關(guān)鍵詞：黃瓜；FtsZs基因；生物信息學(xué)分析；非生物脅迫反應(yīng)；生物脅迫反應(yīng)

黃瓜（CucumissativusL.）是世界性的十大蔬菜作物之一，而我國(guó)是黃瓜的主產(chǎn)國(guó)。2022年，我國(guó)黃瓜種植面積為131.15萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量為7730.73萬(wàn)噸，分別占全球的60.32%和81.62%，均居世界第一位。

FtsZ（FilamentingtemperaturesensitiveZ）蛋白作為一種可溶性的胞質(zhì)蛋白，是微管蛋白的結(jié)構(gòu)同系物。FtsZ在離體條件下經(jīng)誘導(dǎo)可通過多聚化作用組裝成線形排列的有序結(jié)構(gòu)，而這些由FtsZ蛋白組成的結(jié)構(gòu)則與tubulin形成的原纖絲非常類似［1］，暗示了其功能的相似性。FtsZ蛋白多定位于質(zhì)體或葉綠體，并作為質(zhì)體分裂復(fù)合體的基本組成部分，組裝成FtsZ環(huán)并招募至少二十多種蛋白質(zhì)介導(dǎo)胞質(zhì)分裂［2］。FtsZ可直接或間接地調(diào)控葉綠體分裂環(huán)中蛋白質(zhì)的組裝和定位，并驅(qū)動(dòng)葉綠體的分裂。有研究表明，擬南芥FtsZ1、FtsZ2-1和FtsZ2-2定位于葉綠體的基質(zhì)和類囊體上，可以通過影響葉綠體分裂，使葉綠體變大［3-5］。水稻（Oryzasativa）OsFtsZ1和OsFtsZ2-1過表達(dá)和敲低都會(huì)抑制淀粉體分裂，產(chǎn)生多形性淀粉顆粒［6］。與野生型相比，馬鈴薯ftsz1敲除突變體塊莖中淀粉顆粒增大或淀粉粒黏度增加［7］。在小立碗蘚中，利用基因編輯技術(shù)獲得了ftsz2-1突變體，研究發(fā)現(xiàn)，ftsz2-1突變體的葉綠體分裂受到顯著影響，甚至在其少數(shù)細(xì)胞中能觀察到單個(gè)不分裂的絲狀葉綠體［8］。在煙草中敲低FtsZ基因會(huì)干擾葉綠體的正常分裂過程，引起葉綠體發(fā)育的異常，并導(dǎo)致葉綠體數(shù)目的減少和體積的增加［9］。

目前黃瓜FtsZs家族的研究還未見報(bào)道，其功能尚不清楚。為了解析黃瓜FtsZs基因的功能，本文對(duì)黃瓜FtsZs家族成員進(jìn)行了鑒定，分析了其基因結(jié)構(gòu)及在染色體上的分布，研究了黃瓜FtsZs與擬南芥、番茄、甜瓜FtsZs的親緣關(guān)系，確定了其組織表達(dá)特性及對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)情況，研究結(jié)果可為探明黃瓜FtsZs作用機(jī)制提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 FtsZs家族基因的鑒定

分別從葫蘆科基因組網(wǎng)站（http：//CucurbitGenomicsDatabase（CuGenDB）、擬南芥基因組網(wǎng)站（https：//www.arabidopsis.org）和番茄基因組網(wǎng)站（https：//solgenomics.net）下載黃瓜、甜瓜、擬南芥和番茄gff、cds、pep、fasta文件，獲得黃瓜、甜瓜、擬南芥和番茄所有注釋基因信息。隨后從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.example.com）下載FtsZ保守域（PF12327）的HMM配置文件，在所下載注釋基因信息中篩選黃瓜、甜瓜、擬南芥和番茄的FtsZs基因（默認(rèn)參數(shù)和截止值為0.01）。使用Pfam工具（http：//www.example.com）和SMART（http：//www.example.com）對(duì)篩選獲得的黃瓜、甜瓜、擬南芥和番茄FtsZ保守域進(jìn)行鑒定，并根據(jù)其與擬南芥FtsZs的親緣關(guān)系進(jìn)行命名；使用ExPasy（htps：/web.ExPasy.org/computepI/）計(jì)算FtsZs的相對(duì)分子量（Mw）、氨基酸數(shù)量（AA）和等電點(diǎn)（pI）；使用Plant-mPLoc（http：//www.csbio.situ.edu.cn/bioinf/plant-multi/）預(yù)測(cè)FtsZs的亞細(xì)胞定位情況。

1.2 黃瓜、甜瓜、擬南芥和番茄FtsZs進(jìn)化關(guān)系分析

利用MEGA7軟件中的ClustalX對(duì)所有FtsZs蛋白序列進(jìn)行對(duì)比，隨后采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并用Bootstrap法（重復(fù)次數(shù)設(shè)定為1000）評(píng)估系統(tǒng)進(jìn)化樹，最終使用MEGA7呈現(xiàn)進(jìn)化樹。

1.3 黃瓜FtsZs基因及蛋白結(jié)構(gòu)的分析

從黃瓜基因組網(wǎng)站（http：//CucurbitGenomicsDatabase（CuGenDB））獲得FtsZs的內(nèi)含子和外顯子信息，并利用TBtools生成基因結(jié)構(gòu)；使用MEME（htps：//www.omicsclass.com/article/432）在線網(wǎng)站分析黃瓜FtsZs的保守motif（設(shè)置基序數(shù)為10，基序的最小長(zhǎng)度為6個(gè)氨基酸，基序的最大長(zhǎng)度為10個(gè)氨基酸），并用TBtools可視化［10］；從黃瓜基因組網(wǎng)站（http：//CucurbitGenomicsDatabase（CuGenDB））獲得FtsZs的蛋白序列，從SMART網(wǎng)站獲得Tubulindomain和FtsZ-Cdomain兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的蛋白序列，利用DNAMAN生成FtsZs蛋白序列并分析蛋白序列的差異。

1.4 黃瓜FtsZs組織表達(dá)特性分析

基于已有的RNA-seq數(shù)據(jù)（SRA046916）［11］，分析了黃瓜FtsZs在根、莖、葉、雌花、雄花、子房、未受精子房、已受精子房和卷須等九個(gè)組織的表達(dá)情況。并基于FPKM值使用TBtools軟件（v2.086）可視化。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析黃瓜FtsZs表達(dá)特性

將華北型黃瓜“9930”種于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)站9號(hào)溫室，并按照常規(guī)栽培方法進(jìn)行管理。在結(jié)果期取根、莖、葉、雌花、雄花、卷須和果實(shí)等組織，采用TRIzol（湖南艾科瑞生物工程有限公司）提取RNA，并用EvoM-MLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒Ver.2（t湖南艾科瑞生物工程有限公司）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)引物，并以黃瓜肌動(dòng)蛋白基因作為內(nèi)參（引物序列見附表S1）。采用SYBRGreenProTaqHS預(yù)混型qPCR試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）在CFXOpus96實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算所選基因的相對(duì)表達(dá)水平［12］。對(duì)每個(gè)基因進(jìn)行3次生物學(xué)和3次技術(shù)重復(fù)。

1.6 黃瓜FtsZs響應(yīng)非生物和生物脅迫分析

從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載了鹽脅迫（GSE116265）［13］、高溫脅迫（GSE151055）［14］、冷處理（GSE210703）［15］和白粉病菌侵染（GSE81234）［16］的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以分析黃瓜FtsZs的響應(yīng)情況，并用TBtools可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜、甜瓜、擬南芥和番茄FtsZs的鑒定

本文在黃瓜、甜瓜、擬南芥和番茄中分別鑒定到了3個(gè)、3個(gè)、3個(gè)和4個(gè)FtsZs基因，并按親緣關(guān)系對(duì)其進(jìn)行命名（見表1）。通過比對(duì)基因結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，基因間的長(zhǎng)度相差很大，介于2050和17560bp之間，其中最短的基因?yàn)锳tFtsZ1（2050bp），最長(zhǎng)的基因?yàn)镾lFtsZ2-1（17560bp）；它們的外顯子數(shù)目介于6和8之間，黃瓜FtsZs基因的外顯子多為7個(gè)，擬南芥FtsZs基因的外顯子多為6個(gè)，番茄FtsZs基因的外顯子多為7個(gè)。蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸長(zhǎng)度介于419和491AA之間；大部分基因偏酸性（AtFtsZ1，AtFtsZ2-1，AtFtsZ2-2，CsFtsZ1，CsFtsZ2-1，CsFtsZ2-2，SlFtsZ1-1，SlFtsZ2-1，SlFtsZ2-2，CmFtsZ1，CmFtsZ2-1，CmFtsZ2-2），只有1個(gè)基因偏堿性（SlFtsZ1-2）。黃瓜FtsZs基因長(zhǎng)度與其他物種的差異較大，暗示FtsZs在不同物種中可能發(fā)揮不同的功能。

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，所有的FtsZ1s基因都在葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中有定位信號(hào)（AtFtsZ1，CsFtsZ1，SlFtsZ1-1，SlFtsZ1-2，CmFtsZ1），黃瓜和甜瓜的FtsZ2s基因都有細(xì)胞質(zhì)定位信號(hào)（CsFtsZ2-1，CsFtsZ2-2，CmFtsZ2-1，CmFtsZ2-2），而擬南芥和番茄的FtsZ2s基因都有葉綠體定位信號(hào)（AtFtsZ2-2，SlFtsZ2-1，SlFtsZ2-2）。

2.2 黃瓜、甜瓜、擬南芥和番茄FtsZs進(jìn)化關(guān)系分析

根據(jù)親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，我們可以將FtsZs基因分為2個(gè)組。第一組包括1個(gè)黃瓜FtsZ基因（CsFtsZ1），1個(gè)甜瓜FtsZ基因（CmFtsZ1），1個(gè)擬南芥FtsZ基因（AtFtsZ1）和2個(gè)番茄FtsZs基因（SlFtsZ1-1，SlFtsZ1-2），其中黃瓜FtsZ基因和甜瓜FtsZ基因的親緣關(guān)系最近，其次是擬南芥和番茄。第二個(gè)組包括2個(gè)黃瓜FtsZs基因（CsFtsZ2-1，CsFtsZ2-2），2個(gè)番茄FtsZs基因（SlFtsZ2-1，SlFtsZ2-2），2個(gè)擬南芥FtsZs基因（AtFtsZ2-1，AtFtsZ2-2），2個(gè)甜FtsZs基因瓜（CmFtsZ2-1，CmFtsZ2-2），其中黃瓜FtsZs基因和甜瓜FtsZs基因的親緣關(guān)系最近，其次是擬南芥FtsZs基因和番茄FtsZs基因（圖1）。

2.3 黃瓜FtsZs基因結(jié)構(gòu)分析

研究發(fā)現(xiàn)，CsFtsZ1有6個(gè)外顯子，氨基酸長(zhǎng)度為421AA；CsFtsZ2-1有7個(gè)外顯子，氨基酸長(zhǎng)度為488AA；CsFtsZ2-2有7個(gè)外顯子，氨基酸長(zhǎng)度為479AA。CsFtsZ1與CsFtsZ2-1、CsFtsZ2-2在外顯子數(shù)目和氨基酸長(zhǎng)度上存在差異，CsFtsZ2-1與CsFtsZ2-2在基因結(jié)構(gòu)上差異不大。

保守motif基序分析發(fā)現(xiàn)，黃瓜3個(gè)FtsZs基因均含有M1、M2、M3、M4、M5、M7、M9、M10這8個(gè)基序，而M6和M8這2個(gè)基序只存在CsFtsZ2-1和CsFtsZ2-2中。

保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，黃瓜、甜瓜、擬南芥和番茄的FtsZs都含有Tubulindomain和FtsZ-Cdomain結(jié)構(gòu)域，暗示了基因進(jìn)化上的保守性。

2.4 黃瓜FtsZs基因的組織表達(dá)模式

RNA-seq數(shù)據(jù)顯示（圖3），3個(gè)黃瓜FtsZs基因在葉、莖、子房和雌花中表達(dá)量較高，推測(cè)其參與了葉、莖、子房和雌花的生長(zhǎng)發(fā)育。其中，CsFtsZ2-1和CsFtsZ2-2在雌花和未受精子房中的表達(dá)量差異較大，暗示其在雌花和子房生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮不同的功能。

熒光定量PCR結(jié)果顯示，黃瓜CsFtsZ2-1基因在華北型黃瓜“9930”葉片、雄花和雌花中的表達(dá)量較高。

2.5 黃瓜FtsZs基因在生物脅迫和非生物脅迫下的表達(dá)譜

利用鹽脅迫、高溫處理、冷脅迫和白粉病菌侵染RNA-seq數(shù)據(jù)，分析了黃瓜FtsZs基因在脅迫下的響應(yīng)情況。首先，我們分析了黃瓜FtsZs基因在鹽脅迫下的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，NaCl處理后，黃瓜CsFtsZ2-1基因下調(diào)，表明該基因可響應(yīng)鹽脅迫；硅（Si）被認(rèn)為是植物的第四大基本元素，可增強(qiáng)抗逆性并促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育。在僅用Si處理的條件下和外源鹽加硅（NaSi）處理下，黃瓜FtsZs的表達(dá)量差異不大（圖4）。

黃瓜FtsZs基因?qū)Ω邷靥幚眄憫?yīng)結(jié)果表明（圖5），高溫處理3h和高溫處理6h后，黃瓜中的3個(gè)FtsZs基因表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，這表明黃瓜中的3個(gè)FtsZs基因不響應(yīng)高溫脅迫。

黃瓜FtsZs基因?qū)涿{迫響應(yīng)結(jié)果表明（圖6），冷處理3h和12h后，黃瓜中3個(gè)FtsZs基因表達(dá)均上調(diào)，而冷處理24h后只有CsFtsZ2-1基因上調(diào)，這表明黃瓜中的3個(gè)FtsZs基因均可響應(yīng)冷脅迫。

分析了黃瓜FtsZs基因?qū)Π追鄄〉捻憫?yīng)情況，結(jié)果顯示，在白粉病敏感株系D8中，接種白粉病后，CsFtsZ1和CsFtsZ2-1的表達(dá)量顯著提高，表明兩者可響應(yīng)白粉病病原菌侵染；在白粉病抗性株系SSL508-28中，接種白粉菌前后，黃瓜FtsZs的表達(dá)量差異不大（圖7）。

3 討論

迄今為止，在大多數(shù)的原核生物中均發(fā)現(xiàn)了FtsZ基因，并對(duì)其功能進(jìn)行了深入的研究。相較于原核生物，真核生物中FtsZs基因的報(bào)道較少。本文在黃瓜、甜瓜、擬南芥和番茄中分別鑒定到了3～4個(gè)FtsZs基因，暗示了FtsZs基因數(shù)目在不同物種間具有高度的保守性。擬南芥3個(gè)FtsZs基因中最長(zhǎng)的為3269bp，最短的為2050bp；黃瓜3個(gè)FtsZs基因中最長(zhǎng)的為6264bp，最短的為4493bp；甜瓜3個(gè)FtsZs基因中最長(zhǎng)的為13038bp，最短的為4410bp；番茄4個(gè)FtsZs基因中最長(zhǎng)的為17560bp，最短的為6365bp，暗示著在不同物種之間FtsZs基因的結(jié)構(gòu)存在差異性（表1）。本文鑒定到的13個(gè)FtsZs基因都含有Tubulindomain和FtsZ-Cdomain兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，但是不同物種之間保守結(jié)構(gòu)域的基序是有差異的，即使是同屬于葫蘆科的黃瓜和甜瓜，它們保守結(jié)構(gòu)域的基序也不完全相同（圖2），這就暗示了該基因在進(jìn)化上既有保守性又存在差異性，進(jìn)一步說明不同物種之間FtsZs基因功能可能不盡相同。

有研究發(fā)現(xiàn)，木薯中的MeFtsZ2-1和MeFtsZ2-2定位于葉綠體內(nèi)［17］。將MeFtsZ2-1和MeFtsZ2-2在擬南芥中異源表達(dá)，可影響擬南芥葉肉細(xì)胞中的葉綠體分裂進(jìn)而使葉綠體數(shù)量減少［17］；在擬南芥中抑制AtFtsZ1-1或AtFtsZ2-1的表達(dá)也會(huì)通過影響葉綠體分裂使成熟葉細(xì)胞中葉綠體的數(shù)量減少［18］。我們利用在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)了黃瓜中3個(gè)FtsZs基因的亞細(xì)胞定位情況，發(fā)現(xiàn)它們?cè)谌~綠體或細(xì)胞質(zhì)中有定位信號(hào)，推測(cè)它們?cè)邳S瓜的葉綠體中起作用（表1）。

已有的研究表明，在木薯中過表達(dá)MeFtsZ2-1基因會(huì)使木薯植株早開花，頂端分支明顯增多，葉片變小且數(shù)量增多［17］。我們利用RNS-seq數(shù)據(jù)和熒光定量PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，黃瓜中3個(gè)FtsZs基因在葉中都有較高表達(dá)，推測(cè)其在黃瓜葉中發(fā)揮重要功能（圖3）。我們利用熒光定量PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，CsFtsZ2-1在雄花和雌花中表達(dá)量也較高，推測(cè)CsFtsZ2-1也會(huì)影響花的發(fā)育（圖3），但其具體作用機(jī)制還需要做深入的研究。

前人研究表明，在300mMNaCl脅迫下，木薯FtsZ2-1的轉(zhuǎn)錄水平先降低后升高，在NaCl脅迫4h時(shí)達(dá)到最低水平，在NaCl脅迫48h時(shí)達(dá)到最高水平［19］。本文結(jié)果顯示，黃瓜FtsZ2-1基因在75mM鹽處理下表達(dá)下調(diào)。除此之外，我們還發(fā)現(xiàn)黃瓜CsFtsZ1、CsFtsZ2-1和CsFtsZ2-1基因可響應(yīng)冷脅迫，CsFtsZ1和CsFtsZ2-1可響應(yīng)白粉病菌侵染，暗示著黃瓜FtsZs基因在鹽脅迫、冷脅迫和白粉病抗性中發(fā)揮作用。

4 結(jié)論

本文在黃瓜中鑒定到3個(gè)FtsZs基因，基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)黃瓜FtsZs基因長(zhǎng)度為1266～1467bp，外顯子數(shù)目為6～7個(gè)，氨基酸長(zhǎng)度為421～488AA；保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)它們都含有Tubulindomain和FtsZ-Cdomain兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域。組織表達(dá)特異性分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)tsZs在黃瓜葉、莖、子房和雌花組織中表達(dá)量較高；CsFtsZ2-1基因可響應(yīng)鹽脅迫，CsFtsZ1、CsFtsZ2-1和CsFtsZ2-2可響應(yīng)冷脅迫，CsFtsZ1和CsFtsZ2-1可響應(yīng)白粉病病原菌侵染。