)光液、PVDF 膜（Millipore）；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑（Roche）。

1.1.4 主要儀器

生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Sanyo）；全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Inno-Aliance）；常溫離心機(jī)（京立離心機(jī)）；多功能酶標(biāo)儀（BioTek）；冷凍離心機(jī)（Eppendorf）；流式細(xì)胞儀（BD）；高靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀、垂直電泳系統(tǒng)、半干轉(zhuǎn)印槽轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad）；全自動倒置熒光顯微分析系統(tǒng)（Nikon）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CCK8 法檢測澳洲茄堿對PC9 細(xì)胞活力的影響

收集處于對數(shù)生長期的PC9細(xì)胞，按5×103/孔的標(biāo)準(zhǔn)接種于96孔細(xì)胞板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，分組進(jìn)行給藥處理，SS濃度為：0、2、5、10、15、20、25 μmol/L，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24、48 和72 h。藥物作用后，吸去舊培養(yǎng)液，加入含10%（體積分?jǐn)?shù)）CCK8溶液的新培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)箱避光孵育2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測各孔吸光值（A），取各復(fù)孔平均值，按照以下公式計(jì)算細(xì)胞活力，繪制PC9細(xì)胞在不同濃度SS作用24、48、72 h后的生長曲線并計(jì)算出IC50。

細(xì)胞活率=（A加藥組- A空白組／A對照組- A空白組）× 100%

1.2.2 線粒體膜電位檢測

取適量TMRE （×1000），按照每1 μL TMRE（×1000）加入1 mL 檢測緩沖液的比例稀釋TMRE，混勻后即為TMRE染色工作液。分別收集對照組和經(jīng)15 μmol/L 澳洲茄堿作用24 h的細(xì)胞，1000 r/min離心3 min，PBS洗滌1次后加入1 mL TMRE染色工作液，混勻后于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，棄上清，用預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌2次，加入1 mL預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液，置于熒光顯微鏡下觀察橘紅色熒光強(qiáng)度，并拍照保存。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況

收集對數(shù)生長期細(xì)胞，按細(xì)胞濃度2×105/孔接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁，分為對照組（不加澳洲茄堿）和給藥組（澳洲茄堿濃度為15 μmol/L），繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h。藥物處理完畢后，收集細(xì)胞并根據(jù)細(xì)胞凋亡試劑盒（聯(lián)科生物）說明書對各組細(xì)胞進(jìn)行PI染色，繼而使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.4 Caspase-3/7活力檢測

按細(xì)胞濃度2×104/0.1 mL/孔接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后，分為對照組（澳洲茄堿濃度為0 μmol/L ）和給藥組（澳洲茄堿濃度為10、15、20 μmol/L組），常規(guī)培養(yǎng)24 h，加入Apo-ONE caspase-3/7混合液100 μL，常溫避光孵育1 h，采用多功能酶標(biāo)儀檢測，記錄并計(jì)算活力。

1.2.5 活細(xì)胞caspase-3 活性的原位熒光顯微鏡檢測

按細(xì)胞濃度1×105/孔接種于12 孔板，貼壁后，對照組和經(jīng)15 μmol/L 澳洲茄堿作用24 h 的細(xì)胞，每孔先加入194 μL Annexin V-mCherry Binding Buffer，再加入5 μL Annexin V-mCherry和1 μL GreenNuc?Caspase-3Substrate（ 1 mmol/L），輕輕混勻，室溫避光孵育30 min，隨即在熒光顯微鏡下觀察，拍照并處理圖像。

1.2.6 Western blotting法檢測澳洲茄堿對PC9細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

取對數(shù)生長期的PC9 細(xì)胞以2×105/孔接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，分組給藥，藥物處理24 h后收集細(xì)胞，冰上操作，加入含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的裂解液提取總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度，加入上樣緩沖液并混勻，加熱變性，-80 ℃保存。每組樣品取25 μg總蛋白上樣，80 V電泳20 min后110 V電泳50 min，20 V半干轉(zhuǎn)45 min，用5%脫脂牛奶封閉1 h，洗去封閉液，加入對應(yīng)蛋白一抗，4 ℃孵育過夜，第2天以TBST洗滌3次后，加入二抗室溫孵育1 h，顯影成像。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3 次，采用SPSS 23.0進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，當(dāng)滿足正態(tài)性及方差齊性時(shí)，采用單因素方差分析；若不滿足正態(tài)性或方差齊性時(shí)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。當(dāng)Plt;0.05 時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 澳洲茄堿對PC9細(xì)胞增殖的抑制作用

CCK8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，澳洲茄堿組PC9細(xì)胞活力明顯下降并呈劑量和時(shí)間依賴性：澳洲茄堿作用于細(xì)胞24 h后，從給藥濃度10 μmol/L起，細(xì)胞活力的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），且隨濃度的增大而逐漸降低；而澳洲茄堿干預(yù)細(xì)胞48 h 及72 h 后，從給藥濃度為2 μmol/L起，細(xì)胞活力的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），且隨濃度的增大而逐漸降低（圖1）。經(jīng)計(jì)算，澳洲茄堿對PC9 細(xì)胞24、48、72 h 的IC50 分別為21.72、14.60、11.90 μmol/L。

2.2 澳洲茄堿對PC9細(xì)胞線粒體膜電位的影響

熒光顯微鏡下，與對照組相比，經(jīng)澳洲茄堿（15 μmol/L）作用24 h后，澳洲茄堿組細(xì)胞橘紅色熒光強(qiáng)度明顯減弱，幾乎完全消失（圖2）。

2.3 澳洲茄堿對PC9細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，澳洲茄堿各組（10、15、20 μmol/L）細(xì)胞早期凋亡比率均增加，且隨著藥物濃度增加而升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05，圖3）。

2.4 澳洲茄堿對PC9 細(xì)胞cleaved caspase-3 蛋白、caspase-3/7活力和caspase-3活性的影響

Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，澳洲茄堿各組（5、10、15、20 和25 μmol/L）中PC9 細(xì)胞的cleaved caspase-3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），且隨著給藥濃度的增大，cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量呈明顯上調(diào)趨勢（圖4A、B）。caspase-3/7活性試劑盒檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，澳洲茄堿各組（10、15、20 μmol/L）中PC9細(xì)胞的caspase-3/7活力明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），且隨著藥物濃度增大而逐漸降低（圖4C）。同時(shí)GreenNuc ? caspase-3/Annexin V-mCherry雙染結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞不會被GreenNuc?和Annexin V-mCherry所染色。澳洲茄堿處理24 h后，PC9細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性高的凋亡細(xì)胞核呈明亮的綠色熒光，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜顯示紅色熒光（圖5）。

2.5 澳洲茄堿對PC9細(xì)胞中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平的影響

Western blotting結(jié)果顯示，與對照組相比，澳洲茄堿15、20和25 μmol/L組中PC9細(xì)胞的Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，而澳洲茄堿20和25 μmol/L組細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；且隨著給藥濃度的增大，Bcl-2 蛋白表達(dá)量呈明顯下降趨勢，Bax蛋白表達(dá)量呈明顯上升趨勢（圖6）。

2.6 澳洲茄堿對PC9細(xì)胞中PI3K、Akt蛋白磷酸化水平的影響

澳洲茄堿作用4 h 可抑制PI3K 和Akt 的磷酸化（p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)減低），且隨著時(shí)間的推移抑制作用越明顯；與空白對照組相比，澳洲茄堿作用細(xì)胞12、24 h后，細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt 的表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05，圖7）。

2.7 澳洲茄堿對PC9 細(xì)胞中PTEN 蛋白表達(dá)水平的影響

藥物作用24 h后，澳洲茄堿15、20和25 μmol/L組中PC9細(xì)胞的PTEN蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），且隨給藥液濃度的增大，PTEN蛋白表達(dá)逐漸升高；這種上調(diào)趨勢可被PTEN 蛋白抑制劑SF1670逆轉(zhuǎn)（圖8）。

3 討論

肺癌仍是我國乃至世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)性死亡的首要原因［1，2］，尋找行之有效的治療手段及治療靶點(diǎn)是非常必要的。澳洲茄堿已被證實(shí)可以通過線粒體介導(dǎo)的凋亡等不同方式對不同腫瘤類型具有抑制增殖、促進(jìn)凋亡的作用［4-14，19-21］。在本研究中，以人肺腺癌細(xì)胞系PC9作為研究對象，澳洲茄堿作為作為治療藥物，探索了澳洲茄堿在肺癌治療中的潛力及相關(guān)機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，澳洲茄堿顯著抑制PC9細(xì)胞的增殖，且呈劑量依賴性及時(shí)間依賴性，對PC9細(xì)胞24、48、72 h的IC50分別為21.72、14.60、11.90 μmol/L；且與對照組相比，澳洲茄堿組細(xì)胞線粒體膜電位水平顯著降低，細(xì)胞凋亡比例顯著升高。以上結(jié)果與既往研究結(jié)果一致［13， 14， 22］，進(jìn)一步驗(yàn)證了澳洲茄堿可以通過線粒體介導(dǎo)的凋亡促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，抑制其增殖的結(jié)論。

Bcl-2/Bax/caspase-3 信號通路與細(xì)胞的凋亡過程密切相關(guān)［23， 24］在癌細(xì)胞中，高表達(dá)的Bcl-2 與Bax 形成異源二聚體，抑制下游caspase-3的激活，抵抗細(xì)胞凋亡的發(fā)生［25］。李龍妹等［13］研究顯示，澳洲茄堿可明顯抑制肺腺癌細(xì)胞A549 中p65、Bcl-2 蛋白表達(dá)，并增強(qiáng)Bik、Bak 蛋白表達(dá)，降低pro caspase-3 水平，從而推測澳洲茄堿通過激活caspase-3 通路誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡。此外，Zeng等［14］研究顯示，澳洲茄堿引起肺腺癌細(xì)胞A549和Calu-1 中鐵死亡和線粒體氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，澳洲茄堿作用于PC9 細(xì)胞后，Bax 和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，且caspase-3/7活力及caspase-3活性同樣明顯升高，而Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，且呈現(xiàn)濃度依賴性，對李龍妹等和Zeng等關(guān)于澳洲茄堿通過激活caspase-3通路或線粒體相關(guān)途徑誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的結(jié)論進(jìn)行了細(xì)胞類型上的驗(yàn)證和補(bǔ)充，增加了澳洲茄堿抑制肺癌的普遍性。因此我們推測澳洲茄堿對PC9細(xì)胞的增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)可能通過調(diào)控Bcl-2/Bax/caspase-3通路發(fā)揮抑癌作用。

多項(xiàng)研究表明PI3K/Akt/Bax信號通路的調(diào)控是多種藥物抑制肺癌細(xì)胞增殖生長的關(guān)鍵［26-29］。Akt 易被PI3K的活化產(chǎn)物PIP3 激活，在蘇氨酸308 位點(diǎn)或絲氨酸473 位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，直接抑制促凋亡蛋白Bax 表達(dá)，抵抗細(xì)胞凋亡進(jìn)程［15］。我們推測，澳洲茄堿對PC9細(xì)胞中Bax 的上調(diào)與PI3K/Akt 通路活性有關(guān)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，澳洲茄堿可以顯著抑制p-PI3K、p-Akt蛋白磷酸化，呈時(shí)間依賴性，與我們的預(yù)期相符。PTEN是PI3K/Akt通路中重要的負(fù)調(diào)控因子，可下調(diào)PI3K/Akt通路活性而抑制腫瘤細(xì)胞生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［16］。本研究結(jié)果顯示，澳洲茄堿劑量依賴性激活PTEN蛋白表達(dá)，但這種作用可以被PTEN抑制劑SF1670抵消。綜上，澳洲茄堿可能通過上調(diào)抑癌基因PTEN的蛋白表達(dá)，從而負(fù)調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，澳洲茄堿確切可以抑制肺腺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡。具體可能通過上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)，抑制PI3K/Akt 信號通路的活化，解除Bcl-2 與Bax 的結(jié)合，激活caspase-3，進(jìn)而誘導(dǎo)PC9細(xì)胞凋亡，為中草藥龍葵治療肺癌的機(jī)制研究中提供了新的思路。本研究尚存在著一定不足：本實(shí)驗(yàn)僅進(jìn)行了細(xì)胞層面的實(shí)驗(yàn)，未進(jìn)行動物層面的研究，下一步將構(gòu)建實(shí)驗(yàn)動物模型，進(jìn)一步確認(rèn)澳洲茄堿對肺癌的生長抑制作用。此外，在文獻(xiàn)中已明確澳洲茄堿可通過不同途徑抑制肺癌細(xì)胞A549和Calu-1（含H-ras癌基因），而本研究證實(shí)澳洲茄堿也可抑制肺癌細(xì)胞PC9（EGFR突變型），可見澳洲茄堿針對肺癌的抑制效應(yīng)具有普遍性。接下來我們將研究澳洲茄堿對肺癌細(xì)胞EGFR-TKI藥物的原發(fā)性及獲得性耐藥是否具有增效減毒作用。

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（編輯：經(jīng) 媛）

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（82104456）；中國博士后基金資助項(xiàng)目（2020M672745）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（202102020205）；廣東省中醫(yī)藥局中醫(yī)藥科研項(xiàng)目（20244026）