摘 要：我國在番茄育種領(lǐng)域的研究不斷取得重要突破，由單倍體培育的純合體有利于植物種植和推廣。探討了番茄單倍體育種的影響因素，包括內(nèi)部因素和外部因素，其中，內(nèi)部因素包括供體植株基因型的影響和供試體生長時期的影響；外部因素包括基本培養(yǎng)基的影響、外源激素和外源添加物的影響，以及預(yù)處理的影響，通過案例分析，具體探討了番茄單倍體育種。

關(guān)鍵詞：番茄；單倍體；育種

中圖分類號：S641.2 文獻標(biāo)志碼：B 文章編號：2095–3305（2024）07–00-03

番茄是我國廣泛栽培的蔬菜之一，其果實營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨特，并且含有豐富的維生素、碳水化合物、礦物質(zhì)、有機酸等，在我國居民蔬菜消費比中占據(jù)重要地位。近年來，我國在番茄育種領(lǐng)域的研究不斷推陳出新，由單倍體培育的純合體，有利于植物種植和推廣。利用小孢子培養(yǎng)單倍體途徑，依據(jù)植物細胞全能性，在無菌條件下，將花粉小孢子人工剝離接種在適宜的離體培養(yǎng)基上，通過改變其正常發(fā)育途徑形成胚狀體，進而形成單倍體植株。

番茄作為一種模式植物，在生理生化、遺傳及分子生物學(xué)方面得到了比其他蔬菜更廣泛、更深入、更系統(tǒng)研究的結(jié)果，通過花粉小孢子培養(yǎng)獲得單倍體植株顯著縮短了育種周期，而且明顯加快了育種速度，因此可用于選育番茄優(yōu)良品種[1]。

在自然界中產(chǎn)生單倍體的頻率很低，僅在0.002%

～0.020%之間，在育種實踐中得不到廣泛的應(yīng)用[2]?；ǚ坌℃咦优囵B(yǎng)可以生產(chǎn)大量的單倍體，經(jīng)加倍后的單倍體植株可直接得到純化的品系，且可以結(jié)合雜交親本雙方的優(yōu)點，進而得到具有優(yōu)良綜合性狀的新種質(zhì)，并作為育種的中間材料或親本廣泛應(yīng)用于育種工作[3]。因此，研究番茄花粉小孢子，在理論和實際應(yīng)用中的價值極高。

1 番茄單倍體育種的影響因素

在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，單倍體育種技術(shù)以其獨特的優(yōu)勢成為作物遺傳改良和品種選育的重要工具。近年來，隨著基因編輯和分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，單倍體育種在多種作物上的研究取得了顯著進展，其中番茄作為茄果類作物的代表，其單倍體育種研究更是引起了廣泛關(guān)注。綜述當(dāng)前番茄單倍體育種研究的最新進展，探討其技術(shù)原理、創(chuàng)新成果及未來應(yīng)用前景。

作為世界范圍內(nèi)廣泛種植的重要蔬菜作物，番茄經(jīng)濟價值高，在植物遺傳、發(fā)育和生理研究中占據(jù)重要地位。然而，傳統(tǒng)育種方法周期長、效率低，難以滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)對高效、優(yōu)質(zhì)新品種的迫切需求。單倍體育種技術(shù)通過誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體，再經(jīng)染色體加倍獲得純合的二倍體，從而大大縮短了育種周期，提高了育種效率。因此，番茄單倍體育種技術(shù)的突破對于加速新品種選育、提升番茄產(chǎn)業(yè)競爭力具有重要意義。

近年來，國內(nèi)外研究團隊在番茄單倍體育種領(lǐng)域取得了多項重要成果。尤其是中國農(nóng)業(yè)大學(xué)陳紹江教授領(lǐng)銜的國內(nèi)外單倍體育種技術(shù)研究團隊，在期刊《植物生物技術(shù)雜志》上發(fā)表了關(guān)于番茄單倍體誘導(dǎo)系統(tǒng)的研究成果，首次建立了番茄單倍體誘導(dǎo)系統(tǒng)，為構(gòu)建單雙子葉作物通用的跨物種單倍體快速育種技術(shù)體系奠定了堅實基礎(chǔ)。該研究團隊在克隆玉米單倍體關(guān)鍵誘導(dǎo)基因ZmDMP的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)其在番茄中存在同源基因SlDMP，并通過實驗證明SlDMP基因突變同樣具備獨立的單倍體誘導(dǎo)能力。這一發(fā)現(xiàn)不僅揭示了番茄單倍體誘導(dǎo)的分子機制，還為番茄乃至其他作物的單倍體育種提供了新的技術(shù)路徑。

此外，研究團隊還針對番茄種子小、單倍體鑒別困難的技術(shù)瓶頸，建立了熒光快速鑒別方法。該方法通過浸種和萌發(fā)根尖熒光的兩步觀察，實現(xiàn)了番茄單倍體的精準(zhǔn)鑒別，極大地提高了鑒別效率和準(zhǔn)確性。借助這一方法，研究團隊以番茄單倍體誘導(dǎo)系為父本，與多種材料進行雜交，均成功誘導(dǎo)產(chǎn)生了母本單倍體，且誘導(dǎo)率表現(xiàn)出良好的通用性和穩(wěn)定性。這一成果為番茄單倍體快速育種技術(shù)研發(fā)提供了重要技術(shù)支持，也為在更多作物上創(chuàng)建通用的跨物種單倍體育種技術(shù)體系及雜種優(yōu)勢利用效能的提升開辟了新的路徑。

1.1 內(nèi)部因素

1.1.1 供體植株基因型的影響

與其他外植體培養(yǎng)相似，花粉小孢子培養(yǎng)也受基因型的調(diào)控。不同基因型之間的差異是引起脫分化啟動和頻率不同的關(guān)鍵原因。研究表明，在番茄外植體增殖潛力調(diào)查中，30個栽培品種中只有2個表現(xiàn)出顯著的增殖效果。研究證實，小孢子的胚性潛力是由基因型決定的，存在十分顯著的差異。這種差異表現(xiàn)在小孢子的胚逐步形成潛力與不同基因型誘導(dǎo)的胚逐步形成數(shù)量之間存在巨大差距。

神經(jīng)科學(xué)家用油菜花粉小孢子培養(yǎng)物對番茄進行了試驗，測試了1個野生品種和4個栽培品種，最終發(fā)現(xiàn)5個不同品種都逐步形成了胚體。與預(yù)期相反，在完全相同的培養(yǎng)條件下，擬胚體可能出現(xiàn)的頻率和逐漸形成的時間并不完全相同。相關(guān)學(xué)者還發(fā)現(xiàn)，不同的番茄品種在培養(yǎng)和油菜花粉小孢子形成過程中能夠誘導(dǎo)胚體的形成，而其他不同品種在特定的機體情況下不能逐步形成胚體。因此，基因型在花藥或花粉小孢子培養(yǎng)中發(fā)揮著重要作用。

1.1.2 供試體生長時期的影響

當(dāng)前，部分學(xué)者認(rèn)為大多數(shù)主要糧食作物油菜及油菜花粉小孢子培養(yǎng)的最適溫度是在油菜及油菜花粉減數(shù)分裂中期后。參考早期研究內(nèi)容可以發(fā)現(xiàn)，最適宜誘導(dǎo)番茄玉米小孢子生長的溫度是雙核CPU或雙核CPU的初級階段。也有學(xué)者認(rèn)為小孢子發(fā)育最適宜的溫度是性母細胞階段。與預(yù)想不同的是，在這些研究中，愈傷組織是隨著時間的推移體細胞的生長而逐漸形成的。近年來的研究表明，番茄小孢子培養(yǎng)的最佳時期是在減數(shù)分裂期至四分體發(fā)育期之間。研究認(rèn)為，番茄小孢子的生長發(fā)育時期與花芽的實際長度、雌蕊的顏色、花被片的連續(xù)發(fā)育程度和開花發(fā)育的時期有密切關(guān)聯(lián)。相關(guān)學(xué)者認(rèn)為雌蕊是判斷小孢子生長發(fā)育階段的生命體的基本標(biāo)志，并認(rèn)為雌蕊的實際長度與小孢子生長發(fā)育階段呈負相關(guān)[4]。

考慮到雌蕊的實際長度可能受到基因型差異、春秋季節(jié)變化及病蟲害防治效果等因素的影響，從而導(dǎo)致其長度不完全相同。此外，在評估過程中，還選用了花被片的特征、每朵花的實際長度及每朵花的顏色作為參考。這些因素綜合起來被廣泛認(rèn)為是判斷小孢子生長情況的重要且通用的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 外部因素

1.2.1 基本培養(yǎng)基的影響

在番茄和油菜花粉小孢子培養(yǎng)的研究中，幾乎所有的培養(yǎng)基都已被報道，其中包括NLN、B5、MS、PM等，并且都獲得了擬胚體。與預(yù)想不同的是，相關(guān)學(xué)者采用NLN和A2培養(yǎng)基誘導(dǎo)擬胚體，在培養(yǎng)后期擬胚體的生命形態(tài)并未發(fā)生明顯變化，再生植株并未逐漸形成[5]。從表1可以看出，在MS+2，4-D1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L培養(yǎng)基中，2種所需材料的誘導(dǎo)率達到最低，是一種適合番茄花藥的植物生長調(diào)節(jié)劑。

一些研究表明，纖維素酶在誘導(dǎo)小孢子胚和胚再生逐漸消失逐步形成植物生長培養(yǎng)物中起著重要作用，而且B5培養(yǎng)基中高錳酸鹽的基本指標(biāo)微量元素含量明顯大于NLN和MS培養(yǎng)基；也有研究認(rèn)為，常量元素中的亞硝酸鹽含量能夠認(rèn)為是胚胎體發(fā)育后期的纖維素酶[6]。與預(yù)想不同的是，在小孢子培養(yǎng)的先天環(huán)境中，一定要適當(dāng)降低亞硝酸鹽含量及氫氧根離子和氫離子的濃度，以促進胚胎形成。

1.2.2 外源激素和外源添加物的影響

在小孢子培養(yǎng)的具體過程中，不同種類和比例的激素混合物是進一步提高胚體誘導(dǎo)頻率的因素之一。激素混合比例一般采取使用生長素和細胞分裂素的組合[7]。當(dāng)前，在番茄小孢子培養(yǎng)研究中，常用的細胞分裂素有ZT、2-ip、KT、6-BA、TDZ等，常用的生長素有2，4-D、NAA、IAA、IBA等，而這些激素有許多不同的百分比，可以用于充當(dāng)1種生長素和1種細胞分裂素的組合。而部分研究認(rèn)為，相較于單一激素配比，一種生長素加兩種或多種細胞分裂素的激素配比具備更高的愈傷組織和胚狀體誘導(dǎo)頻率。考慮到激素的百分比受生長因子、供體木本植物基因型結(jié)構(gòu)和功能特性的影響顯著，因此，即便是相同的培養(yǎng)基配方比例，也可能無法有效地適應(yīng)于不同基因型的供體樹。這意味著在制定培養(yǎng)基配方時，需要充分考慮供體樹的基因型差異。但在培養(yǎng)小孢子誘導(dǎo)胚狀體和愈傷組織時，可以參考并優(yōu)化木本植物再生所用的激素組合，選擇適合其基因型的激素混合比例。

在探討胚胎誘導(dǎo)的過程中，多種因素共同作用，而非單一因素能完全阻礙其發(fā)生。尤其是培養(yǎng)基的額外成分對胚胎誘導(dǎo)的頻率和胚體質(zhì)量具有顯著影響[8]。

研究表明，在誘導(dǎo)番茄小孢子愈傷組織時，適量添加維生素C（VC）、肌醇等物質(zhì)能有效促進愈傷組織或胚狀體的形成。此外，一些研究者還嘗試添加了水解酪蛋白（CH）、酵母抽提物（YE）或鮮果汁（ADE）等，但這些成分對番茄雌蕊的培育效果較為有限。為了達到理想的誘導(dǎo)效果，解決番茄雌蕊或油菜花粉小孢子在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的嚴(yán)重褐變和死亡問題顯得尤為關(guān)鍵。實踐表明，通過添加一定量的活性炭或AgNO3，可以顯著降低誘導(dǎo)過程中的蛋白質(zhì)變性率，進而促進擬胚體的形成[9]。還有研究指出，利用未成熟子房或海藻酸鈉等添加劑，能夠加速某些維生素等營養(yǎng)物質(zhì)向培養(yǎng)基中的釋放，或參與內(nèi)源生長素的合成過程，這對愈傷組織或胚狀小孢子的形成具有積極促進作用。此外，雖然在辣椒和花椰菜等作物的培養(yǎng)中報道了谷氨酰胺、絲氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、丙氨酸等信號氨基酸的添加劑應(yīng)用，但這些添加劑在番茄油菜花粉小孢子的培養(yǎng)和誘導(dǎo)中尚未得到廣泛應(yīng)用。這表明針對不同植物種類及其小孢子的培養(yǎng)，需要進一步調(diào)整添加劑的種類和濃度，以達到最佳的培養(yǎng)效果。

1.2.3 預(yù)處理的影響

環(huán)境熱脅迫是誘導(dǎo)小孢子胚胎發(fā)生的充要條件之一，若沒有脅迫的必要條件，小孢子則會順著配子體發(fā)育的正常方式逐漸形成花粉粒。脅迫處理一般適用于供體植株的生長，可提供雌蕊、花枝、油菜花粉小孢子及培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基或條件。與預(yù)想不同的是，雌蕊長期暴露在外。在流動的空氣或海水中，雌蕊容易變黑。在大多數(shù)研究工作中，幾乎總是對培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基或條件進行應(yīng)激預(yù)處理，有關(guān)學(xué)者將應(yīng)激預(yù)處理分為以下3類：

（1）常見作用類，包括高溫應(yīng)激、缺糖、營養(yǎng)以及如何處理秋水仙堿等；

（2）選擇類別相對較少，包括如何處理伽馬輻射、滲透壓、離心等；

（3）特殊處理類，包括氫化植物油低聚糖、重金屬元素脅迫、2，4-D預(yù)處理等。在番茄和油菜花粉小孢子的培養(yǎng)和培養(yǎng)中，具體預(yù)處理方法有采取使用脅迫處理，包括高溫（更高溫度）脅迫，如處理含糖量高的食物等；甘露醇的治療方法，秋水仙堿如何處理等。

2 案例分析

2.1 研究目標(biāo)

研究牛脖子番茄的單倍體育種過程，以提高其育種效率和品質(zhì)。

2.2 研究方法

選擇合適的親本：選擇具有理想特征的牛脖子番茄作為母本和父本。母本應(yīng)該具有較高的產(chǎn)量和耐病性，而父本應(yīng)該具有優(yōu)良的口感和外觀特征。

花粉處理：通過人工授粉的方式，將父本的花粉傳遞至母本的柱頭上。在花粉傳遞過程中避免與其他品種雜交。

單倍體誘導(dǎo)：在花粉傳遞后，使用適當(dāng)?shù)姆椒ㄕT導(dǎo)花粉發(fā)育成為單倍體植株。常用的方法包括化學(xué)物質(zhì)處理、溫度處理或細胞培養(yǎng)等。

單倍體植株培養(yǎng)：將獲得的單倍體植株進行培養(yǎng)，提供適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)和生長條件，以促進其生長和發(fā)育。

單倍體篩選：通過對單倍體植株進行基因型和表

型分析，篩選出具有理想特征的植株。這可以通過分子標(biāo)記技術(shù)、形態(tài)學(xué)觀察、生物化學(xué)分析等方法實現(xiàn)。

單倍體回交：將篩選出的單倍體植株與原始親本進行回交，以恢復(fù)其倍性。這可以通過授粉或組織培養(yǎng)等方法實現(xiàn)。

后代選擇：通過連續(xù)的自交或選擇性雜交，選擇具有理想特征的后代植株。這些后代植株應(yīng)該具有高產(chǎn)量、耐病性強、口感好和外觀好。

2.3 研究結(jié)果

通過上述的單倍體育種研究方法，可以獲得具有理想特征的牛脖子番茄品種。這些品種具有產(chǎn)量更高、耐病性更強、口感和外觀更好的特征，可滿足消費者的需求。

3 結(jié)論

番茄花粉小孢子胚狀體培養(yǎng)的誘導(dǎo)率，分化率低，因此需要進一步加強細胞學(xué)、分子生物等相關(guān)理論的研究，改善供體植株基因等條件，最大限度提高花粉小孢子胚狀體的誘導(dǎo)率和分化率。就番茄小孢子培養(yǎng)未來的發(fā)展方向而言，相關(guān)人員應(yīng)充分利用小孢子胚胎發(fā)生所需的材料，借助區(qū)分小孢子生長正常狀態(tài)和規(guī)律的能力，建立更有效的再生系統(tǒng)，進一步提高擬胚體可能出現(xiàn)的頻率，還需構(gòu)建目標(biāo)性狀分子的表達體系。

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