摘要：WRKY轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)具有多種生物學(xué)功能的基因，工業(yè)大麻中WRKY家族研究較少。本研究使用擬南芥WRKY家族蛋白序列與工業(yè)大麻全基因組進(jìn)行比對(duì)，鑒定到34個(gè)WRKY家族成員，不均等分布于9條染色體上，同時(shí)可分為GroupⅠ、GroupⅡa～GroupⅡe、GroupⅢ共7個(gè)亞族，其中GroupⅠ亞族成員數(shù)量最多，數(shù)量為11個(gè)；CsWRKY15包含的結(jié)構(gòu)域最多、CsWRKY34啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件最多，二者可能行使著較多生物學(xué)功能；工業(yè)大麻WRKY家族與擬南芥、水稻、玉米、大豆及大麻自身間共線性分析顯示，CsWRKYs存在豐富的直系同源基因進(jìn)化關(guān)系。

關(guān)鍵詞：工業(yè)大麻；WRKY；蛋白理化性質(zhì)；同源性分析；生物信息學(xué)

工業(yè)大麻（Cannabis sativa L.），又名漢麻、火麻、線麻、寒麻等，為?？疲∕oraceae）大麻亞科（Subfam Cannabioideae）一年生植物，在我國(guó)具有悠久的栽培歷史[1-2]。工業(yè)大麻的麻莖可漚麻提取纖維［3-4］，麻籽既可加工食品也能用于榨油［5-6］，花葉中蘊(yùn)含的萜烯酚類(lèi)化合物集醫(yī)療、美容、保健功能［7-10］于一體，多樣化的功能使得工業(yè)大麻成為經(jīng)濟(jì)效益優(yōu)良的作物。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中最龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，普遍在氨基酸N-端包含有WRKYGQK保守結(jié)構(gòu)域，C-端存在C2H2或C2HC鋅指結(jié)構(gòu)[11]。根據(jù)結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)的差異，WRKY轉(zhuǎn)錄因子可分為：GroupⅠ、GroupⅡ、GroupⅢ三類(lèi)，GroupⅡ進(jìn)一步分為a～e 5個(gè)亞類(lèi)[12-13]，此外，因GroupⅡ亞族部分差異較小，Rushton等[14]將其合并為Ⅱa+Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd+Ⅱe等3個(gè)亞類(lèi)。眾多研究表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與多種生理進(jìn)程，包括：生物和非生物脅迫［15］，種子的形成、發(fā)育、休眠和萌發(fā)［16-17］，葉片發(fā)育和衰老［18］，生物堿類(lèi)、萜類(lèi)、黃酮類(lèi)等次生代謝物合成［19-20］等，目前在擬南芥［15］、水稻［16］、大豆［17］、油菜［18］、番茄［19］、小麥［20］、黃連［21］等作物中均成功鑒定到不同數(shù)量的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，生物學(xué)功能研究也較為豐富[22-25]。大豆中過(guò)表達(dá)GmWRKY12提高了抗旱性和耐鹽性[26]，陸地棉中過(guò)表達(dá)GhWRKY33同樣提升了抗旱能力[27]，玉米ZmWRKY101過(guò)表達(dá)植株的耐鹽能力得到了顯著增強(qiáng)[28]，擬南芥過(guò)表達(dá)AtWRKY25和AtWRKY26植株的耐熱性增強(qiáng)[29]，AtWRKY41功能缺失突變體的花青素含量顯著提高[30]，三七中過(guò)表達(dá)PnWRKY1顯著提高了三七皂苷的合成量[31]，WRKY轉(zhuǎn)錄因子的深入研究，有助于提升植物抗逆性、次生代謝合成等能力。

工業(yè)大麻中WRKY轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)研究較少，Xin等[32]對(duì)響應(yīng)非生物脅迫的WRKY家族成員進(jìn)行分析，其中有25個(gè)CsWRKYs與非生物脅迫顯著相關(guān)，在脅迫下呈現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)。Wei等[33]選用籽用麻作為研究材料，鑒定到39個(gè)CasWRKYs，發(fā)現(xiàn)13個(gè)CasWRKYs響應(yīng)GA3。Iranbakhsh等[34]使用冷等離子體對(duì)大麻種子進(jìn)行處理，30 d后對(duì)幼苗進(jìn)行處理和分析，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)錄因子WRKY1上調(diào)了11.55倍，CBDAS轉(zhuǎn)錄水平提高了12.4倍，THCAS轉(zhuǎn)錄水平提高了25.6倍，WRKY1可能與大麻素合成呈現(xiàn)正相關(guān)。

頑拗型再生性使得工業(yè)大麻組培進(jìn)展和分子育種技術(shù)的相關(guān)研究遠(yuǎn)不如其他作物豐富，許多其他作物中運(yùn)用的分子技術(shù)很難在大麻中實(shí)現(xiàn)[35]，針對(duì)WRKY家族生物學(xué)功能的研究也少之又少。工業(yè)大麻WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的全基因鑒定，有助于在不依靠其他分子生物學(xué)手段的情況下提前了解WRKY家族的基因結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，對(duì)WRKY家族的生物學(xué)研究具有一定指導(dǎo)意義，進(jìn)一步對(duì)大麻基因組深度剖析能夠?yàn)橛N提供新方向。

1材料與方法

1.1工業(yè)大麻WRKY轉(zhuǎn)錄因子的全基因組鑒定

擬南芥和工業(yè)大麻的全基因組序列（fasta文件）及基因組注釋文件（GFF3格式）從Ensembl Plants（http：//plants.ensembl.org/index.html）數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站下載獲得，擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子下載于植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)PlantTFDB（http：//planttfdb.gao-lab.org/index.php）。利用TBtools軟件[36]的BLAST功能將擬南芥WRKY家族氨基酸序列與工業(yè)大麻全基因組蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，設(shè)定為E值lt;1E-5，獲得比對(duì)文件Blast.tab1；對(duì)Blast.tab1中的數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，排序并去除重復(fù)項(xiàng)和無(wú)義項(xiàng)。在Pfam數(shù)據(jù)（http：//pfam-legacy.xfam.org/）庫(kù)中，獲得WRKY轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)文件，利用HMMER軟件構(gòu)建隱馬爾可夫模型，與大麻全基因組蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，獲得比對(duì)文件Blast.tab2；對(duì)Blast.tab2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，排序并去除重復(fù)項(xiàng)和無(wú)義項(xiàng)。取Blast.tab1和Blast.tab2的交集，并利用NCBI中的Batch CDD search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）對(duì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，剔除掉不包含WRKY家族結(jié)構(gòu)域的蛋白序列，最終得到大麻WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的氨基酸序列文件。

1.2WRKY轉(zhuǎn)錄因子的蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)、染色體定位及進(jìn)化分析

通過(guò)ExPASy在線網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)大麻WRKY轉(zhuǎn)錄因子的蛋白長(zhǎng)度、分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、親水性等理化性質(zhì)，通過(guò)在線網(wǎng)站W(wǎng)OLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位。根據(jù)鑒定出的工業(yè)大麻WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族信息和基因組注釋文件，利用TBtools的Gene location visualize from GTF/GFF功能進(jìn)行染色體定位。使用MAGE11對(duì)大麻WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，使用在線網(wǎng)站Evolview（https：//www.evolgenius.info/evolview/）美化進(jìn)化樹(shù)。

1.3大麻WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因結(jié)構(gòu)分析

利用MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）對(duì)大麻WRKY家族成員蛋白序列進(jìn)行保守Motif預(yù)測(cè)，設(shè)定Motif個(gè)數(shù)為10，獲得預(yù)測(cè)圖。利用NCBI中的Batch CDD Search對(duì)大麻WRKY家族成員蛋白序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。使用TBtools軟件的Gene Structure View結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、保守Motif預(yù)測(cè)、保守結(jié)構(gòu)域和內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)作圖，對(duì)大麻WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化。

1.4大麻WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)

通過(guò)Plant CARE網(wǎng)站（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/）的search for care工具對(duì)大麻WRKY轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子上游2 000 bp的基因序列進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)，剔除重復(fù)元件、無(wú)名元件及TATA/CAAT-box等，并對(duì)篩選后的順式作用元件進(jìn)行注釋?zhuān)詈罄肨Btools軟件的Simple BioSequence Viewer功能進(jìn)行可視化，輔助Graphpad prism 8.0.2完成順式作用元件堆疊圖，并對(duì)二者進(jìn)行結(jié)合和美化。

1.5大麻WRKY基因家族同源性分析

結(jié)合大麻、擬南芥、水稻、玉米和大豆的基因組文件及注釋文件，使用TBtools軟件的One step MCScanX功能得到與4種植物的直系同源基因信息，分別以“At-N”“Os-N”“Zm-N”“Gm-N”“Cs-N”表示擬南芥、水稻、玉米、大豆和大麻的染色體，N為染色體編號(hào)，使用TBtools軟件的Dual systeny plot for MCScanX功能繪制大麻與4種植物的直系同源基因圖。同時(shí)，使用TBtools軟件的One step MCScanX功能對(duì)大麻物種內(nèi)直系同源基因信息進(jìn)行分析，使用Advanced Circos功能對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。

2結(jié)果與分析

2.1工業(yè)大麻WRKY轉(zhuǎn)錄因子的鑒定和蛋白理化性質(zhì)分析

經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)、隱馬爾可夫模型比對(duì)和WRKY結(jié)構(gòu)域鑒定，并剔除假基因后，最終在工業(yè)大麻基因組中鑒定到34個(gè)WRKY基因，為了便于后續(xù)的分析，按照基因號(hào)順序命名為CsWRKY1～CsWRKY34，根據(jù)擬南芥WRKY分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，將CsWRKYs分為5個(gè)亞族。工業(yè)大麻WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族理化性質(zhì)詳情如表1所示，其中CsWRKY24編碼的序列最短，為88個(gè)氨基酸，分子量為10 572.98 Da，CsWRKY13編碼的序列最長(zhǎng)，達(dá)745個(gè)氨基酸，分子量為83 259.77 Da；共有15個(gè)CsWRKYs為酸性蛋白，其余19個(gè)CsWRKYs為堿性蛋白；所有CsWRKYs蛋白的平均親水系數(shù)均小于0，全部是親水性蛋白；所有工業(yè)大麻WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)均大于30，證明其在植物體內(nèi)穩(wěn)定存在的時(shí)間相對(duì)較短；除CsWRKY14和CsWRKY24的亞細(xì)胞定位顯示在細(xì)胞質(zhì)，其他CsWRKYs成員亞細(xì)胞定位均預(yù)測(cè)在細(xì)胞核內(nèi)。

2.2工業(yè)大麻WRKY轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化分析

本研究將工業(yè)大麻和擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，并按照擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的分類(lèi)方式進(jìn)行分類(lèi)，根據(jù)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，將CsWRKYs分為5個(gè)亞族，如圖1所示，GroupⅠ亞族11個(gè)成員，包括CsWRKY13/17/18/19/20/21/25/26/27/30/31等；GroupⅡa+Ⅱb亞族6個(gè)成員，包括CsWRKY5/6/7/8/14/16；GroupⅡc亞族8個(gè)成員，包括CsWRKY9/10/11/23/24/32/33/34等；GroupⅡd+Ⅱe亞族4個(gè)成員，包括CsWRKY4/12/15/28等；GroupⅢ亞族5個(gè)成員，包括CsWRKY1/2/3/22/29等。

圖1大麻和擬南芥WRKYs基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.3工業(yè)大麻WRKY家族的染色體定位

工業(yè)大麻共有10對(duì)染色體，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員除Chr7染色體上無(wú)分布外，在其他染色體上均有分布，如圖2所示，將大麻染色體依次命名為Chr1～Chr10，Chr1上分布有3個(gè)CsWRKYs（CsWRKY23/32/33），Chr2上分布有8個(gè)CsWRKYs（CsWRKY1/2/3/4/5/6/7/22），Chr3上分布有3個(gè)CsWRKYs（CsWRKY24/26/27），Chr4上分布有5個(gè)CsWRKYs（CsWRKY8/9/10/11/25），Chr5上分布有3個(gè)CsWRKYs（CsWRKY12/28/29），Chr6上分布有4個(gè)CsWRKYs（CsWRKY13/14/30/31），Chr8上分布有4個(gè)CsWRKYs（CsWRKY15/16/17/18），Chr9上分布有1個(gè)CsWRKYs（CsWRKY19），Chr10上分布有3個(gè)CsWRKYs（CsWRKY20/21/34）。其中 CsWRKY8較為靠近Chr4的端粒區(qū)，鑒于精度的問(wèn)題，其他類(lèi)似的定位于染色體末端的基因?qū)嶋H上距離端粒區(qū)有很長(zhǎng)的一段序列。

2.4大麻WRKY家族基因結(jié)構(gòu)分析

分別獲得系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、保守Motif預(yù)測(cè)、保守結(jié)構(gòu)域和內(nèi)含子-外顯子的數(shù)據(jù)或圖片后，使用TBtools進(jìn)行整合，最終結(jié)果如圖3所示。通過(guò)進(jìn)化樹(shù)對(duì)大麻WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行了分類(lèi)，共分為3個(gè)亞族；從Motif預(yù)測(cè)結(jié)果可以看出，不同的亞族之間的Motif結(jié)構(gòu)，存在明顯的差異，GroupⅠ表現(xiàn)出Motif4在前、其他Motif聚團(tuán)在后的趨勢(shì)，類(lèi)似地，GroupⅢ亞族表現(xiàn)為Motif5在前、其他Motif聚團(tuán)在后的趨勢(shì)，而GroupⅡ亞族基本表現(xiàn)為所有Motif聚團(tuán)的狀態(tài)。CsWRKY31是GroupⅡ亞族特殊的一員，該成員的Motif排列與GroupⅠ家族前半部分相似。

GroupⅠ的WRKY結(jié)構(gòu)域與其他亞族差異明顯，具有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，而CsWRKY31僅包含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，結(jié)合圖B和圖C發(fā)現(xiàn)CsWRKY30、CsWRKY31的基因結(jié)構(gòu)十分相似，二者在染色體上處于臨近位置，前半部分氨基酸序列和內(nèi)含子排列高度相似，且CsWRKY31的CDS+UTR長(zhǎng)度與CsWRKY30差異較小，兩者在進(jìn)化過(guò)程中可能來(lái)自同一祖先，CsWRKY31中間位置的堿基產(chǎn)生了突變使得后續(xù)的部分序列由CDS轉(zhuǎn)變?yōu)閁TR，導(dǎo)致將其歸類(lèi)為GroupⅡ亞族；從Motif結(jié)構(gòu)上看，CsWRKY31具有GroupⅠ亞族特有的Motif4和Motif8，同樣證實(shí)其有GroupⅠ亞族的特征，CsWRKY30、CsWRKY31可能是旁系同源基因。類(lèi)似地，CsWRKY20/21和CsWRKY9/10/11分別為旁系同源基因，2個(gè)基因簇各自的Motif預(yù)測(cè)、WRKY結(jié)構(gòu)域及內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)相似度均較高，僅序列長(zhǎng)短存在差異，可能在進(jìn)化過(guò)程中缺失或增加了部分堿基；GroupⅢ亞族的5個(gè)成員CsWRKY1/2/3/23/30的Motif預(yù)測(cè)、WRKY結(jié)構(gòu)域相似度較高，基因長(zhǎng)度差異顯著，但內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)差異較小，表現(xiàn)為UTR+3個(gè)內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)。

GroupⅡ5個(gè)家族的基因長(zhǎng)度、內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)差異豐富，Motif預(yù)測(cè)各有特點(diǎn)，不同家族的Motif排列順序存在差異。GroupⅡc亞族中存在一個(gè)特殊的成員CsWRKY15，除WRKY蛋白結(jié)構(gòu)域外，還包含Plant_zn_clust結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?yàn)橹参镤\簇域，與WRKY結(jié)構(gòu)域相關(guān)性很高。此外，在早期的篩選過(guò)程中，刪除了10個(gè)鑒定到的包含WRKY Superfamily結(jié)構(gòu)域但無(wú)WRKY 結(jié)構(gòu)域的成員，WRKY Superfamily與WRKY結(jié)構(gòu)域相似度很高，可能具有類(lèi)似的功能，有待進(jìn)一步分析鑒定。

2.5大麻WRKY家族啟動(dòng)子區(qū)域順勢(shì)作用元件分析

通過(guò)Plant CARE網(wǎng)站對(duì)大麻WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族啟動(dòng)子區(qū)域2 000 bp內(nèi)的順勢(shì)作用元件進(jìn)行了預(yù)測(cè)，其結(jié)果如圖4所示，各CsWRKYs的順勢(shì)作用元件數(shù)量和類(lèi)別差異顯著。CsWRKY20/21和CsWRKY9/10/11這兩類(lèi)核苷酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)域相似性較高的基因簇，在順勢(shì)作用元件的預(yù)測(cè)中相似性較低；如CsWRKY9/10/11在染色體上定位于相鄰位置，甚至部分序列存在重疊，預(yù)測(cè)到的順勢(shì)作用元件同樣存在差異，CsWRKY9相較于CsWRKY10/11包含有2種特異性的元件：ATBP-1結(jié)合位點(diǎn)（1個(gè)）、胚乳調(diào)控（2個(gè)），類(lèi)似地，CsWRKY10包含有1個(gè)玉米蛋白代謝元件，CsWRKY11包含有1個(gè)晝夜節(jié)律調(diào)控元件；CsWRKY20/21同樣在染色體上定位于相鄰位置，部分序列存在重疊，啟動(dòng)子區(qū)域順勢(shì)作用元件的差異較為顯著，CsWRKY20相較于CsWRKY21多了5種特異性元件：生長(zhǎng)素響應(yīng)（1個(gè)）、水楊酸響應(yīng)（3個(gè)）、赤霉素響應(yīng)（1個(gè)）、玉米蛋白代謝（1個(gè)）和柵欄細(xì)胞調(diào)節(jié)（1個(gè)），而CsWRKY21包含茉莉酸甲酯響應(yīng)（2個(gè)）、晝夜節(jié)律（1個(gè)）等兩種特異性元件。此類(lèi)旁系同源基因簇中的基因，可能在多種響應(yīng)調(diào)節(jié)中扮演不同的角色。

大麻WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族共預(yù)測(cè)到869個(gè)順勢(shì)作用元件，其中光響應(yīng)元件為452個(gè)，占比為52.01%，可見(jiàn)光照確實(shí)為影響植物生長(zhǎng)生存的重要環(huán)境因素；生長(zhǎng)素、水楊酸、脫落酸、茉莉酸甲酯及赤霉素等激素響應(yīng)元件為223個(gè)，占比為25.66%；厭氧反應(yīng)、損傷反應(yīng)、干旱、低溫、晝夜節(jié)律及防御與脅迫等環(huán)境響應(yīng)元件為126個(gè)，占比為14.49%；玉米代謝、分生組織、類(lèi)黃酮類(lèi)合成、細(xì)胞周期及柵欄細(xì)胞等體內(nèi)調(diào)節(jié)元件數(shù)量較少，共32個(gè)，僅占整體的3.56%，此外，CsWRKY33包含1個(gè)鹽脅迫響應(yīng)元件，其他CsWRKYs中并未出現(xiàn)，CsWRKY12包含1個(gè)損傷反應(yīng)響應(yīng)元件，CsWRKY25包含1個(gè)種子特異性調(diào)控元件。從響應(yīng)元件的數(shù)量上預(yù)測(cè)，工業(yè)大麻WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族主要參與到對(duì)外界環(huán)境的響應(yīng)工作。CsWRKY33預(yù)測(cè)到順勢(shì)作用元件的數(shù)量最多，達(dá)44個(gè)，其中光響應(yīng)元件為23個(gè)、激素響應(yīng)元件16個(gè)，CsWRKY33可能在光響應(yīng)和激素響應(yīng)方面有重要的作用，并參與到多條代謝通路中。

2.6大麻WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的基因同源性

通過(guò)TBtools的Dual systeny plot for MCScanX功能對(duì)大麻WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因與其他植物 WRKY家族進(jìn)行共線性分析，分別選用模式植

物擬南芥及其他3種主要作物水稻、玉米、大豆進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖5所示。在大麻WRKY家族與擬南芥的比對(duì)中，有25對(duì)基因呈現(xiàn)共線性，水稻中11對(duì)，玉米中8對(duì)，大豆中共線基因較多，存在77對(duì)；不同的植物之間，基因存在相似性，在進(jìn)化中可能來(lái)自統(tǒng)一祖先，因其種屬分類(lèi)等差異，共線性基因數(shù)量存在明顯的差異。為了解進(jìn)化過(guò)程中自然選擇的作用，對(duì)4個(gè)比對(duì)結(jié)果中的共線基因?qū)M(jìn)行提取，置入Simple ka/ks calculator功能中進(jìn)行ka/ks分析，如ka/kslt;1，說(shuō)明基因進(jìn)行純化選擇，意圖消除有害突變；如ka/ks=1，說(shuō)明基因發(fā)生中性選擇，如ka/ksgt;1，說(shuō)明基因受到正向選擇，新產(chǎn)生的突變基因在當(dāng)前環(huán)境存在一定優(yōu)勢(shì)。值得一提的是，4個(gè)物種共121對(duì)共線性基因，其中82對(duì)ka/ks均小于1，證明進(jìn)化過(guò)程中進(jìn)行了純化選擇，削弱蛋白變異的幅度；剩余39對(duì)為負(fù)值，不符合ka/ks的取值范圍，標(biāo)定為NaN。實(shí)際原因?yàn)橥x突變較多、核苷酸序列差異大，存在豐富的同義突變使得氨基酸序列差異較小，共線性通過(guò)蛋白比對(duì)實(shí)現(xiàn)而非基因序列，因而所有類(lèi)似蛋白的ka/ks比值被識(shí)別為錯(cuò)誤結(jié)果，可理解為蛋白存在共線性，但對(duì)應(yīng)基因序列的共線性較弱，無(wú)法計(jì)算ka/ks。

在大麻WKRY轉(zhuǎn)錄因子家族與4種高等植物的共線性基因?qū)χ?，CsWRKY19的共線性基因?qū)ψ疃?，?3對(duì)，占比10.7%，CsWRKY7和CsWRKY29分別為11對(duì)和12對(duì)，CsWRKY7/19/29的祖先可能在植物染色體上產(chǎn)生了相對(duì)較多的片段重復(fù)。4種高等植物中，大豆與CsWRKYs比對(duì)出的共線性基因?qū)ψ钬S富，為77對(duì)，其中Chr1上有17對(duì)，Chr2上有21對(duì)，其他染色體上分布較少，大麻Chr1和Chr2上的WRKY家族成員可能與大豆WRKY家族親緣關(guān)系更近，此外大麻CsWRKYs共有17個(gè)成員與大豆WRKY家族存在共線性，兩者均是雙子葉植物，與水稻、玉米等單子葉植物確實(shí)可能存在更近的親緣關(guān)系。進(jìn)一步對(duì)大麻WRKY家族的物種內(nèi)共線性進(jìn)行分析，如圖6所示，Chr1/2/3/4/6/10等染色體上均存在WRKY基因簇，呈現(xiàn)共線性的WRKY成員，多歸屬于同一亞族，如CsWRKY2和CsWRKY29存在共線性但定位于不同染色體上，兩者均屬于GroupⅢ亞族；CsWRKY9和CsWRKY34存在共線性且定位于不同染色體上，兩者屬于GroupⅡ亞族，原因可能是在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了染色體片段復(fù)制事件。值得一提的是，在物種間共線性的ka/ks分析中CsWRKY1和CsWRKY2的ka/ks值gt;1，證實(shí)其進(jìn)行了正向選擇，將可能有益的突變保留下來(lái)，剩下的共線性基因?qū)a/ks多數(shù)lt;1，即發(fā)生了純化選擇，部分共線性基因?qū)Ρ欢x為NaN，即序列差異較大。

3討論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中重要的基因家族，已證實(shí)參與到生物和非生物脅迫，種子的形成、發(fā)育、休眠和萌發(fā)，葉片發(fā)育和衰老，生物堿類(lèi)、萜類(lèi)、黃酮類(lèi)等次生代謝物合成等重要生理進(jìn)程。本研究在大麻中，通過(guò)生物信息學(xué)分析鑒定到34個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子，可歸類(lèi)于GroupⅠ、GroupⅡ、GroupⅢ等3個(gè)亞族中，根據(jù)其他的分類(lèi)方法，可將GroupⅡ亞族進(jìn)一步分為GroupⅡa～GroupⅡe等3個(gè)小亞族。不同亞族間WRKY結(jié)構(gòu)域、其他結(jié)構(gòu)域、Motif分布、內(nèi)含子-外顯子、啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件等的數(shù)量和位置均存在差異，相同亞族間WRKY結(jié)構(gòu)域、其他結(jié)構(gòu)域、Motif分布、內(nèi)含子-外顯子、啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件等的數(shù)量和位置存在一定的相似性，同一亞族成員可能行使著近似但不完全相同的功能。

大麻WRKY家族的研究較少，Xin等[32]的研究中對(duì)大麻基因組進(jìn)行分析，鑒定到40個(gè)WRKY基因，并構(gòu)建了進(jìn)化樹(shù)，對(duì)25個(gè)WRKY成員在干旱、鹽脅迫、鎘脅迫等處理的表達(dá)量進(jìn)行分析，證實(shí)大麻WRKY家族在非生物脅迫下響應(yīng)中占據(jù)重要作用，40個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的基因結(jié)構(gòu)、順勢(shì)作用元件、同源基因進(jìn)化關(guān)系并未進(jìn)一步展現(xiàn)。Wei等[33]選用籽麻作為試驗(yàn)材料，鑒定到39個(gè)CasWRKYs，對(duì)GA3處理CasWRKY的表達(dá)情況進(jìn)行了深入探究，證實(shí)籽用大麻的WRKY家族在纖維和莖的發(fā)育中具有重要作用。經(jīng)過(guò)比對(duì)Xin等[32]鑒定到的40個(gè)CsWRKYs中有4個(gè)成員與本研究定位到的基因顯著相似，Wei等[33]鑒定到的39個(gè)CasWRKYs中有2個(gè)成員與本研究鑒定基因顯著相似，而兩者間存在2個(gè)相似鑒定基因。使用不同的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，定位得到的基因家族存在差異，通過(guò)比對(duì)能夠得到數(shù)量較少的相似鑒定基因，不同測(cè)序數(shù)據(jù)中均能夠鑒定得到的基因可能更具有真實(shí)性［36］。

4結(jié)論

本研究共鑒定出34個(gè)WRKY家族成員，對(duì)基因結(jié)構(gòu)與分類(lèi)、啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件及同源基因進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了詳細(xì)的分析，推測(cè)大麻WRKY家族各成員在植株生長(zhǎng)過(guò)程中，可能扮演著不同的角色，具體生理功能有待繼續(xù)研究發(fā)掘。此外，分析過(guò)程中剔除了10個(gè)無(wú)WRKY 結(jié)構(gòu)域的WRKY Superfamily家族成員，WRKY Superfamily可能具有WRKY家族類(lèi)似的功能，有待進(jìn)一步分析鑒定。本研究為大麻WRKY家族成員的生物學(xué)功能研究奠定了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

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Genome-Wide Identification and Bioinformatics Analysis of the WRKY Gene Family in Industrial Hemp

ZHANG Yuanye， ZHANG Liguo， ZHANG Ming， FANG Yuyan， ZHENG Nan， YAN Bowei， SUI Yue

（Institute of Industrial Crops，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150086，China）

Abstract：WRKY transcription factors are a class of genes with multiple biological functions， and the WRKY family in cannabis is rarely studied.We used Arabidopsis WRKY family protein sequences to compare with the whole genome of cannabis， and identified 34 WRKY family members， which were unequally distributed on 9 chromosomes， and could be divided into 7 subfamilies， including GroupⅠ， GroupⅡa-GroupⅡe， and GroupⅢ， among which GroupⅠ had the largest number of members， with 11 members. CsWRKY15 contains the most domains， and CsWRKY34 has the most cisacting elements in the promoter region， so they may have more biological functions.The collinearity analysis between the WRKY family of cannabis and Arabidopsis thaliana， rice， maize， soybean and cannabis itself showed that CsWRKYs had rich phylogenetic relationships.This course lays a data foundation for exploring the biological function of cannabis WRKY family.

Keywords：industrial hemp; WRKY; physicochemical propertites of protein; homology analysis;

bioinformatics analysis

基金項(xiàng)目：黑龍江省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新跨越工程——經(jīng)濟(jì)作物突破性新品種選育及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用（GX23GG04）。

第一作者：張?jiān)埃?998-），男，碩士，研究實(shí)習(xí)員，從事工業(yè)大麻遺傳育種研究。E-mail：1965263812@qq.com。

通信作者：張利國(guó)（1978-），男，博士，研究員，從事麻類(lèi)遺傳基礎(chǔ)研究。E-mail：zlg86@aliyun.com。