摘要：目的 探究人源性細胞膜穿透肽hPP10攜帶人源性抗氧化蛋白Cu，Zn-SOD的穿膜效應(yīng)并觀察其抗氧化、抗炎功效。方法利用RT-PCR技術(shù)擴增人源性SOD基因片段、酶切連接法構(gòu)建重組質(zhì)粒pET15b-Cu，Zn-SOD，pET15b-hPP10-Cu，Zn-SOD；利用鎳柱親和層析法、分子篩方法純化Cu，Zn-SOD、hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白并利用Western blotting法鑒定其正確性；利用免疫熒光法、熒光共定位實驗、Western blotting法鑒定hPP10-Cu，Zn-SOD在細胞中的穿膜效應(yīng)；利用Western blotting法鑒定hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白穿膜時間梯度和濃度梯度效應(yīng)；利用SOD酶活性測定試劑盒檢測hPP10-Cu，Zn-SOD穿膜后的SOD酶活性；利用MTT法檢測hPP10對細胞活性的影響。利用H2O2建立HEK293氧化應(yīng)激細胞模型，通過流式細胞分析術(shù)（FCM）分析hPP10-Cu，Zn-SOD穿膜后細胞凋亡情況；并RT-qPCR分析hPP10-Cu，Zn-SOD穿膜后凋亡相關(guān)因子的表達情況；通過ROS檢測分析hPP10-Cu，Zn-SOD穿膜后抗氧化能力。TPA誘導(dǎo)建立小鼠耳部炎癥模型（5只/組，共4組），然后RT-qPCR分析hPP10-Cu，Zn-SOD穿膜后，NFκB，IL-1β、IL-6、TNFα因子的轉(zhuǎn)錄情況；Western blotting檢測NFκB p65、p-NFκB p65、IL-1β、TNFα基因的表達；免疫組化分析炎性因子p-NFκB p65、TNFα基因的表達。結(jié)果 成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET15b-Cu，Zn-SOD，pET15b-hPP10-Cu，Zn-SOD，并獲得Cu，Zn-SOD蛋白和hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白；免疫熒光試驗結(jié)果表明5 μmol/L濃度的hPP10-Cu，Zn-SOD轉(zhuǎn)導(dǎo)HEK293細胞具有明顯的穿膜效應(yīng)；熒光共定位實驗顯示融合蛋白hPP10-Cu，Zn-SOD入胞后定位在細胞膜內(nèi)，部分蛋白定位在細胞核內(nèi)；Western blotting實驗結(jié)果表明hPP10-Cu，Zn-SOD轉(zhuǎn)導(dǎo)Hela（Plt;0.05），HEK293（Plt;0.01）細胞具有濃度依賴性，細胞內(nèi)hPP10-Cu，Zn-SOD存在可持續(xù)24 h；5 μmol/L的hPP10-Cu，Zn-SOD轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞具有較好的抗氧化活性（Plt;0.01）；MTT結(jié)果顯示高達10 μmol/L濃度的hPP10-Cu，Zn-SOD對于細胞活力的影響小。在氧化應(yīng)激模型中，F(xiàn)CM結(jié)果顯示hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白孵育細胞降低了細胞的早期凋亡（Plt;0.01）和晚期凋亡（Plt;0.05）；RT-qPCR結(jié)果顯示hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白孵育細胞使Bcl2、Mcl1、Deptor 等抗凋亡因子升高（Plt;0.05），降低了Bad、P21、P27 等促凋亡因子的表達（Plt;0.05）；ROS 結(jié)果顯示hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白孵育細胞顯著降低了細胞內(nèi)的活性氧含量（Plt;0.01）。在炎癥模型中，hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白可顯著降低IL-1β、IL-6、TNFα因子的轉(zhuǎn)錄（Plt;0.05）；p-NFκB p65、IL-1β及TNFα的表達都呈現(xiàn)了抑制作用（Plt;0.05）；hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白處理組較Cu，Zn-SOD蛋白處理組，降低了炎性因子p-NFκB p65及TNFα基因的表達（Plt;0.05）。結(jié)論 融合蛋白hPP10-Cu，Zn-SOD具有明顯的穿膜入胞、抗氧化、抗炎功效，且對細胞毒副作用很小。這些結(jié)果為hPP10作為新的遞送載體奠定基礎(chǔ)，也為hPP10-Cu，Zn-SOD應(yīng)用于護膚品等提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：人源性細胞膜穿透肽hPP10；銅鋅超氧化物歧化酶Cu，Zn-SOD；抗氧化；抗炎；酶活力測定

細胞有氧代謝產(chǎn)生的活性氧，是細胞氧化損傷的重要原因，氧化損傷被認為是衰老甚至疾病發(fā)生的特征之一。超氧化物歧化酶（SOD）是體內(nèi)重要的抗氧化酶，能有效地清除氧自由基，解除氧化造成的衰老甚至疾病，具有延緩衰老、抗炎、抗輻射、抗腫瘤等功效［1， 2］。根據(jù)所含金屬離子不同分為：Cu，Zn-SOD、Mn-SOD 和Fe-SOD［3］。其中，Cu，Zn-SOD是人體內(nèi)重要的抗氧化酶，用以維系細胞內(nèi)活性氧的穩(wěn)態(tài)［4］，避免過多的自由基對體內(nèi)生物大分子造成損害［5］，因其在細胞內(nèi)含量最多，活性最穩(wěn)定而受到廣泛關(guān)注［6］。但是，Cu，Zn-SOD是生物大分子，必須進入細胞內(nèi)才能發(fā)揮功效［7， 8］。

自1988 年Green 和Frankel 等［9， 10］首次發(fā)現(xiàn)了TAT——人免疫缺陷病毒（HIV）的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白可以穿透細胞膜、核膜進入細胞核，掀起了對于細胞膜穿透肽（CPP）的研究熱潮。CPPs 不依賴受體［11］，多組織普適性［12］使其很快被應(yīng)用到靶向治療和導(dǎo)入技術(shù)研究中來，其傳遞的分子包括核酸、治療肽、小分子抑制劑、抗癌劑［13-15］等，穿膜肽可融合核酸酶在特定位點切割基因組DNA并誘導(dǎo)修復(fù)和重組［16］。為推動基因工程藥物發(fā)展，建立高效、安全的蛋白分子導(dǎo)入技術(shù)提供了非常有價值的載體工具。國內(nèi)外學(xué)者探索了將穿膜肽融合到Cu，Zn-SOD，制備TAT-Cu，Zn-SOD［17］，LMWP-Cu，Zn-SOD［18］，PEP1-Cu，Zn-SOD［19-21］，PTD4-Cu，Zn-SOD［22， 23］等融合蛋白，表現(xiàn)出抗氧化、抗輻射等功效，緩解了氧化應(yīng)激模型下細胞的炎癥反應(yīng)及皮膚細胞老化現(xiàn)象。但是病毒源的穿膜肽仍存在潛在的細胞毒性，目前尚未有人源性穿膜肽融合Cu，Zn-SOD，降低氧化損傷的報道。

課題組從KDM4A蛋白的c端片段中發(fā)現(xiàn)了一種新的人源性穿膜肽（命名為hPP10）。前期研究［24-26］表明，hPP10-FITC可以被Caski細胞攝取定位于細胞質(zhì)和細胞核，hPP10-GFP融合蛋白可以穿透B16細胞膜定位于細胞質(zhì)中，且穿膜效應(yīng)高于TAT組；hPP10-Apoptin 融合蛋白有效導(dǎo)入細胞，誘導(dǎo)B16黑色素瘤細胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用；hPP10-GCLC（谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基）可通過抑制肝臟相關(guān)基因，特別是膠原和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），顯著減輕肝纖維化的過程。

因此，運用基因工程技術(shù)表達hPP10-Cu，Zn-SOD，有望解決非人源性蛋白的抗原性刺激以及大分子蛋白SOD不能穿透細胞膜進入細胞內(nèi)發(fā)揮抗氧化功能的缺陷，從而制備更有效、更經(jīng)濟、更安全的具有護膚、保健和藥用功效的SOD，更有效地保護人體細胞，發(fā)揮抗氧化、抗炎功效，達到護膚美容和預(yù)防治療的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

pET15b 質(zhì)粒、E.coli DH 5α、Rossatta（DE3）、Hela細胞株和HEK293細胞株由本實驗室保存；限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq 酶、dNTP、RT-PCR試劑盒（Fermentas）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（Thermos）；核糖核酸酶、溴化乙錠、EDTA、DAPI（Sigma）；超氧化物歧化酶（SOD）測試盒（南京建成生物工程研究所）；羊抗鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP、鼠源一抗GAPDH（北京中杉金橋公司）；His 單克隆抗體（Abmart）；β-actin 單克隆抗體、SOD 單克隆抗體（Santa Cruz）；白細胞介素IL-1β、腫瘤壞死因子TNF-α等抗體（Affinity）；兔源一抗NFκB p65（Proteintech）；Cy3 標記的羊抗鼠二抗（NovoGene）；PCR儀、蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)（Bio-Rad）；GelLogic-200 凝膠成像系統(tǒng)（Kodak）；倒置熒光顯微鏡（尼康）；全波長酶標儀（Thermo）；生物安全柜（ECSO）；移液槍（Eppendorf）；免疫熒光共聚焦顯微鏡（Leica）。

1.2 方法

1.2.1 pET15b-Cu，Zn-SOD 及pET15b- hPP10-Cu，Zn-SOD重組質(zhì)粒的構(gòu)建

Trizol 法提取HEK293 細胞總RNA；以此為模板通過RT-PCR法克隆人Cu，Zn-SOD的cDNA片段，上游引物為：5'-aatctcgaggcgacgaaggccgtgtgcgtg-3'，下游引物為：5'-cggggatccttattgggcgatcccaattac-3'，并于上下游引物兩端分別插入Xho I和BamH I酶切位點；將Cu，Zn-SOD 的PCR 產(chǎn)物與酶切回收的pET15b 載體經(jīng)T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET15b-SOD。通過退火PCR獲得hPP10基因片段，上游引物為：5'- tatgaaaatccccctgccccgcttcaaactgaaatgtatcttctgtaagaagcggaggaaaagaggcggttctc-3'，下游引物為：5'-tcgagagaaccgcctcttttcctccgcttcttacagaagatacatttcagtttgaagcggggcagggggattttca-3'，并于上下游引物兩端分別插入NdeI和Xho I酶切位點；將退火得到的hPP10雙鏈片段與經(jīng)酶切回收的pET15b-Cu，Zn-SOD載體經(jīng)T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET15b-hPP10-Cu，Zn-SOD。重組表達載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌E. coliDH5α，涂布于含Amp+瓊脂平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落，37 ℃震蕩培養(yǎng)提取質(zhì)粒進行酶切鑒定。送上海生物工程有限公司測序。

1.2.2 Cu，Zn-SOD、hPP10-Cu，Zn-SOD重組蛋白誘導(dǎo)表達和純化

質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞Rossatta（DE3），形成穩(wěn)定的高表達細菌株。在含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上劃單菌落，挑取單克隆至3 mL培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，細菌生長至對數(shù)期時加入1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h，收集細菌。超聲裂菌，4 ℃，12 000 r/min 離心20 min，取上清和Ni-NTA-agarose 親和層析柱進行純化。經(jīng)經(jīng)典透析液TGE 透析后，純化產(chǎn)物進行SDSPAGE電泳分析及Western blotting驗證。

純化試劑配方：Binding buffer（5 mmol/Limidazole，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH7.9）；Washing buffer （60 mmol/L imidazole， 0.5 mol/LNaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.9）；Elution buffer（1 mol/L imidazole，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl， pH 7.9）。變性條件下使用含有6 mol/L urea 的Binding buffer超聲，破碎菌體。

透析液配方：50 mmol/L Tris（pH=8.0） 100 mL，0.5 mmol/L EDTA（pH=8.0） 2 mL，50 mmol/L NaCl100 mL，100%丙三醇100 mL，還原型谷胱甘肽1 g，ddH2O定容至2 L，透析液的pH值要偏離目的蛋白的等電點。

1.2.3 Western blot 檢測純化原核蛋白

Cu，Zn-SOD、hPP10-Cu，Zn-SOD純化蛋白用BCA試劑盒測定蛋白濃度，按5 μg 蛋白上樣量制樣，經(jīng)SDS-PAGE 電泳分析，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，條件為100 mA，90 min；用含1%脫脂牛奶封閉2 h；棄牛奶，一抗結(jié)合目的蛋白室溫孵育2 h；TBST洗滌5 min×3 次后，加入二抗室溫孵育40～50 min；TBST洗滌5 min×3 次后，使用ECL法顯影。

1.2.4 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞

24/6 孔板中傳代培養(yǎng)Hela 細胞（或HEK293 細胞），待細胞生長90%左右時棄去培養(yǎng)基，換為RPMI 無血清細胞培養(yǎng)基處理1 h；5% DMSO預(yù)處理1 h促進穿膜效應(yīng)；加入一定濃度的過濾除菌的純化蛋白處理一定時間。

1.2.5 免疫熒光法鑒定穿膜效應(yīng)

24 孔板中傳代培養(yǎng)HEK293細胞，預(yù)熱PBS洗3次，4%多聚甲醛固定細胞20 min；預(yù)熱PBS洗3次，0.1% triton-X100處理15 min；預(yù)熱PBS洗3次，1%山羊血清封閉30 min；加入1：2000稀釋的一抗（His單抗）室溫2 h；預(yù)熱PBS洗5 min×3次，加入1∶400稀釋的二抗（Cy3標記的羊抗鼠IgG抗體）置37 ℃避光處理1 h；PBS 洗5 min×3 次，DAPI 染細胞核5 min，上述所有操作要保證每孔加入量不少于200 μL足以覆蓋住全部細胞；PBS洗5 min×3 次后，每孔加入200 μL PBS，倒置熒光顯微鏡觀察有無穿膜效應(yīng)。

1.2.6 熒光共定位實驗

將HEK293細胞種植在大鼠尾膠原蛋白（Roche）預(yù)處理的蓋玻片上12～16 h，PBS短暫洗滌2 次后，用4% 多聚甲醛在PBS 中固定20 min，0.1% Triton X-100 滲透，分別用鼠抗SOD、兔抗EGFR的單克隆抗體原代封閉孵育，與羊抗鼠、羊抗兔抗體孵育后，細胞用PBS洗滌，用DAPI染色并用固定劑固定，通過3D共聚焦掃描顯微鏡成像。

1.2.7 Western blotting分析

6孔板中傳代培養(yǎng)HEK293（Hela）細胞株，待細胞生長至80%～90%的融合度時棄培養(yǎng)基，預(yù)熱PBS洗2次，做蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗；冰上裂解細胞2 h，期間不斷彈EP管，4 ℃離心12 000 r/min，25 min。用BCA試劑盒測定蛋白濃度，按10 μg上樣量取上清液與5×上樣緩沖液混合后，煮沸5 min，12 000 r/min 離心1 min，點樣；SDS-PAGE 膠電泳條件為：60 V 電泳30 min，待樣品進入分離膠后，改為120 V；待電泳完成后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，條件為100 mA，90 min；轉(zhuǎn)膜完成后，含1%脫脂牛奶封閉2 h；棄牛奶，兔源SOD 多克隆抗體結(jié)合目的蛋白室溫孵育2 h；TBST洗滌5 min×3 次后，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體室溫孵育40～50 min；TBST洗滌5 min×3次后，使用ECL法顯色。

1.2.8 SOD酶活力測定

本試劑盒采用黃嘌呤氧化法測定SOD酶活力，細胞超聲破碎后，4000 r/min，15 min，離心取上清測定。本試劑盒內(nèi)含試劑共7種：其中試劑五和六按照比例配制顯色劑（現(xiàn)用現(xiàn)配），試劑七用于樣品前處理，清除其他SOD，保留Cu，Zn-SOD酶活力。取樣本0.2 mL加試劑七0.2 mL，渦旋混勻器充分混勻1 min后，以3500～4000 r/min，離心15 min，取上清測定。同時取生理鹽水0.2 mL加試劑七0.2 mL，渦旋混勻器充分混勻1 min后，以3500～4000 r/min，離心15 min，取上清做對照組。按照表1依次加入各種試劑盒樣本。

計算公式如下：

SOD活力（U/mgprot ） =（對照管A550 - 測定管A550／對照管A550）÷ 50% ×（反應(yīng)總體積／取樣量（mL）） ÷ 待測樣本蛋白濃度（mgprot/mL）

1.2.9 MTT 檢測細胞毒性

取對數(shù)生長期HEK293 細胞，以1.2×105/孔的密度接種于96 孔板；待細胞生長至對數(shù)期，棄培養(yǎng)基，換為1640-培養(yǎng)液，處理1 h；每孔分別換成濃度梯度為0.5 μmol/L、1 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L 及無血清的1640-培養(yǎng)液，處理24 h；棄培養(yǎng)基，用500 μL/孔預(yù)熱PBS 洗滌3 次；加入80 μL/孔含血清的正常培養(yǎng)液及20 μL MTT溶液，處理4 h后棄去培養(yǎng)液，加入150 μL/孔DMSO，搖床振蕩30 min至結(jié)晶物徹底溶解后測定A490；該實驗需設(shè)置3 個以上復(fù)孔，重復(fù)3次以上，最終求得細胞存活率。

1.2.10 流式細胞分析術(shù)（FCM）

用25 μmol/L H2O2孵育HEK293細胞3 h誘導(dǎo)ROS水平，建立體外細胞氧化應(yīng)激模型后，流式細胞分析術(shù)分別檢測空白對照組Vehicle+Vehicle，H2O2+Vehicle 組，H2O2+Cu，Zn-SOD組，H2O2+hPP10-Cu，Zn-SOD組4組細胞凋亡的情況。

1.2.11 RT-qPCR分析

使用Trizol 試劑盒提取細胞中的總RNA，然后采取RT-qPCR檢測抗凋亡因子Bcl2、Mcl1、Deptor，促凋亡因子Bad、P21、P27的表達情況，以及α核因子κB（NFκB），促炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α等的表達情況，引物見表2。

1.2.12 DCFH-DA探針檢測細胞內(nèi)ROS含量

取對數(shù)生長期的HEK293細胞接種于6孔板中過夜（同1.3.9分組），去上清，PBS 漂洗３次，每孔加入胰酶1 mL，收集細胞，離心棄上清，將細胞重懸于DCFH-DA 稀釋液（1∶1000）中，混勻，置在37 ℃、CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。1500 r/min，4 ℃離心3～4 min，沉淀細胞，棄上清。用無血清培養(yǎng)基洗滌3次，流式細胞儀定量細胞中ROS的含量。1500 r/min，4 ℃離心3～4 min，沉淀細胞，棄上清。重懸細胞后上多功能微孔板檢測儀分析，488 dm激發(fā)，525 nm發(fā)射。

1.2.13 TPA誘導(dǎo)的皮膚炎癥及組織樣本的收集與實驗

20只8周大的雌性裸鼠購自珠海百試通生物科技有限公司（許可證號SCXK（粵）2020-0051）。局部應(yīng)用TPA誘導(dǎo)小鼠耳部皮膚炎癥，設(shè)計4 組體內(nèi)實驗（5 只/組）：Vehicle+Vehicle組、TPA+Vehicle組、TPA+Cu，Zn-SOD組、TPA+hPP10-Cu，Zn-SOD組。10 μg TPA溶解于20 μL丙酮，涂于小鼠耳部內(nèi)外表面，2次/d，連續(xù)3 d。TPA處理1 h 后Cu，Zn-SOD、hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白局部涂于小鼠耳部。第4天處死小鼠，每只小鼠取直徑為8 mm的穿孔收集組織進行實驗分析。PBS 洗滌耳部組織，Trizol 試劑盒從20 mg 樣品中提取總RNA，RTqPCR檢測NFκB，IL-1β、IL-6、TNF-α等的表達情況，并Western blot分析NFκB p65，p-NFκB p65，IL-1β、TNF-α等的活化或蛋白表達情況。本研究動物實驗經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準（批準號：NO.2023-0359）。

1.2.14 免疫組化分析

60 ℃烤箱烤片30 min，二甲苯和梯度酒精脫蠟，過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化酶，EDTA或檸檬酸鈉高壓修復(fù)，5% BSA 37 ℃封閉，TNF-α和p-NFκB p65單克隆抗體4 ℃孵育，羊抗鼠二抗37 ℃孵育，DAB顯色，清水終止，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化和流水沖洗返藍和樹膠封片，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，兩組比較采用t檢驗，Plt;0.05時認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pET15b-Cu，Zn-SOD、pET15b-hPP10-Cu，Zn-SOD重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果顯示：獲得HEK293 細胞總RNA（圖1A）；反轉(zhuǎn)錄PCR獲得人Cu，Zn-SOD基因片段，大小約為462 bp（圖1B）；獲得hPP10的基因片段，大小約為60 bp（圖1C）；重組質(zhì)粒pET15b-Cu，Zn-SOD經(jīng)XhoⅠ、BamHⅠ和NcoⅠ、Hind Ⅲ兩組酶切反應(yīng)得到基因片段大小約為462 bp、823 bp；重組質(zhì)粒pET15b- hPP10-Cu，Zn-SOD經(jīng)XhoⅠ、BamHⅠ和NcoⅠ、HindⅢ兩組酶切反應(yīng)得到基因片段大小約為462 bp、892 bp（圖1D）。經(jīng)上海生工測序證實重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，且無突變。

2.2 Cu， Zn-SOD、hPP10-Cu， Zn-SOD 融合蛋白的表達、純化及鑒定

SDS-PAGE結(jié)果顯示：在18 000 和25 000 附近出現(xiàn)Cu，Zn-SOD、hPP10-Cu，Zn-SOD 融合蛋白強表達帶，并獲得咪唑透析的天然融合蛋白及尿素透析的變性融合蛋白（圖2）。

Western blotting 結(jié)果顯示：融合蛋白Cu，Zn-SOD和hPP10-Cu，Zn-SOD大小正確，且無雜帶（圖3A、B）。

2.3 hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白能有效的穿透并進入Hela、HEK293細胞內(nèi)

免疫熒光結(jié)果顯示：在HEK293細胞中2.5 μmol/L天然hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白處理組較Cu，Zn-SOD蛋白已有明顯的紅色熒光，5 μmol/L 天然hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白處理組紅色熒光強度更明顯（圖4）。

熒光共定位實驗結(jié)果顯示：在HEK293 細胞中，10 μmol/L hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白處理組較Cu，Zn-SOD蛋白處理組有明顯的代表SOD的胞內(nèi)綠色熒光，其主要位于代表膜蛋白EGFR的紅色熒光之內(nèi)（圖5）。

Western blotting結(jié)果顯示：在Hela細胞（圖6A、B）和HEK293細胞（圖6C、D）中，隨著hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白濃度的增大，其穿膜能力有顯著提高；而Cu，Zn -SOD融合蛋白處理組并不能有效的穿膜進入細胞內(nèi)。同時，hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋可以在HEK293細胞中可持續(xù)存在24 h以上（圖6E）。

2.4 hPP10-Cu，Zn-SOD入胞后保持有意義的酶活力且其毒副作用小

SOD 酶活力實驗結(jié)果顯示：隨著hPP10-Cu，Zn-SOD處理濃度的提高，細胞內(nèi)SOD酶活力也一致的提高，其中5 μmol/L濃度組的Cu，Zn-SOD酶活力提高最明顯（圖7A）。MTT實驗結(jié)果顯示：在一定濃度范圍內(nèi)hPP10-Cu，Zn-SOD長時間處理后活細胞數(shù)量依然保持在80%以上，對細胞的活性影響甚微（圖7B）。

2.5 hPP10-Cu，Zn-SOD入胞后抗凋亡、抗氧化能力

FCM結(jié)果顯示：hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白入胞后，顯著抑制了細胞早期凋亡和晚期凋亡現(xiàn)象的發(fā)生（圖8A～C）。RT-qPCR結(jié)果顯示hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白入胞后，顯著提高了抗凋亡因子Bcl2、Mcl1、Deptor的表達，抑制了促凋亡因子Bad、P21、P27的表達（圖8D）。ROS檢測結(jié)果顯示：hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白入胞后，細胞的氧自由基含量顯著下降（圖8E）。

2.6 hPP10-Cu，Zn-SOD對TPA誘導(dǎo)的小鼠耳部炎癥的抗炎作用

RT-qPCR結(jié)果顯示：hPP10-Cu，Zn-SOD可顯著降低小鼠體內(nèi)炎性因子的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05，圖9B）。Western blotting 結(jié)果顯示：TPA+Vehicle組和TPA+Cu，Zn-SOD 組耳部組織中p-NFκB p65、IL-1β、TNFα表達升高；而TPA+hPP10-Cu，Zn-SOD組炎性因子的表達有所下降（圖9C）。免疫組化結(jié)果顯示：hPP10-Cu，Zn-SOD 處理組降低了炎性因子p-NFκBp65及TNFα的表達（圖9D）。

3 討論

氧化應(yīng)激被認為是ROS生成和抗氧化防御之間的平衡受損，與皮膚衰老及炎癥反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)。SOD是胞內(nèi)核心的自由基清除劑，其中Cu，Zn-SOD在人體內(nèi)占比80%，且最為穩(wěn)定，在抗氧化過程的早期發(fā)揮作用，其在疾病治療、化妝品業(yè)中具有廣闊的前景［27，28］。然而，Cu，Zn-SOD相對分子質(zhì)量大，外源補充難以進入細胞內(nèi)發(fā)揮作用，利用基因工程表達穿膜肽介導(dǎo)的Cu，Zn-SOD融合蛋白成了當下的研究熱點。皮膚的衰老機制復(fù)雜，目前多數(shù)學(xué)者認為ROS過多引發(fā)氧化損傷是核心機制之一。據(jù)報道，SOD2低表達會引發(fā)果蠅的嗅覺衰老加快［29］；SOD模擬物可抑制自由基并減輕衰老引起的認知障礙［30］；適當濃度的PTD-Cu，Zn-SOD乳膏可有效減少氧化損傷，緩解D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老模型，防治皮膚衰老［23］。本研究中hPP10-Cu，Zn-SOD處理組顯著降低了ROS含量，提高了氧化應(yīng)激初期細胞的抗氧化能力，這與上述研究結(jié)果一致。不同的是，PTD是病毒源的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，免疫原性和安全性還是存在一定風(fēng)險。而本研究所用的hPP10源于人類細胞核蛋白，賴氨酸特異性去甲基酶4A的一段多肽序列，可攜帶蛋白、核酸跨膜進入細胞，是安全有效的跨膜運輸載體［25］。

炎癥是許多疾病的主要驅(qū)動因素，炎癥介質(zhì)在各種疾病的發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用［31］。NFκB引發(fā)和放大炎癥過程中涉及的主要信號通路，在炎性發(fā)生中起著核心作用，直接參與1L-1β、1L-6、TNF-α等炎性基因的調(diào)控與表達［32］。有報道稱銀屑?。?3］作為一種慢性炎癥性皮膚病，ROS表達增多，發(fā)病機制可能與NF-κB炎性通路失調(diào)有關(guān)。TPA誘導(dǎo)的小鼠耳部炎性模型［5］中，利用變性TAT-SOD融合蛋白（避免金屬離子影響酶活及考慮成本因素）局部涂抹可抑制促炎性細胞因子表達，被認為是通過調(diào)控NFκB信號通路的表達實現(xiàn)的。本研究亦證實了TPA可導(dǎo)致ROS的過量產(chǎn)生從而誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，而且hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白有效清除ROS，降低了NFκB 信號通路中p-NFκB p65、IL-1β、TNFα的表達，抑制NFκB信號通路，調(diào)節(jié)其下游基因的表達從而起到抗炎的作用。不同的是本研究咪唑透析純化的天然條件下hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白表現(xiàn)出更好的穿膜入胞效應(yīng)，且有效減輕TPA誘導(dǎo)小鼠皮膚炎癥。

本研究證實了融合蛋白hPP10-Cu，Zn-SOD具有較好的穿膜入胞、抗氧化、抗炎功效，且對細胞毒性微弱。并通過熒光共定位實驗呈現(xiàn)了融合蛋白穿膜入胞后定位于細胞膜內(nèi)，甚至于細胞核內(nèi)。本研究和多數(shù)文獻相似之一在于融合蛋白的作用均具有濃度依賴性升高，卻有報道［23］指出，外源性抗氧化劑補充，鐘形圖或成為未來考慮的重要因素之一。與此同時，hPP10是通過何種機制介導(dǎo)Cu，Zn-SOD穿膜入胞的，穿膜機制尚不明確。值得注意的是，hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白進入皮膚會如何代謝，效果可持續(xù)多久還待進一步研究。后續(xù)研究可以考慮制備SOD 單乳及不同濃度的hPP10-Cu，Zn-SOD乳膏，外用觀察小鼠涂抹部位皮膚致敏性及安全性，hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白的透皮機制、組織定位都有待探究。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET15bhPP10-Cu，Zn-SOD并獲得純化蛋白，通過多種分子生物學(xué)手段證實了融合蛋白hPP10-Cu，Zn-SOD具有一定的穿膜入胞、抗氧化、抗凋亡、抗炎功效。具體的，入胞的hPP10-Cu，Zn-SOD能有效的降低H2O2刺激細胞而產(chǎn)生的ROS的含量，同時，在TPA誘導(dǎo)的炎性模型中，入胞的hPP10-Cu，Zn-SOD可能是通過抑制炎性因子NFκB活化及其相關(guān)炎癥基因IL-6、IL-1β、TNFα等的表達從而起到了抗炎的效果。總之，hPP10作為一種新型人源性細胞膜穿透肽，具有較高的穿膜效率和安全性。該研究為SOD應(yīng)用于護膚、人體保健和疾病治療提供了實驗基礎(chǔ)，也為hPP10作為分子藥物遞送載體的應(yīng)用前景提供理論依據(jù)。

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（編輯：余詩詩）

基金項目：國家自然科學(xué)基金（81902788）；深圳市科技計劃（JCYJ20210324130801004）；海南省重點研發(fā)項目基金（社發(fā)方向，SQ2021SHFZ0739）