關(guān)鍵詞：貝萊斯芽孢桿菌；蘋果樹腐爛病菌；抗性基因；抑菌活性成分

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）是革蘭氏陽性菌，廣泛分布于自然界的水體、土壤、空氣、植物根系、植株表面和動(dòng)物腸道等［1-3］。近年來，國(guó)內(nèi)外有關(guān)貝萊斯芽孢桿菌的研究主要集中在其拮抗病原菌、促進(jìn)植物生長(zhǎng)［4，5］、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性、積累防御酶［6］及其抑菌活性物質(zhì)［7，8］等方面。作為一種新型生防細(xì)菌，貝萊斯芽孢桿菌對(duì)腐爛?。?］、炭疽?。?0］、白粉?。?1］等均能發(fā)揮生物防治作用，其菌株FZB42、83和QST713已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商品化［12，13］。在植物與病原菌互作過程中，芽孢桿菌能誘導(dǎo)植物與抗病相關(guān)的防衛(wèi)基因的表達(dá)，使寄主表現(xiàn)出抗病性。研究發(fā)現(xiàn)植物病程相關(guān)蛋白（PRs）合成基因PR-1、PR-2、PR4等基因調(diào)控PR蛋白表達(dá)的NPR1基因、植物保衛(wèi)素合成基因PDF等，這些基因合成的抗病物質(zhì)可以阻止病原菌的進(jìn)一步侵入以及病害的傳播［14］。例如植物根際促生菌（plantgrowthpromotingrhizobacteria，PGPR）能夠通過提高這些防衛(wèi)基因表達(dá)量誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性，增強(qiáng)植物免疫，是各種PGPR用來保護(hù)植物抵御廣泛的病原體的重要機(jī)制之一［15］。芽孢桿菌除了能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性外，還能通過直接分泌水解酶和次生代謝產(chǎn)物來抑制病原菌［16］。本研究采用的貝萊斯芽孢桿菌SY01菌株，由塔里木大學(xué)綠色防控實(shí)驗(yàn)室從環(huán)塔里木盆地周邊健康的蘋果樹皮組織分離獲得，已被證明具有廣泛的抗真菌活性，其發(fā)酵濾液對(duì)蘋果樹腐爛病菌也具有較強(qiáng)的抑制作用［17］，但其對(duì)蘋果樹抗性基因的誘導(dǎo)表達(dá)和主要抑菌活性成分還有待于進(jìn)一步研究。

本研究以貝萊斯芽孢桿菌SY01為試材，采用熒光定量PCR檢測(cè)貝萊斯芽孢桿菌SY01對(duì)蘋果樹關(guān)鍵抗性基因表達(dá)量變化的影響，并對(duì)菌株SY01抗菌脂肽粗提物進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)定；采用脂肽類抑菌成分合成基因的擴(kuò)增比對(duì)和UPLCTripleTOF-MS/MS相結(jié)合，分析菌株SY01的抑菌活性成分，為揭示其誘導(dǎo)蘋果樹抗性基因表達(dá)，明確該菌株的脂肽類抑菌物質(zhì)成分提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）SY01和蘋果樹腐爛病菌（Valsamailvar.pyri）SW5均由塔里木大學(xué)綠色防控實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備

將活化后的貝萊斯芽孢桿菌SY01挑取單菌落接種于盛有50mLLB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，36℃、200rpm培養(yǎng)24h得到種子液。按3%的接種量將種子液接種于優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基（9.8g/L蔗糖、10g/L黃豆粉、7.3g/LNaCl）為發(fā)酵液。發(fā)酵液經(jīng)離心噴霧干燥后獲得固體發(fā)酵產(chǎn)物，于研缽中研磨至粉末狀備用。

1.3 蘋果枝條抗性相關(guān)基因表達(dá)量的RT-PCR檢測(cè)

為了檢測(cè)貝萊斯芽孢桿菌SY01對(duì)蘋果樹關(guān)鍵抗性基因表達(dá)量的變化，選用MdEF-1a為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增植物抗病相關(guān)基因MdPDF1、MdNPR1、MdPR1、MdPR2、MdPR4（引物序列信息見表1），檢測(cè)它們?cè)谔O果枝條中的表達(dá)水平［14］。

選取1-2年生粗細(xì)相近的健康蘋果枝條裁剪至15cm長(zhǎng)，置于濃度1%次氯酸鈉中浸泡15min，無菌水沖洗3遍，晾干后石蠟兩端封口。使用5mm打孔器在枝條中間部位打孔進(jìn)行接種試驗(yàn)，將枝條水平置于鋪有潤(rùn)濕濾紙的托盤上，每處理重復(fù)5次。試驗(yàn)共設(shè)置3個(gè)處理，C1：接種在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d的蘋果樹腐爛病菌SW5；C2：接種貝萊斯芽孢桿菌SY01無菌發(fā)酵濾液100μL，30min后重復(fù)接種1次；C3：清水對(duì)照。分別在接種后0h、24h、48h、72h、96h從發(fā)病（接種）部位開始往上2cm采集樣品，液氮速凍，-80℃冰箱保存。

使用多糖多酚植物RNA提取試劑盒提取樹皮總RNA，1.5%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA質(zhì)量，合格后使用FastKingcDNA合成試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成第一鏈cDNA。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA產(chǎn)物3倍稀釋后作為模板，選MdEF1-α為內(nèi)參基因，按照擴(kuò)增程序?qū)?個(gè)基因的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定，PCR反應(yīng)體系為：SYBRqPCRMix10μL，PrimerF/R各0.8μL，cDNA1μL，ddH2O7.4μL，總體積為20μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性15s，60℃退火20s，72℃延伸20s，共40個(gè)循環(huán)。每反應(yīng)3個(gè)重復(fù)，由RT-PCR儀生成Ct值及其標(biāo)準(zhǔn)誤。反應(yīng)結(jié)束后分析融解曲線和熒光Ct值的變化曲線，參照相對(duì)定量的2-ΔΔCt法計(jì)算不同處理、時(shí)間點(diǎn)樣品目標(biāo)基因?qū)?nèi)參的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 不同有機(jī)溶劑萃取的抗菌脂肽粗提物對(duì)蘋果樹腐爛病菌抑菌作用測(cè)定

采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定不同有機(jī)溶劑萃取后的抗菌脂肽粗提物對(duì)蘋果樹腐爛病菌的抑制作用。以甲醇、二氯甲烷和乙酸乙酯為萃取溶劑，稱取30g發(fā)酵產(chǎn)物于250mL錐形瓶中，分別加入250mL不同有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，置于超聲波清洗機(jī)中超聲5min以加速產(chǎn)物溶解，4℃靜置過夜，4000rpm離心10min，取上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將有機(jī)溶劑蒸干，定量0.01MPBS緩沖液（pH=7.2-7.4）溶解，0.22μm濾膜過濾備用，即為菌株SY01抗菌脂肽粗提物［7］。以只接種蘋果樹腐爛病菌菌餅為空白對(duì)照，每處理3次重復(fù)，28℃培養(yǎng)，待對(duì)照皿內(nèi)腐爛病菌菌絲長(zhǎng)滿后，用十字交叉法測(cè)量處理組菌絲直徑，計(jì)算抑菌率。

1.5 菌株SY01抗菌脂肽粗提物生物學(xué)特性研究

采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定不同處理?xiàng)l件下貝萊斯芽孢桿菌抗菌脂肽粗提物的穩(wěn)定性。溫度：將抗菌脂肽粗提物分別置于不同溫度（-20℃、20℃、40℃、60℃、80℃、100℃）下水浴加熱30min，待各處理液恢復(fù)至室溫，以未經(jīng)溫度處理的抗菌脂肽粗提物為對(duì)照，無菌水為空白對(duì)照，測(cè)定其抑菌率。自然光和紫外線：將抗菌脂肽粗提物分別置于自然光和紫外燈下，分別照射1h、3h、5h、7h、9h，以未經(jīng)自然光或紫外線燈照射處理的抗菌脂肽粗提物為對(duì)照，無菌水為空白對(duì)照，測(cè)定其抑菌率。酸堿度：將抗菌脂肽粗提物用1mol/LHCl溶液或1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH分別至1、3、5、7、9、11，4℃靜置12h后，緩慢調(diào)回各處理pH至原始數(shù)值pH=7.2，以未處理的抗菌脂肽粗提物為對(duì)照，無菌水為空白對(duì)照，測(cè)定抗菌脂肽粗提物的抑菌率。

1.6 菌株SY01抑菌活性物質(zhì)的初步分析

1.6.1 菌株SY01脂肽類抑菌物質(zhì)合成基因的擴(kuò)增和比對(duì) 取出斜面保藏的菌株SY01，三區(qū)劃線法接種于LB培養(yǎng)基平板上，30℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中，36℃，200rpm振蕩培養(yǎng)，取菌液1mL，10000rpm離心5min，棄上清液，用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取菌株SY01的DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

使用表2中的10對(duì)引物分別對(duì)貝萊斯芽孢桿菌SY01進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（20μL）：1μLDNA模板，正反引物各1μL，10μLSYBRPremixExTag，ddH2O7μL。擴(kuò)增條件：95℃5min；95℃10s，60℃30s，72℃20s，共40個(gè)循環(huán)；95℃15s，60℃60s，95℃15s。

1.6.2 脂肽類粗提物的初步分析 采用UPLCTripleTOF-MS/MS鑒定甲醇有機(jī)萃取液的成分［18］。分離色譜柱型號(hào)為C18色譜柱。色譜分離條件：柱溫40℃，流速0.3mL·min-1，進(jìn)樣量4μL。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子化（ESI+）源；霧電壓（IS）5kV；噴霧氣（GS1）50psi；輔助加熱氣（GS2）50psi；輔助加熱氣溫度350℃；TOFMS掃描質(zhì)合比范圍：m/z200-400；采集模式：飛行時(shí)間全掃描質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜（TOFMSIDAMS-MS）模式；TOFMS觸發(fā)二級(jí)掃描范圍：m/z500-2000；去簇電壓（DP）100V；MS-MS碰撞能量（CE）Rollingcollisionenergy。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin2022制圖，SPSS27.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA檢測(cè)

將提取的總RNA進(jìn)行質(zhì)量與含量的檢測(cè)，其RNA濃度均較高，并且A260/280值均在1.8-2.1之間，將濃度、純度合格的RNA使用1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，電泳圖結(jié)果顯示28s和18s條帶清晰完整（圖１），可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 蘋果抗性相關(guān)基因的熒光定量PCR分析

如圖2所示，5種蘋果樹抗性相關(guān)基因表達(dá)量在貝萊斯芽孢桿菌SY01和蘋果樹腐爛病菌SW5的誘導(dǎo)下，除MdPR1基因外，其余4種抗性基因均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且SY01的誘導(dǎo)表達(dá)量大于SW5。不同抗性基因誘導(dǎo)表達(dá)的峰值時(shí)間存在差異，MdNPR1、MdPDF1、MdPR2、MdPR4分別在24、72、72和48h達(dá)到峰值，而MdPR1在0-96h呈現(xiàn)持續(xù)上調(diào)的趨勢(shì)。

2.3 抗菌脂肽粗提物對(duì)蘋果樹腐爛病菌的抑制效果

由圖3可知，3種有機(jī)溶劑萃取菌株SY01發(fā)

酵產(chǎn)物后的抗菌脂肽粗提物均對(duì)蘋果樹腐爛病菌具有一定抑菌效果，其中以甲醇為有機(jī)溶劑的抗菌脂肽粗提物抑菌效果最好，抑菌率達(dá)到72.16%，其次為二氯甲烷，二者無顯著性差異，乙酸乙酯的抑制效果最差，與其它處理存在顯著性差異（Plt;0.05）。

2.4 菌株SY01萃取液中抑菌活性物質(zhì)生物學(xué)特性研究

以甲醇為有機(jī)溶劑對(duì)菌株SY01發(fā)酵產(chǎn)物萃取后的抗菌脂肽粗提物進(jìn)行生物學(xué)特性研究（見圖4）。由圖4A可知，菌株SY01抗菌脂肽粗提物最適溫度范圍為20～40℃，當(dāng)溫度在20℃時(shí)，抑菌活性最大，隨后呈下降的趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到100℃時(shí)，抑菌率為0%。由圖4B和4C可知，在沒有自然光和紫外線的照射下，菌株SY01抗菌脂肽粗提物抑菌率最大，且隨著自然光和紫外線照射時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌活性逐漸減小，當(dāng)照射時(shí)間的延長(zhǎng)至11h時(shí)，其抑菌率最小。由圖4D可知，菌株SY01抗菌脂肽粗提物在pH為7時(shí)，對(duì)蘋果樹腐爛病菌的抑菌率最高，為70%，其次為pH為5和9，兩者之間無顯著差異（Plt;0.05）。

2.5 菌株SY01脂肽類抑菌活性物質(zhì)鑒定

2.5.1 菌株SY01脂肽類抑菌活性物質(zhì)合成基因的擴(kuò)增和比對(duì) 菌株SY01脂肽類抑菌活性物質(zhì)合成基因的擴(kuò)增和比對(duì)結(jié)果顯示（表3），在其基因組中能檢測(cè)到ItuA、ItuB、ItuC、ItuD、SrfA、SrfAB、FenD、yndJ、ysnE這9種與抑菌活性物質(zhì)合成相關(guān)的基因，由此初步推斷出菌株SY01可通過產(chǎn)生Iturin、Surfactin、Fengycin等抗菌次級(jí)代謝產(chǎn)物抑制菌株SW5的生長(zhǎng)。

2.5.2 菌株SY01脂肽類抑菌活性物質(zhì)分析 將菌株SY01發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)甲醇萃取后的有機(jī)萃取液進(jìn)行MALDI-TOF-MS測(cè)定［19］，對(duì)其結(jié)果初步分析（表4），發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜峰［M+H+］質(zhì)荷比為1029.1963、1043.2271、1057.2953、1071.3290、1085.1463，分子量相差14Da，即一個(gè)亞甲基CH2的同系物系列，推測(cè)為IturinA（C13-C17）；質(zhì)譜峰［M+H+］質(zhì)荷比為1030.1928、1044.2222、1058.2528、1072.3083、1086.3240，推測(cè)為IturinB（C13-C17）；質(zhì)譜峰［M+H+］質(zhì)荷比為1043.2271、1057.2953、1071.3290、1085.1463，推測(cè)為Mycosubtilin（C14-C17）；質(zhì)譜峰［M+H+］質(zhì)荷比為1031.1937、1045.2054、1059.2909、1073.3088，推測(cè)為BacillomycinD（C14-C17）；質(zhì)譜峰［M+H+］質(zhì)荷比為1057.2953、1071.3290、1085.1463，推測(cè)為BacillomycinF（C14-C17）；質(zhì)譜峰［M+Na+］質(zhì)荷比為1043.2271、1057.2953、1071.3290、1085.1463，推測(cè)為BacillomycinL（C14-C17）；質(zhì)譜峰［M+Na+］質(zhì)荷比為1030.1928、1044.2058、1058.2928、1072.3083，推測(cè)為SurfactinA（C13-C16）或SurfactinB（C14-C16）或SurfactinC（C13-C16）；質(zhì)譜峰［M+Na+］質(zhì)荷比為1457.4104，推測(cè)為C14FengycinA；［M+H+］質(zhì)荷比為1449.3798，推測(cè)為C15FengycinA，［M+H+］質(zhì)荷比為1519.4116，推測(cè)為C18FengycinB。通過離子響應(yīng)強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)，抑菌活性物質(zhì)中的Fengycin含量較少，Iturin和Surfactin含量相對(duì)較多。

3 討論

研究顯示芽孢桿菌可以通過提高植物的防御酶活性，誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白（PR蛋白）的產(chǎn)生，造成細(xì)胞程序性死亡、胼胝質(zhì)沉積、活性氧爆發(fā)等機(jī)制來保護(hù)植物免受病原菌的侵害［20］。MdPR1參與調(diào)控水楊酸（SA）和乙烯（ET）信號(hào)通路，MdPR2和MdPR4具有β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性；MdPDF1和MdPDF2參與合成植物保衛(wèi)素，進(jìn)行自身防御反應(yīng)；MdNPR1基因參與調(diào)控PR蛋白表達(dá)，這些基因合成的抗病物質(zhì)可以阻止病原菌的進(jìn)一步侵入以及病害的傳播［14］。本研究采用熒光定量PCR驗(yàn)證貝萊斯芽孢桿菌SY01和蘋果樹腐爛病菌SW5對(duì)蘋果樹抗性相關(guān)基因誘導(dǎo)的可持續(xù)性，結(jié)果表明與接種SW5的枝條相比，經(jīng)菌株SY01處理后，MdPDF1、MdNPR1、MdPR1、MdPR2、MdPR4這5個(gè)基因的表達(dá)顯著上調(diào)。蘋果樹腐爛病菌雖然能夠在入侵初期誘導(dǎo)寄主抗性相關(guān)基因的表達(dá)，但隨其持續(xù)的侵染，寄主抗性相關(guān)基因被抑制表達(dá)，而貝萊斯芽孢桿菌SY01可以持續(xù)誘導(dǎo)抗性相關(guān)基因的表達(dá)來抵抗病原微生物的侵襲。陳作［21］等的研究結(jié)果顯示經(jīng)貝萊斯芽孢桿菌ZW10-af處理后，OsPR1a、OsLYP6、OsPR5等參與水楊酸通路相關(guān)防御基因表達(dá)量上調(diào)，有助于增強(qiáng)宿主對(duì)病原菌的抗性。

生防菌具有良好的穩(wěn)定性是其開發(fā)為生物制劑并被推廣使用的必備條件之一［22］。采用生長(zhǎng)速率法對(duì)菌株SY01抗菌脂肽粗提物進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)定，結(jié)果表明以甲醇為有機(jī)溶劑萃取的抗菌脂肽粗提物在-20℃到60℃范圍內(nèi)有較好熱穩(wěn)定性，以及自然光和紫外線穩(wěn)定性；適宜pH值為5-9，當(dāng)pH為強(qiáng)酸強(qiáng)堿時(shí)，活性物質(zhì)抑菌率顯著下降。婁向弟［23］等通過抑菌試驗(yàn)對(duì)貝萊斯芽孢桿菌PJP10的抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)菌株在85℃以內(nèi)具有良好的熱穩(wěn)定性，趙欣［24］等的研究結(jié)果表明解淀粉芽孢桿菌HRH317對(duì)自然光和紫外線不敏感；趙雅［25］等發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌HN-Q-8不耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿，最適pH為4.0-10.0。

貝萊斯芽孢桿菌主要通過合成次級(jí)代謝產(chǎn)物包括細(xì)菌素、抑菌蛋白、脂肽類物質(zhì)和聚酮化合物等實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌的抑制作用［26］。近年來，隨著對(duì)芽孢桿菌脂肽合成基因的深入研究，設(shè)計(jì)出了多對(duì)特異引物以通過PCR方法檢測(cè)菌株是否具有合成脂肽的基因［27］。不同芽孢桿菌產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)有所不同，為明確其主要抑菌活性成分，更好的利用菌株SY01發(fā)酵液中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，通過UPLC-TripleTOF-MS/MS在甲醇萃取有機(jī)相中檢測(cè)到多種抑菌活性物質(zhì)，其中豐度最高的是伊枯草菌素和表面活性素。合成基因的擴(kuò)增和比對(duì)與UPLC-TripleTOF-MS/MS推測(cè)結(jié)果一致，均表明菌株SY01可通過產(chǎn)生伊枯草菌素、表面活性素、豐原素等抗菌次級(jí)代謝產(chǎn)物抑制菌株SW5的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)菌株SY01基因組進(jìn)行預(yù)測(cè)，菌株中含有表面活性素（surfactin）、大環(huán)內(nèi)酯（macrolactin）、桿菌烯（bacillaene）、豐原素（fengycin）、地非西丁（difficidin）、桿菌巴塞素（bacillibactin）、溶桿菌素（bacilysin）、丁苷菌素（butirosin）、萜類（terpenes）和羊毛硫肽類化合物（lantipeptide）等次級(jí)代謝產(chǎn)物［17］。申云鑫［28］等發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌SH-1471具有srfA、fenB、ituA、ituD、bymA等抗生素合成基因；張曉云［29］通過UPLC-TripleTOF-MS/MS證明貝萊斯芽孢桿菌HMB28521菌株可以產(chǎn)生伊枯草菌素（iturin）、豐產(chǎn)素（fengycin）和表面活性素（surfactin），抑菌試驗(yàn)證明iturin和fengycin是該菌株產(chǎn)生的主要抑菌活性物質(zhì)，二者能夠顯著抑制多主棒孢霉的生長(zhǎng)，并且造成菌絲畸形。

4 結(jié)論

本研究對(duì)貝萊斯芽孢桿菌SY01誘導(dǎo)寄主抗性機(jī)理和抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行初步分析，結(jié)果表明蘋果樹腐爛病菌SW5雖然能夠在入侵初期誘導(dǎo)寄主抗性基因的表達(dá)，但隨著其持續(xù)的侵染，寄主抗性基因被抑制表達(dá)，而貝萊斯芽孢桿菌SY01可以持續(xù)誘導(dǎo)蘋果樹抗性相關(guān)基因的表達(dá)；抑菌活性物質(zhì)的最佳萃取溶劑為甲醇；以甲醇為有機(jī)溶劑萃取的抗菌脂肽粗提物在-20℃到60℃范圍內(nèi)有較好熱穩(wěn)定性，以及自然光和紫外線穩(wěn)定性；適宜pH值為5-9，不耐強(qiáng)酸和強(qiáng)堿；脂肽類抑菌物質(zhì)合成基因的擴(kuò)增和比對(duì)與UPLC-TripleTOF-MS/MS的推測(cè)結(jié)果一致，均表明菌株SY01可通過產(chǎn)生Iturin、Surfactin、Fengycin等抗菌次級(jí)代謝產(chǎn)物抑制蘋果樹腐爛病菌SW5的生長(zhǎng)，為揭示其誘導(dǎo)蘋果樹抗性基因表達(dá)、明確該菌株脂肽類抑菌物質(zhì)成分提供了理論依據(jù)。