【關(guān)鍵詞】PPP2R1A；Hela細胞系；癌癥；選擇性剪接；細胞增殖

惡性腫瘤細胞的凋亡、增殖和分化過程受多種基因調(diào)控的影響。因此，探索影響惡性腫瘤細胞生物學(xué)行為的基因及其調(diào)控機制至關(guān)重要。Hela細胞系源于宮頸癌上皮細胞，被廣泛用于腫瘤研究。PPP2R1A是蛋白磷酸酶2（PP2A）的結(jié)構(gòu)亞基，在PP2A全酶的催化過程具有支架和連接的作用[1]。既往研究顯示，PP2A參與細胞生理的各個方面，如代謝、轉(zhuǎn)錄、RNA剪接等[2-3]。本研究通過檢測過表達PPP2R1A的Hela細胞系的增殖情況，驗證PPP2R1A的基因表達和選擇性剪接（AS）特性，并在Hela細胞系中驗證PPP2R1A對選擇性剪接基因（ASGs）的調(diào)控作用。

1材料與方法

1.1實驗材料本研究以宮頸癌細胞株Hela細胞系為研究對象，其來源于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物寶藏中心。

1.2研究方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染在培養(yǎng)基中培養(yǎng)Hela細胞系，培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清[ThermoFisherScientific（Gibco），批號：A2910153RP，規(guī)格：500mL/瓶]、100μg/mL鏈霉素[ThermoFisherScientific（Gibco），批號：217052，規(guī)格：100mL/瓶]和100U/mL青霉素[ThermoFisherScientific（Gibco），批號：217052，規(guī)格：100mL/瓶]，溫度37℃，在含有5%CO2的環(huán)境中用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細胞。48h后收獲轉(zhuǎn)染的細胞，通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測系統(tǒng)（杭州博日科技股份有限公司，國械注準(zhǔn)20153220273，型號：FQD-96A）進行RT-qPCR分析和蛋白質(zhì)印跡分析。

1.2.2克隆與質(zhì)粒構(gòu)建使用CEDesignV1.04軟件設(shè)計引物對。在37℃下對載體進行2～3h消化，將消化后的載體置于1.0%瓊脂糖凝膠上運行并使用色譜試劑盒。使用TRIzol試劑[ThermoFisherScientific（Gibco），批號：99940001，規(guī)格：100mL/瓶]從Hela細胞系中分離總RNA并將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增合成插入片段。將EcoRI和XhoI雙酶切線性載體和PCR插入片段添加至PCR微管中，并與克隆試劑盒連接。通過化學(xué)轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌中，于37℃環(huán)境中在含有1μL/mL氨芐西林（OXOID，批號：2187112，規(guī)格：2.5mg/支）的瓊脂平板上培養(yǎng)16h。最后，通過菌落PCR（28個循環(huán)）分析，利用位于骨架載體上的通用引物篩選菌落。對插入序列進行測序驗證，見表1。

1.2.3PPP2R1A過表達的評估以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因為對照，評估PPP2R1A的過表達情況。在RT-qPCR檢測系統(tǒng)上按照RT-qPCR的標(biāo)準(zhǔn)程序生成cDNA。

1.2.4噻唑藍法分析噻唑藍（MTT）法測定細胞增殖情況。將標(biāo)記的Hela細胞（1×104）用200μL細胞生長培養(yǎng)基接種于96孔培養(yǎng)板中。在細胞達到70%的合流后，37℃培養(yǎng)48h。每孔加入MTT溶液25μL（5mg/mL），孵育4h后采用離心機離心10min（轉(zhuǎn)速為1000r/min，半徑為8cm），每孔取上清液。將MTT（0.15mL/孔）中的彩色甲醛晶體用二甲基亞砜（DMSO）溶解，在490nm處測量光密度值（OD）。

1.2.5RNA提取與測序使用TRIzol作為RNA提取試劑。用兩種酚-氯仿處理純化RNA，用R66b0f42e84fa6731d43f550702b671711e73d3b2e89eab689e3ab78dff8e07f9Q1DNA酶（Promega，規(guī)格：1000U/瓶）去除DNA。采用紫外可見光分光光度計（伯樂實驗有限公司，型號：SmartSpecPlus）檢測其在260/280nm處的吸光度值，重新檢測其質(zhì)量和數(shù)量，并使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進一步驗證RNA的完整性。每個樣本使用1μg總RNA，制備RNA-測序文庫。經(jīng)過末端修復(fù)和a-尾處理步驟后，DNA連接到適配器。純化200～500units的不耐熱尿嘧啶DNA糖基酶（UDG）連接產(chǎn)物，單鏈cDNA于-80℃保存后測序。使用高通量測序進行文庫制備，并在系統(tǒng)上進行測序，生成150nt的配對端產(chǎn)物。利用TopHat2軟件[4]對GRCH38基因組進行定位后，73.19%～72.62%的基因組進行比對，其中92.86%～91.92%為唯一比對。比較過表達組和對照樣本的基因表達模式，表達值以每千堿基外顯子模型每百萬片段映射（FPKM）為單位。

1.2.6差異表達基因分析采用edgeR軟件[5]篩選差異表達基因（DEGs），以錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<0.05和折疊變化（FC）>2.0或FC<0.5作為鑒定DEGs的截止標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)DEGs功能的不同進行分類，利用KOBAS2.0服務(wù)器建立基因本體術(shù)語、京都基因與基因組百科全書（KEGG）的路徑[6]。使用超幾何檢驗和Benjamini-HochbergFDR控制程序來確認每個術(shù)語的富集程度。

1.2.7備選剪接事件分析識別和量化樣品之間的酶和控制酶：在每個樣本中，鑒定出10個典型的AS。采用Student'st檢驗RNA結(jié)合蛋白（RBP）調(diào)節(jié)AS的發(fā)生率變化意義。以FDR<0.05為RBP調(diào)控的AS事件。

1.2.8RT-qPCR驗證DEGs和備選剪接事件對所選的DEGs進行RT-qPCR實驗，使用SYBRGreenPCR試劑盒，在系統(tǒng)上對cDNA進行實時PCR。PCR條件為：95℃變性10min，95℃變性15s，60℃退火，延長1min，共40個循環(huán)。

1.3觀察指標(biāo)⑴分析PPP2R1A在Hela細胞系中的表達及抑制細胞增殖情況。⑵分析PPP2R1A調(diào)控Hela細胞基因表達情況。⑶分析PPP2R1A調(diào)控的DEGs在腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)功能中的富集情況。⑷分析PPP2R1A參與調(diào)節(jié)癌癥通路相關(guān)基因的AS情況。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析采用GraphpadPrism軟件進行配對t檢驗評估PPP2R1A過表達情況。采用edgeR軟件篩選DEGs。以FDR<0.05和FC>2或FC<0.5為截止標(biāo)準(zhǔn)。采用t檢驗評估過表達組與對照組細胞之間AS事件比值變化的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。發(fā)現(xiàn)受調(diào)控的AS事件后，使用KOBAS2.0服務(wù)器對DEGs進行基因本體論（GO）和KEGG富集分析。

2結(jié)果

2.1PPP2R1A在Hela細胞系中的表達及抑制細胞增殖情況分析過表達組Hela細胞增殖低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖1。

2.2PPP2R1A調(diào)控Hela細胞系中的793個基因在過表達組和對照組細胞上構(gòu)建cDNA文庫，通過RNA-seq獲得過表達組的全球轉(zhuǎn)錄組譜。去除適配子序列和低質(zhì)量測序reads后，獲得了（87.0±11.1）×106個有效序列（cleanreads）。PPP2R1A的有效過度表達在RNA-seq評估中得到了進一步證實，見圖2A。樣本相關(guān)熱圖的對角線顯示，過表達組與對照組細胞之間存在相關(guān)性，生物重復(fù)顯著相關(guān)，見圖2B。最終鑒定出與PPP2R1A相關(guān)的510個上調(diào)基因和283個下調(diào)基因。構(gòu)建與PPP2R1A過表達相關(guān)的DEGs火山圖，見圖2C。對RNA-seq樣本中DEGs的表達模式進行的熱圖分析，結(jié)果顯示，PPP2R1A調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄在兩個數(shù)據(jù)集中具有高度一致性，見圖2D。

2.3PPP2R1A調(diào)控的DEGs在腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)功能中的富集情況分析受PPP2R1A上調(diào)和下調(diào)影響的基因涉及多種細胞生物過程，選擇與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)DEGs進行RT-qPCR驗證分析，結(jié)果顯示，參與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因[高遷移率族蛋白A2抗體（HMGA2）、人整合素α2（ITGA2）、基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP3）、胃蛋白酶原C（PGC）、E盒結(jié)合鋅指蛋白2（ZEB2）、內(nèi)皮素2（EDN2）]測序數(shù)據(jù)與RT-qPCR均在過表達組中高表達，兩者結(jié)果高度一致，見圖3、圖4。

2.4PPP2R1A參與調(diào)節(jié)癌癥通路相關(guān)基因的AS分析從PPP2R1A過表達和對照Hela細胞中檢索了（56.0±2.6）×106個唯一映射的讀取。將這些唯一映射的讀取與參考的基因組注釋進行比較，并使用ABLas軟件分析來自RNA-seq數(shù)據(jù)集的AS事件。結(jié)果顯示，PPP2R1A全局調(diào)節(jié)Hela細胞系中的AS事件，見圖5A、圖5B。將表達水平和AS受PPP2R1A調(diào)控的基因重疊，確定了6個基因。在GO評估的生物學(xué)過程中，顯示受PPP2R1A介導(dǎo)AS調(diào)控的基因在有絲分裂、纖毛組裝、血液凝固和血小板活化方面高度富集，見圖5C。富集的KEGG通路包括參與細胞周期、糖胺聚糖降解、RNA轉(zhuǎn)運、慢性髓性白血病和EB病毒感染的通路，見圖5D。腺苷酸活化蛋白激酶3（SMAD3）、細胞周期蛋白依賴性激酶7（CDK7）和絡(luò)氨酸激酶受體2（ERBB2）中的AS事件，見圖5E、圖5F、圖5G。

3討論

RBP是一類伴隨RNA調(diào)節(jié)代謝過程和RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)的總稱，這些蛋白可能通過調(diào)節(jié)各種RNA代謝步驟影響轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，包括前RNA剪接和多聚腺苷酸化、mRNA穩(wěn)定性、mRNA定位和mRNA翻譯[7]。既往研究認為，PPP2R1A具備RNA結(jié)合功能[8]。本研究結(jié)果顯示，在Hela細胞系中過表達PPP2R1A后，其細胞增殖受到抑制。本研究使用RNA-seq全面闡明在Hela細胞中PPP2R1A調(diào)控的轉(zhuǎn)錄組譜，發(fā)現(xiàn)510個基因表達上調(diào)，283個基因表達下調(diào)，提示PPP2R1A顯著影響Hela細胞系的基因表達。本研究DEGs分析發(fā)現(xiàn)，PPP2R1A在Hela細胞系中過表達調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達，這可能與其RNA結(jié)合功能有關(guān)。

PP2A是可逆性磷酸化建立信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵。在這一過程中參與翻譯后修飾的酶是催化蛋白質(zhì)磷酸化的蛋白激酶和蛋白磷酸酶，而蛋白磷酸酶又可從已經(jīng)磷酸化的蛋白質(zhì)底物中去除磷酸基。磷酸鹽的存在或缺失會因底物的不同，從而對修飾蛋白的生物活性產(chǎn)生正向或負向的影響。PPP2R1A蛋白是蛋白磷酸酶PP2A的結(jié)構(gòu)亞基，PP2A直接和間接地影響許多與癌癥進展或抑制相關(guān)的信號通路，這些下游信號通路可能包括調(diào)控細胞凋亡、細胞增殖、細胞周期進程和腫瘤發(fā)生等方面[9]。

本研究結(jié)果顯示，PPP2R1A廣泛調(diào)控數(shù)百個基因的前體mRNA的AS。PPP2R1A過表達后剪接水平改變的基因在GO分析中被富集。AS事件的發(fā)生對轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有廣泛影響。通過對SMAD3、CDK7和ERBB2中的AS事件分析，表明PPP2R1A通過調(diào)節(jié)必需細胞周期相關(guān)基因的AS在腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用。SMAD3基因是轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路的關(guān)鍵成員，有研究認為，白細胞介素（IL）-33可能通過IL-33/ST2軸上調(diào)TGF-β1/Smad3信號通路，誘導(dǎo)細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的形成[10]。CDK7在轉(zhuǎn)錄后水平受到調(diào)控，產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)錄本，在細胞周期中調(diào)節(jié)其表達。ERBB2是一種受體酪氨酸激酶，屬于人表皮生長因子受體激酶家族。在某些實體瘤中，ERBB2突變也可以作為評估化療療效的獨立生物標(biāo)志物[11]。

綜上所述，PPP2R1A可能通過影響AS來調(diào)控相關(guān)基因的潛在轉(zhuǎn)錄，從而對腫瘤的發(fā)展進程產(chǎn)生影響。上述結(jié)果可能為理解PPP2R1A在癌癥發(fā)展中的角色提供了新的視角，并為未來的癌癥治療策略開發(fā)提供了潛在的靶點。