摘 要：為研究新疆土壤放線菌資源和抗菌活性，采取稀釋涂布法對土壤的放線菌進(jìn)行分離純化，分離出30株鏈霉菌，分屬3屬15種。其中，5株對大腸桿菌有活性，4株對金黃色葡萄球菌有活性。結(jié)果顯示：從新疆土壤中分離得到的微生物菌株具有較強抑菌活性，不僅豐富了特殊生境微生物資源，還為進(jìn)一步從活性菌株中分離抗菌活性單體分子提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：新疆；土壤；拮抗放線菌；次級代謝產(chǎn)物；抗菌活性

中圖分類號：S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號：2095–3305（2024）07–0-03

抗生素的發(fā)現(xiàn)對人類社會產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。自青霉素被發(fā)現(xiàn)以來，從拮抗微生物中尋找活性次生代謝產(chǎn)物便成為天然藥物的重要來源[1]。塞爾曼·瓦克斯曼（Selman Abraham Waksman）開創(chuàng)的從土壤放線菌中發(fā)現(xiàn)抗生素的路徑和方法成就了20世紀(jì)抗生素的黃金時期。

迄今為止，從放線菌中發(fā)現(xiàn)了大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、安莎類、核苷類、多烯類、糖肽類、脂肽類、烯二炔類等結(jié)構(gòu)多樣的抗生素及其生物合成基因簇[2-3]。隨著抗生素耐藥性的不斷增加和新藥物的需求，對放線菌次級代謝產(chǎn)物的研究和開發(fā)成為當(dāng)前研究的焦點[4-5]。因此，深入了解放線菌的次級代謝途徑、探索新的生物活性化合物及優(yōu)化生產(chǎn)方法對滿足醫(yī)用和農(nóng)用需求具有重要意義[6]。

1 放射菌的概況及研究意義

1.1 放射菌概況

作為一類分布廣泛的微生物，放線菌在自然界中扮演著重要角色。其不僅存在于各類土壤中，而且能適應(yīng)多種極端環(huán)境，具有較強的生存能力和代謝多樣性。這些特性使得放線菌成為科研人員眼中具有巨大開發(fā)潛力的微生物資源[7]。

1.2 放射菌研究意義

新疆維吾爾自治區(qū)（以下簡稱“新疆”）以其獨特的地理位置和氣候特征聞名。該地區(qū)具有極端干旱的氣候條件、特殊的生態(tài)環(huán)境和復(fù)雜多樣的地理特征，為微生物的生存和演化提供了一定條件。在此環(huán)境中，為了適應(yīng)惡劣條件，放線菌可能會進(jìn)化出了獨特的代謝途徑和生物活性物質(zhì)。這使得新疆成為探索和發(fā)掘具有天然生物活性微生物資源的理想地點。系統(tǒng)深入地研究放線菌資源及其代謝產(chǎn)物的生物活性，不僅是科學(xué)探索的重要課題，還是開發(fā)利用和保護(hù)我國微生物資源的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。這項研究具有多方面的意義。

在理論層面，它能夠幫助人類更好地理解微生物的生態(tài)適應(yīng)機(jī)制和進(jìn)化過程。通過研究新疆特殊環(huán)境下放線菌的代謝特征，揭示微生物如何應(yīng)對極端環(huán)境的挑戰(zhàn)，這些發(fā)現(xiàn)可能為生命科學(xué)和生態(tài)學(xué)帶來新的理論突破。

在應(yīng)用層面，放線菌及其代謝產(chǎn)物的研究可為新藥開發(fā)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域提供寶貴的資源。同時，促進(jìn)跨學(xué)科合作和技術(shù)創(chuàng)新。

在生態(tài)保護(hù)方面，深入了解新疆地區(qū)的微生物資源有助于制定更加科學(xué)、有效的生態(tài)保護(hù)策略。通過研究這些微生物的生態(tài)功能，可以更好地理解和維護(hù)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng)的平衡。

從國家戰(zhàn)略角度，系統(tǒng)研究和開發(fā)本土微生物資源是增強我國生物技術(shù)創(chuàng)新能力和競爭力的重要途徑。它不僅有助于我國在生物資源領(lǐng)域占據(jù)有利的地位，還能為生物經(jīng)濟(jì)的發(fā)展提供新的動力。

對新疆放線菌資源及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)深入研究，不僅具有重要的科學(xué)價值，還能帶來廣泛的社會經(jīng)濟(jì)效益，是一項具有深遠(yuǎn)意義的科研工作[8-9]。

2 材料與方法

2.1 材料

采集新疆5種土壤進(jìn)行混合，得到土壤混合樣本。具體見表1。樣本于2022年7—8月期間采集，將距地面大約20 cm的土壤表層土采集并裝在一次性無菌袋中，帶回實驗室放于置物架上，風(fēng)干后存放于4 ℃的環(huán)境中備用。

2.2 方法

2.2.1 土壤混合樣本的預(yù)處理

土壤預(yù)處理：采集的土壤在室溫下風(fēng)干后碾碎，每份土壤各稱取50 g混合，得到土壤混合樣本。取10 mL無菌離心管，稱取土壤混合樣品1 g加入無菌水9 mL中混勻即10-1土壤懸濁液，依次稀釋10倍，配制成10-2、10-3土壤懸濁液。

2.2.2 菌株分離與純化

配制放線菌分離培養(yǎng)基，倒平板，取稀釋濃度為10-1、10-2和10-3土壤懸濁液各150 μL，置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。15 d后，用無菌竹簽菌挑取形態(tài)不同的菌落轉(zhuǎn)接高氏一號純化培養(yǎng)基平板上。

2.2.3 菌株的16S rRNA基因測序鑒定

提取菌株的DNA，選取引物27F（5'-AGAGTTTG-ATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTT- GTTACGACTT-3'）。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chainreaction，PCR）反應(yīng)體總系為25 μL：引物各0.5 μL，10×buffer 0.5 μL，模板3 μL，三磷酸脫氧核糖核苷酸1 μL，Taq酶0.2 μL，加雙蒸水至25 μL。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min；56 ℃退火30 s；72 ℃延伸2 min；30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3 μL，采用1%的瓊脂糖凝膠檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，選取含目條帶1500 bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至西安擎科生物有限公司進(jìn)行雙向測序，將菌株的測序結(jié)果上傳至相關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性比對[10-11]。使用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2.2.4 抑菌活性研究

研究選用2株病原菌進(jìn)行抑菌活性檢測：金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）ATCC 25923，大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922。

抗菌活性檢測：采用牛津杯法（牛津杯的直徑為6 mm）進(jìn)行抗菌活性篩選。取粗體物1 mg溶于80%甲醇—水1 mL，得1 mg/mL粗體物溶液，將病原菌與培養(yǎng)基混勻倒入含有牛津杯的平板中，待培養(yǎng)基凝固后，取下牛津杯加入發(fā)酵液粗提物溶液100 μl。接種后的平板放置在37 ℃培養(yǎng)室中培養(yǎng)24～48 h，觀察抑菌圈并記錄抑菌圈的大小。

3 結(jié)果與分析

此次實驗配制4種培養(yǎng)基進(jìn)行對比分析，詳情見表2。

3.1 土壤中可培養(yǎng)分離的放線菌菌株的多樣性

實驗采用了2種不同的分離培養(yǎng)基，共分離鑒定得到30株菌株，分屬于3屬15個種。對已經(jīng)分離得到的放線菌用MEGA 5.0進(jìn)行鄰近法建樹（圖1），比較放線菌之間的親緣關(guān)系。研究共分離得到3個屬，分別是鏈霉菌屬（Streptomyces）占90%、小單孢菌屬（Micromonospora）占6.67%、野野村屬（Nonomuraea）占3.33%（圖2）。其中，鏈霉菌屬的數(shù)量最多，是優(yōu)勢菌屬。

3.2 不同培養(yǎng)基分離得到微生物的多樣性

2種分離培養(yǎng)基分離菌株較多的是高氏一號培養(yǎng)基，其中，鏈霉菌屬24株，小單孢菌屬2株，野野村菌屬1株。從1/10 ATCC分離出3株鏈霉菌。

3.3 抗菌活性篩選

在分離的15個種中，每個種選擇1株用牛津杯法對其發(fā)酵粗提物進(jìn)行活性檢測，測定抑菌圈直徑。發(fā)現(xiàn)4株鏈霉菌Streptomyces pilosus（T-01），Streptomycesgriseoviridis（T-04），Streptomyces griseus subsp.griseus（T-21），Streptomyces durocortorensis（T-23）對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌（在LB培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中生長）均有活性，1株鏈霉菌Streptomyces atroolivaceus（T-08）對大腸桿菌有抑菌活性（圖3）。

4 結(jié)論

在沙漠極端環(huán)境脅迫下，放線菌形成了一套獨特的適應(yīng)機(jī)制，其應(yīng)用價值值得深入研究[12]。此次研究以新疆5份土壤的混合樣本為研究對象，分離鑒定出30株菌株，鏈霉菌屬是沙漠放線菌的優(yōu)勢屬，并表現(xiàn)出很高的抗菌活性。

研究對15株菌株進(jìn)行活性篩選，發(fā)現(xiàn)5株具有較高的抑菌活性，Streptomyces griseoviridis和Streptomyces griseus subsp. griseus對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性最佳。

放線菌是一類廣泛分布且備受人類關(guān)注的微生物資源，其能產(chǎn)生多種多樣的結(jié)構(gòu)新穎、具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物，是多種天然產(chǎn)物的重要來源，具有極大的研究和開發(fā)價值[13-14]。

在沙漠生境中，對可培養(yǎng)微生物進(jìn)行功能性篩選和研究，對具有抗性功能細(xì)菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行挖掘，對其次級代謝產(chǎn)物應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和環(huán)境修復(fù)等方面具有重要意義。這些研究可以為開發(fā)新型藥物、提高食品質(zhì)量及解決環(huán)境問題提供幫助[15]。

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