摘 要： 旨在探究結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在體外培養(yǎng)體系中對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)和泌乳分化的調(diào)控作用。本研究主要通過人為添加結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor， CTGF）重組蛋白和過表達(dá)CTGF基因分析其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、乳脂和乳蛋白合成分泌及信號(hào)通路的影響。使用EdU試劑盒和流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)細(xì)胞增殖凋亡情況；應(yīng)用尼羅紅染料和甘油三酯試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量和細(xì)胞外培養(yǎng)液乳脂含量；實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞增殖凋亡，β酪蛋白，乳脂和乳蛋白合成關(guān)鍵信號(hào)分子以及細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞表面受體β1整聯(lián)蛋白的表達(dá)；免疫共沉淀分析CTGF和β1整聯(lián)蛋白之間的蛋白質(zhì)相互作用。結(jié)果表明：體外培養(yǎng)時(shí)，無(wú)論CTGF重組蛋白還是CTGF過表達(dá)均能通過增強(qiáng)增殖、抑制凋亡促進(jìn)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白免疫印跡結(jié)果表明，CTGF在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平增強(qiáng)促增殖的CyclinD1、MAPK和Bcl2表達(dá)，抑制促凋亡的Caspase3和Bax表達(dá)；CTGF一方面上調(diào)乳脂合成關(guān)鍵基因FASN、SREBP1、PPARγ表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂滴合成和胞外甘油三酯分泌；另一方面上調(diào)乳蛋白合成關(guān)鍵基因PRLR、STAT5和p-STAT5表達(dá)水平，進(jìn)而顯著促進(jìn)β酪蛋白合成；CTGF上調(diào)β1整聯(lián)蛋白表達(dá)水平，Co-IP也證實(shí)了CTGF和β1整聯(lián)蛋白之間存在蛋白質(zhì)相互作用。綜上所述，CTGF促進(jìn)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)及泌乳能力；CTGF與β1整聯(lián)蛋白共存于黏附復(fù)合物，可以通過影響β1整聯(lián)蛋白信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)其部分生物學(xué)作用。

關(guān)鍵詞： 奶牛；乳腺上皮細(xì)胞；CTGF；細(xì)胞生長(zhǎng)；乳脂；β-酪蛋白

中圖分類號(hào)：S823.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）08-3446-14

收稿日期：2024-01-23

基金項(xiàng)目：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)“學(xué)術(shù)骨干”項(xiàng)目（20XG13）

作者簡(jiǎn)介：王若薇（1999-），女，河北衡水人，碩士生，主要從事泌乳生物學(xué)與乳腺功能調(diào)控研究，E-mail：3029680795@qq.com

通信作者：趙 鋒，主要從事泌乳生物學(xué)與乳腺功能調(diào)控研究，E-mail： erjinzhi@126.com；王春梅，主要從事動(dòng)物生物化學(xué)研究與分子生物學(xué)研究，E-mail： wangcm-1@163.com

Connective Tissue Growth Factor Regulates the Growth and Differentiation of Cows Mammary

Epithelial Cells in Vitro

WANG" Ruowei1，3， XU" Xiyao1， TANG" Xiaona 1， WANG" Chunmei1，2*， ZHAO "Feng1*

（1.Key Laboratory of Dairy Science of Ministry of Education， College of Food Science， Northeast

Agricultural University， Harbin 150030，" China;

2.College of Life Sciences， Northeast Agricultural

University， Harbin 150030，" China;

3.College of Veterinary Medicine， Northeast Agricultural

University， Harbin 150030，" China）

Abstract：" This research aimed to explore how connective tissue growth factor influences the growth and lactation differentiation of mammary epithelial cells and the differentiation of lactation in dairy cows within an in vitro culture setting. The techniques employed involved examining the impact of CTGF recombinant protein and the heightened expression of CTG F on cellular growth， programmed cell death， production， and release of milk fat and protein， including their signaling routes. This was done using In this study， the effects of CTGF recombinant protein and overexpression of CTGF gene on cell proliferation， apoptosis， milk fat and milk protein synthesis and secretion and signaling pathways were analyzed." The EdU kit and flow cytometry were used to identify cell growthproliferation and programmed cell deathapoptosis; the Nile red dye and triglyceride kit were used to count intracellular lipid droplets and milk fat levels in the culture solution; qRT-PCR and Western blot were used to detect the expression of β-casein expression， crucial signaling molecules in milk fat and protein synthesis， and the extracellular matrix cell surface receptor β1 integrin. Furthermore， the protein interaction between CTGF and β1 integrin was examined using co-immunoprecipitation. In vitro culture， both CTGF recombinant protein and overexpression of CTGF were found to enhance the growth of adherent cells by promoting proliferation and inhibiting apoptosis. Real-time quantitative PCR and Western blot results demonstrated that CTGF upregulated the expression of pro-proliferative CyclinD1， MAPK， Bcl2， while downregulating the expression of pro-apoptotic Caspase3 and Bax at both transcriptional and translational levels. Furthermore， CTGF upregulated the expression levels of FASN， SREBP1， PPARγ key genes involved in milk fat synthesis-leading to increased intracellular lipid droplets synthesis and extracellular triglyceride secretion. Additionally， it also upregulated the expression levels of PRLR， STAT5， p-STAT5， the key genes involved in milk protein synthesis-significantly promoting β-casein synthesis. Moreover， CTGF was found to upregulate the expression level of β1 integrin with Co-IP confirming a protein interaction between CTGF and β1 integrin.（Conclusion） Ultimately， CTGF promoted the growth and lactating ability of cultured dairy cow mammary epithelial cells; CTGF coexists with β1 integrin in the adhesion complex and can achieve some of its biological effects by influencing the β1 integrin signaling pathway.

Key words： dairy cow; mammary epithelial cells; CTGF; cell growth; milk fat; β-casein

*Corresponding authors：ZHAO Feng， E-mail： erjinzhi@126.com; WANG Chunmei， E-mail： wangcm-1@163.com

結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor， CTGF），是一種富含半胱氨酸的多肽。不同種屬間CTGF基因及其編碼蛋白均表現(xiàn)出高度同源性，功能上具有相似性。CTGF有4個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中包括細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白（insulin-like growth factor binding proteins，IGFBPs）結(jié)構(gòu)域，可與纖連蛋白、胰島素樣生長(zhǎng)因子家族（insulin-like growth factors，IGFs）以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β家族（TGF-β）等蛋白家族直接物理性結(jié)合［1］。CTGF還可與細(xì)胞表面多種受體如整聯(lián)蛋白和脂蛋白受體相關(guān)蛋白等結(jié)合發(fā)揮其細(xì)胞生物學(xué)作用，目前尚未發(fā)現(xiàn)CTGF的特異性受體［2-3］。CTGF參與調(diào)控多種重要的生物學(xué)功能，包括細(xì)胞增殖分化和黏附等，同時(shí)又與一些病理狀況如纖維化疾病相關(guān)［4-5］。在某些情況下，CTGF可以發(fā)揮促進(jìn)有絲分裂的作用，但有時(shí)候又可以作為凋亡誘導(dǎo)因子而不是促有絲分裂劑［6-7］；CTGF作用于成纖維細(xì)胞，促進(jìn)其細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)合成與分泌以及胞外沉積。在正常生理狀態(tài)下，動(dòng)物體內(nèi)CTGF表達(dá)量很低或不表達(dá)，但在胚胎階段、骨發(fā)生發(fā)育過程中出現(xiàn)CTGF高表達(dá)，表明CTGF在不同生理階段和不同類型組織存在特異性表達(dá)調(diào)控［8-10］。

每次泌乳循環(huán)奶牛乳腺上皮細(xì)胞（dairy cow mammary epithelial cells，DCMECs）都要經(jīng)歷增殖、凋亡、分化這些過程［11-12］。DCMECs在生長(zhǎng)發(fā)育、泌乳分化以及維持泌乳階段的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化應(yīng)答等方面需要各種激素和細(xì)胞因子等的協(xié)助，包括催乳素（prolactin，PRL）、IGFs、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、TGF-β等［13-14］。研究人員發(fā)現(xiàn)CTGF在乳腺發(fā)育與泌乳中也起著重要作用。Wang等［15］運(yùn)用DNA微陣列分析檢測(cè)了添加催乳復(fù)合物（糖皮質(zhì)激素+胰島素+催乳素）誘導(dǎo)泌乳條件下小鼠乳腺內(nèi)不同基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)CTGF的表達(dá)量顯著上升，并通過試驗(yàn)表明CTGF是小鼠乳腺上皮細(xì)胞（HC11）泌乳分化所必需的。隨后，這個(gè)團(tuán)隊(duì)等進(jìn)一步證實(shí)了CTGF同樣有利于人乳腺上皮細(xì)胞（MCF10A）泌乳分化，推測(cè)CTGF促進(jìn)泌乳分化的部分機(jī)制是通過參與整聯(lián)蛋白復(fù)合物并且增強(qiáng)整聯(lián)蛋白功能實(shí)現(xiàn)的［16］。此后，在多項(xiàng)研究中都發(fā)現(xiàn)CTGF可以直接結(jié)合β1整聯(lián)蛋白，CTGF表達(dá)水平升高同樣會(huì)使β1整聯(lián)蛋白的表達(dá)升高［17-19］。

本課題組前期研究中證實(shí)了體外培養(yǎng)時(shí)，CTGF重組蛋白可增強(qiáng)DCMECs的催乳素信號(hào)途徑和β1整聯(lián)蛋白信號(hào)途徑，有利于β-酪蛋白合成分泌。本試驗(yàn)通過添加CTGF重組蛋白和過表達(dá)CTGF基因探究其調(diào)控DCMECs生長(zhǎng)特性和泌乳分化的生物學(xué)作用，并揭示與β1整聯(lián)蛋白信號(hào)途徑相關(guān)的CTGF作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

胎牛血清（MULTICELL）、DMEM/F12培養(yǎng)基（大連美侖生物技術(shù)有限公司）、CTGF（Fitzgerld）、Ⅰ型膠原酶（美國(guó) Sigma）、0.25%胰酶-EDTA消化液（美國(guó) Gibco）、尼羅紅（Nile Red）（美國(guó) Sigma）、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-氨基乙醇（ITS-X）（美國(guó)Gibco）、催乳素PRL（美國(guó)Abcam公司）、BeyoClickTM EdU-555細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒，（碧云天）、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（碧云天）、甘油三酯（TAG）檢測(cè)試劑盒（普利萊）、SDS-PAGE快速凝膠試劑盒（碧云天）、角蛋白18（CK-18）抗體、驢抗兔lgG/FITC二抗（Bioss）；β-actin、CyclinD1、β1整聯(lián)蛋白抗體（Santa Cruz）；Caspase3、Bax、Bcl2、FASN、SREBP1、PPARγ抗體、HRP-山羊抗鼠lgG抗體（ABclonal）、HRP-山羊抗兔lgG抗體（Cell Signaling Technology）；β酪蛋白、CTGF抗體（Bioss）；MAPK、STAT5、p-STAT5抗體（Cell Signaling）；PRLR抗體（Novusbio）、LipofectamineTM 2000（Lipo2000）脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen）、Protein A/G Magnetic Beads（MCE）、CTGF過表達(dá)載體構(gòu)建，（生工生物工程（上海）有限公司）、去內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA提取試劑盒（OMEGA）、 qRT-PCR定量試劑盒（Novoprotein）、細(xì)胞RNA提取試劑盒（Magen）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

本試驗(yàn)所用泌乳奶牛健康乳房組織經(jīng)黑龍江省東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)審查批準(zhǔn)后獲取。通過膠原酶消化法自乳腺實(shí)質(zhì)組織塊分離乳腺細(xì)胞貼壁培養(yǎng)，利用不同類型乳腺細(xì)胞對(duì)于胰酶消化的敏感性差異，純化出原代乳腺上皮細(xì)胞（離體后3代以內(nèi)），液氮凍存?zhèn)溆?。?fù)蘇傳代的DCMECs采用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)上皮細(xì)胞的分子標(biāo)志物CK-18來鑒定乳腺上皮細(xì)胞純度，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核。試驗(yàn)中保證所有細(xì)胞均在3～8代，貼壁生長(zhǎng)特性良好。為了確定細(xì)胞增殖檢測(cè)和誘導(dǎo)細(xì)胞泌乳分化的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制六孔板細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

分析CTGF重組蛋白作用時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80% 融合后，細(xì)胞分為兩組，一組為更換無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液（DMEM/F12+ITS-X+EGF）孵育的貼壁生長(zhǎng)基礎(chǔ)對(duì)照組細(xì)胞；另一組是在對(duì)照組培養(yǎng)液基礎(chǔ)上添加CTGF的處理組細(xì)胞（DMEM/F12+ ITS-X+EGF+CTGF）。培養(yǎng)液中CTGF終濃度為200 ng·mL-1，EGF終濃度為10 ng·mL-1。要進(jìn)行泌乳誘導(dǎo)的細(xì)胞同樣分為兩組，細(xì)胞更換為DIP（地塞米松+胰島素+催乳素）分化培養(yǎng)液，其中一組額外添加CTGF作為處理組細(xì)胞，另一組為泌乳誘導(dǎo)基礎(chǔ)對(duì)照組。培養(yǎng)液中CTGF終濃度為200 ng·mL-1，地塞米松、胰島素（以ITS-X形式）和催乳素終濃度均為200 ng·mL-1。

載體轉(zhuǎn)染過表達(dá)CTGF的DCMECs分組同上。

1.3 構(gòu)建CTGF過表達(dá)載體

委托生工生物工程（上海）有限公司構(gòu)建CTGF過表達(dá)載體，經(jīng)酶切與測(cè)序后獲得正確的質(zhì)粒，將其命名為pCDNA3.1+CTGF，并用去內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA提取試劑盒（OMEGA，美國(guó)）提取、純化質(zhì)粒，-20℃保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

將DCMECs傳于6孔板，細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，加入無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)液，使用Lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染。CTGF處理組：6 μL Lipo2000+94 μL pCDNA3.1+CTGF；空載對(duì)照組：6 μL Lipo2000+94 μL pCDNA3.1+；空白對(duì)照組：加入同體積無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染12 h后，更換添加ITS-X的無(wú)血清培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染24 h后，提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞增殖檢測(cè)

接種于6孔板的細(xì)胞長(zhǎng)至80％左右，CTGF添加組更換相應(yīng)培養(yǎng)液，CTGF過表達(dá)組轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體后也更換相應(yīng)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，按照碧云天EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說明書配制工作液，加入到6孔板中繼續(xù)孵育細(xì)胞2 h，然后依次洗滌、固定、通透細(xì)胞后加入反應(yīng)液室溫避光孵育30 min，最后用試劑盒中的Hoechst 33342進(jìn)行細(xì)胞核染色，隨后即可利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞增殖情況。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

接種于6孔板的細(xì)胞長(zhǎng)至80％左右，CTGF重組蛋白組更換相應(yīng)培養(yǎng)液，CTGF過表達(dá)組轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體后繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，按照碧云天細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明，胰酶消化6孔板細(xì)胞后收集到離心管里，離心重懸后依次加入 Annexin V-FITC結(jié)合液、Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液，室溫避光孵育20 min后即可上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 細(xì)胞內(nèi)脂滴檢測(cè)

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，以1×105個(gè)·mL-1細(xì)胞密度接種于6孔板（2 mL·孔-1）。待細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%，CTGF重組蛋白組更換相應(yīng)培養(yǎng)液，CTGF過表達(dá)組轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體，培養(yǎng)48 h后尼羅紅染色。具體步驟：細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS清洗2次，每次10 min；每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，室溫固定20 min；PBS清洗后，每孔加1 mL尼羅紅稀釋液（1 μg·mL-1），37℃避光孵育15 min。棄去尼羅紅染料，PBS清洗后加入DAPI（含抗熒光猝滅劑），然后在熒光顯微鏡下觀察染色情況。

1.7 細(xì)胞外乳脂分泌檢測(cè)

細(xì)胞處理同“1.6”，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行甘油三酯含量測(cè)定。按照普利萊甘油三酯測(cè)定試劑盒（E1003）說明，配置好工作液，應(yīng)用倍比稀釋法將4 mmol·L-1甘油標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為1 000、500、250、125、62.5 μmol·L-1，并設(shè)置濃度為0的對(duì)照組。在96孔板中，各測(cè)試組加入10 μL待測(cè)液，并加入190 μL工作液，37℃反應(yīng)15 min后用酶標(biāo)儀進(jìn)行波長(zhǎng)測(cè)定。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各個(gè)試驗(yàn)組的TAG濃度。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

細(xì)胞分組培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，首先根據(jù)試劑盒步驟提取RNA，然后將得到的RNA樣進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體步驟和體系如下：5×ABScriptIII RT Mix 4 μL，20×gDNA Remover Mix 1 μL，RNA 1 μg，Nuclease-free H2O補(bǔ)足至20 μL，在PCR儀上按照37℃ 2 min，55℃ 15 min，85℃ 5 min，4℃ Hold的反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后用qRT-PCR定量試劑盒檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)，反應(yīng)體系如下：2×NovoStartSYBR qPCR SuperMix Plus 10 μL，上游引物0.5 μmol·L-1，下游引物0.5 μmol·L-1，模板2 μL，ROXⅡ 0.4 μL，無(wú)RNA酶水補(bǔ)足至20 μL，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95℃ 1 min，95℃ 20 s，60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算。

根據(jù)GenBank上奶?；蛐蛄校捎肞rimer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)需要檢測(cè)表達(dá)的基因CDS區(qū)全長(zhǎng)引物及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）引物，列于表1。引物經(jīng)過Blast特異性比對(duì)后，送由生工生物公司合成。

1.9 蛋白免疫印跡

按照碧云天凝膠配置試劑盒配好分離膠和濃縮膠，應(yīng)用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)至0.22 μm的硝酸纖維素薄膜上，將NC膜置于脫脂乳中在搖床封閉2 h，然后一抗過夜孵育（所用抗體見主要試劑，1∶1 000稀釋），一抗清洗后在37℃搖床中孵育二抗1 h（1：10 000稀釋），TBST清洗后用發(fā)光液在UVITEC化學(xué)發(fā)光成像儀中捕獲蛋白條帶。

1.10 免疫共沉淀

利用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）檢測(cè)CTGF與β1整聯(lián)蛋白的蛋白質(zhì)相互作用。選用正常傳代生長(zhǎng)的DCMECs，細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳至6孔板，6孔板細(xì)胞長(zhǎng)滿后提取細(xì)胞總蛋白，即可進(jìn)行Co-IP試驗(yàn)。取30 μL的磁珠與400 μL β1整聯(lián)蛋白抗體稀釋液結(jié)合，結(jié)合后再加入400 μL的細(xì)胞裂解液，形成抗原-抗體-磁珠復(fù)合物，最后加入40 μL的1×SDS-PAGE Loading Buffer，分離磁珠，洗脫，提取免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）下來的蛋白復(fù)合物，按照蛋白免疫印跡步驟檢測(cè)靶蛋白β1整聯(lián)蛋白和共沉淀蛋白情況。

1.11 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

蛋白條帶圖應(yīng)用Image J軟件掃描灰度值，原始數(shù)據(jù)使用SPSS軟件進(jìn)行差異分析，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SE）”表示，樣本間差異性比較進(jìn)行t檢驗(yàn)或方差分析，使用GraphPad Prism 8軟件作圖，“ns”表示差異不顯著（Pgt;0.05），“*”表示差異顯著（Plt;0.05），“**”表示差異極顯著（Plt;0.01）。

2 結(jié) 果

2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞純化與鑒定

奶牛乳腺實(shí)質(zhì)組織塊經(jīng)膠原酶消化法獲得原代DCMECs培養(yǎng)1周左右，梭形的成纖維細(xì)胞較多，但能觀察到較少的乳腺上皮細(xì)胞（圖1Aa）；細(xì)胞經(jīng)胰酶純化后繼續(xù)培養(yǎng)可得到多角形，形態(tài)均一，細(xì)胞之間排列緊密，鵝卵石樣的單層DCMECs（圖1Ab）。通過細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)上皮細(xì)胞分子標(biāo)志角蛋白18（cytokeratin 18 ，CK18）的表達(dá)，綠色熒光標(biāo)識(shí)CK18，藍(lán)色熒光標(biāo)識(shí)細(xì)胞核（圖1B）。復(fù)蘇后的DCMECs生長(zhǎng)狀態(tài)良好，在接種1 d后開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在接種4 d后進(jìn)入平臺(tái)期，持續(xù)培養(yǎng)至6 d第6天，細(xì)胞數(shù)量仍趨于平穩(wěn)（圖1C）。

2.2 CTGF對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.2.1 添加CTGF重組蛋白對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

細(xì)胞傳至6孔板長(zhǎng)至80％左右，更換無(wú)血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后檢測(cè)細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示CTGF組的細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組（圖2A）。同樣，一部分細(xì)胞換液后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示CTGF組的細(xì)胞凋亡率顯著低于對(duì)照組（圖2B，Plt;0.05）。qRT-PCR檢測(cè)添加CTGF后相關(guān)基因表達(dá)，結(jié)果表明促進(jìn)細(xì)胞增殖MAPK、CyclinD1（圖2C，Plt;0.01）和抑制細(xì)胞凋亡Bcl-2基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著升高（圖2C，Plt;0.05），促細(xì)胞凋亡基因Bax和Caspase3基因表達(dá)量顯著下降（圖2C，Plt;0.05）。蛋白質(zhì)免疫印記檢測(cè)這些基因翻譯水平，結(jié)果顯示CTGF組的MAPK和CyclinD1蛋白表達(dá)均顯著升高，Caspase3蛋白表達(dá)量顯著下降（圖2D，Plt;0.01）， Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。

2.2.2 過表達(dá)CTGF對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

細(xì)胞傳至6孔板長(zhǎng)至80％左右進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染分組為pCDNA3.1+CTGF組、pCDNA3.1組和Blank組，轉(zhuǎn)染12 h后更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)檢驗(yàn)過表達(dá)載體是否過構(gòu)建成功。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pCDNA3.1+CTGF組的基因表達(dá)量顯著升高，表明過表達(dá)CTGF載體構(gòu)建成功，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)（圖3C，Plt;0.05）。驗(yàn)證成功后轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體，步驟同上，換液后培養(yǎng)24 h進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗(yàn)，結(jié)果表明，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CTGF過表達(dá)載體后促進(jìn)細(xì)胞增殖（圖3A）。細(xì)胞同樣處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染CTGF過表達(dá)載體后會(huì)抑制細(xì)胞凋亡（圖3B，Plt;0.05）。熒光定量檢測(cè)增殖凋亡相關(guān)基因表達(dá)，結(jié)果表明過表達(dá)CTGF后細(xì)胞增殖相關(guān)基因MAPK、CyclinD1和抑制細(xì)胞凋亡基因Bcl-2表達(dá)均顯著升高（圖3C，Plt;0.05），Bax和Caspase3基因表達(dá)量顯著下降（圖3C，Plt;0.05）。蛋白免疫印跡檢測(cè)這些基因蛋白表達(dá)， 結(jié)果顯示過表達(dá)CTGF組的CyclinD1、MAPK和Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著升高，Caspase3和Bax蛋白表達(dá)量顯著下降（圖3D，Plt;0.05）， Bax蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。

綜上所述，體外培養(yǎng)時(shí)，無(wú)論CTGF重組蛋白還是過表達(dá)CTGF基因都會(huì)通過增強(qiáng)細(xì)胞增殖來擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)量、抑制細(xì)胞凋亡來維持細(xì)胞存活，促進(jìn)DCMECs生長(zhǎng)。

2.3 CTGF對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳分化的影響

2.3.1 CTGF重組蛋白對(duì)乳脂和乳蛋白合成分泌的影響

細(xì)胞傳至6孔板長(zhǎng)至80％左右，更換為DIP分化培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h后進(jìn)行尼羅紅染色，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂滴合成分布情況。結(jié)果表明，紅色熒光信號(hào)增強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞增多，分布在胞質(zhì)內(nèi)的脂滴

增加（圖4A）。同步收集細(xì)胞培養(yǎng)液，檢測(cè)胞外乳脂分泌情況，結(jié)果表明，CTGF 重組蛋白組的甘油三酯含量升高（圖4B，Plt;0.01）。qRT-PCR檢測(cè)乳脂乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)，結(jié)果表明CTGF組的乳脂合成相關(guān)基因FASN、PPARγ、SREBP1表達(dá)顯著升高（圖4C，Plt;0.01），乳蛋白合成相關(guān)基因β-酪蛋白CSN2、PRLR和STAT5b的基因表達(dá)均顯著升高（圖4D，Plt;0.01），STAT5a的基因表達(dá)量無(wú)明顯變化。蛋白免疫印跡檢測(cè)這些基因蛋白表達(dá)， 結(jié)果顯示CTGF組的乳脂合成相關(guān)蛋白FASN、PPARγ、SREBP1表達(dá)量顯著升高（圖4E，Plt;0.01），乳蛋白合成相關(guān)蛋白β-酪蛋白casein、PRLR和p-STAT5的蛋白表達(dá)量顯著升高，STAT5的蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化，p-STAT5/STAT5的比值顯著升高（圖4F，Plt;0.01）。

2.3.2 過表達(dá)CTGF對(duì)乳脂和乳蛋白合成分泌相關(guān)基因表達(dá)的影響

細(xì)胞處理同“2.2.2”，轉(zhuǎn)染后更換無(wú)血清DIP分化培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后進(jìn)行尼羅紅染色，結(jié)果顯示，過表達(dá)CTGF后乳脂合成明顯增加（圖5A）。細(xì)胞同樣處理和培養(yǎng)時(shí)間，檢測(cè)胞外甘油三酯分泌情況。結(jié)果表明，過表達(dá)CTGF后胞外甘油三酯分泌量增多（圖5B，Plt;0.05）。qRT-PCR檢測(cè)過表達(dá)CTGF基因后乳脂乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)，結(jié)果表明過表達(dá)CTGF組的乳脂合成相關(guān)基因FASN的表達(dá)升高（圖5C，Plt;0.05），PPARγ、SREBP1基因表達(dá)均顯著升高（圖5C，Plt;0.05），乳蛋白合成相關(guān)基因β-酪蛋CSN2的表達(dá)顯著升高（圖5D，Plt;0.05），PRLR、STAT5a和STAT5b的基因表達(dá)均顯著升高（圖5D，Plt;0.05）。蛋白免疫印跡檢測(cè)這些基因蛋白表達(dá)，

結(jié)果顯示過表達(dá)CTGF組的乳脂合成相關(guān)蛋白FASN、PPARγ、SREBP1蛋白表達(dá)量顯著升高（圖5E，Plt;0.05），乳蛋白合成相關(guān)蛋白β-酪蛋白casein、PRLR和p-STAT5、STAT5的蛋白表達(dá)量顯著升高，STAT5的蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化，p-STAT5/STAT5的比值顯著升高（圖5F，Plt;0.05）。

綜上所述，體外培養(yǎng)時(shí)，無(wú)論添加CTGF重組蛋白還是過表達(dá)CTGF基因都會(huì)影響泌乳分化關(guān)鍵信號(hào)分子，促進(jìn)DCMECs生成乳脂和乳蛋白相關(guān)基因表達(dá)。

2.4 CTGF對(duì)β1整聯(lián)蛋白表達(dá)的調(diào)控

2.4.1 泌乳誘導(dǎo)條件下CTGF重組蛋白調(diào)控β1整聯(lián)蛋白表達(dá)

細(xì)胞處理同“2.3.1”，再培養(yǎng)細(xì)胞24 h后提取細(xì)胞總RNA，qRT-PCR檢測(cè)ITGB1基因表達(dá)量，再培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞總蛋白，蛋白免疫印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)量，得到的結(jié)果如圖6所示，添加CTGF后ITGB1的基因表達(dá)量（圖6A，Plt;0.01）和β1整聯(lián)蛋白的蛋白表達(dá)量（圖6B，Plt;0.01）均升高。

2.4.2 泌乳誘導(dǎo)條件下過表達(dá)CTGF調(diào)控β1整聯(lián)蛋白表達(dá)

細(xì)胞處理同“2.3.2”，轉(zhuǎn)染后12 h換液，更換為DIP分化培養(yǎng)基，再培養(yǎng)細(xì)胞24 h后提取細(xì)胞總RNA，qRT-PCR檢測(cè)ITGB1基因mRNA表達(dá)量，再培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞總蛋白，蛋白免疫印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)量，得到的結(jié)果如圖7所示，過表達(dá)CTGF后ITGB1基因的mRNA表達(dá)量（圖7A，Plt;0.05）和β1整聯(lián)蛋白表達(dá)量（圖7B，Plt;0.05）均升高。

2.5 CTGF與β1整聯(lián)蛋白的蛋白質(zhì)相互作用

按照步驟“2.3.2”處理細(xì)胞，用CTGF抗體和β1整聯(lián)蛋白抗體偶聯(lián)磁珠進(jìn)行Co-IP驗(yàn)證DCMEC中CTGF是否和β1整聯(lián)蛋白之間存在相互作用。免疫蛋白印跡結(jié)果如圖8所示，細(xì)胞總蛋白提取物Input組和免疫沉淀產(chǎn)物IP組中均檢測(cè)到靶蛋白β1整聯(lián)蛋白和共沉淀蛋白CTGF，而在同型IgG對(duì)照組CTGF和β1整聯(lián)蛋白均未檢測(cè)到，證實(shí)CTGF和β1整聯(lián)蛋白之間存在相互作用。

3 討 論

CTGF亦稱為細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)因子2（cellular com munication network factor 2，CCN2），屬于早期基因CCN家族成員。CCN蛋白家族的配體多種多樣，但影響最大、研究最多的配體當(dāng)屬整聯(lián)蛋白。CTGF對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡和分化的調(diào)控都有整聯(lián)蛋白的參與［20-21］。CCN蛋白-整聯(lián)蛋白連接可以實(shí)現(xiàn)多種生物功能，介導(dǎo)不同細(xì)胞信號(hào)通路，CCN蛋白可以和不同種類整聯(lián)蛋白結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合從而共同或獨(dú)立的發(fā)揮作用，并誘導(dǎo)不同細(xì)胞反應(yīng)［22-23］。DCMECs作為奶牛乳腺組織的主要細(xì)胞類型，是唯一可以合成和分泌乳成分的高度分化的功能細(xì)胞，產(chǎn)奶量由乳腺上皮細(xì)胞數(shù)目和分泌能力決定，它們是乳腺生物反應(yīng)器的靶細(xì)胞。出生后乳腺的生長(zhǎng)發(fā)育，無(wú)論是青春期樹狀導(dǎo)管網(wǎng)絡(luò)形成還是妊娠期小葉腺泡形成，都伴隨著乳腺組織結(jié)構(gòu)和乳腺上皮細(xì)胞數(shù)量的劇烈變化，以及增殖、凋亡相關(guān)基因表達(dá)量的明顯改變，這些影響著乳腺發(fā)育［24-27］。Hall-Glenn等［28］的研究表明CTGF可以通過整聯(lián)蛋白促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，Riley等［29］的研究也發(fā)現(xiàn)CTGF是小鼠胚胎細(xì)胞增殖再生必不可少的。此前的研究已經(jīng)充分了解證明CTGF會(huì)促進(jìn)細(xì)胞遷移和粘附，而此后的研究還發(fā)現(xiàn)CTGF會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞存活率，此過程涉及MAPK調(diào)控的通路，從而促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)［30-31］。Zhou等［19］在研究血管生成和凝血機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，CTGF會(huì)和整聯(lián)蛋白家族的一些成員相互作用，介導(dǎo)許多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、粘附、凋亡和細(xì)胞分化等活動(dòng)。這些研究成果表明，在許多類型細(xì)胞中CTGF可以通過整聯(lián)蛋白影響細(xì)胞增殖和凋亡。

奶牛乳腺完成泌乳分化后開始分泌全乳，乳脂和乳蛋白的生成量增多，這一過程依賴于乳腺上皮細(xì)胞與基底膜（特化的細(xì)胞外基質(zhì)）的相互作用，以及催乳復(fù)合物的刺激信號(hào)［32］。乳腺上皮細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用主要是由乳腺上皮細(xì)胞表面的細(xì)胞外基質(zhì)受體-整聯(lián)蛋白異二聚體介導(dǎo)［33］，整聯(lián)蛋白與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白結(jié)合形成多蛋白黏附復(fù)合物。β1整聯(lián)蛋白亞基可以與多種α亞基形成異二聚體，因此β1整聯(lián)蛋白是主要的整聯(lián)蛋白異二聚體形式。許多團(tuán)隊(duì)以及我們本實(shí)驗(yàn)室的前期研究已經(jīng)表明在小鼠和奶牛中，β1整聯(lián)蛋白對(duì)于乳腺上皮細(xì)胞泌乳分化是必要的［33］。Wang等［34］構(gòu)建CTGF過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入小鼠乳腺上皮細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的泌乳分化，并且轉(zhuǎn)染CTGF過表達(dá)質(zhì)粒后β1整聯(lián)蛋白的表達(dá)水平升高。這些研究發(fā)現(xiàn)結(jié)果表明，在小鼠乳腺上皮細(xì)胞中CTGF調(diào)控β1整聯(lián)蛋白表達(dá)，并且對(duì)泌乳分化均有顯著促進(jìn)作用，在DCMECs中尚未見相關(guān)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過人工添加以及構(gòu)建過表達(dá)載體的方式來探究CTGF對(duì)體外培養(yǎng)系統(tǒng)中的DCMECs生長(zhǎng)以及泌乳分化的影響。研究結(jié)果也表明，無(wú)論是添加CTGF重組蛋白還是過表達(dá)CTGF基因均對(duì)DCMECs生長(zhǎng)特性和乳蛋白乳脂合成分泌起到正向促進(jìn)作用，這與小鼠乳腺中的眾多試驗(yàn)結(jié)果一致。相同試驗(yàn)條件下單獨(dú)檢測(cè)β1整聯(lián)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)β1整聯(lián)蛋白表達(dá)上調(diào)，與泌乳性能增強(qiáng)正相關(guān)，同步的Co-IP試驗(yàn)證實(shí)了CTGF與β1整聯(lián)蛋白共存于蛋白復(fù)合物，驗(yàn)證了我們前期研究在β1整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的黏附復(fù)合物蛋白質(zhì)譜分析中檢測(cè)到CTGF的結(jié)果（數(shù)據(jù)未發(fā)表），這些試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明CTGF影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)催乳復(fù)合物的泌乳誘導(dǎo)效果，與β1整聯(lián)蛋白存在蛋白質(zhì)相互作用，進(jìn)而能夠調(diào)控體外培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)和乳脂乳蛋白合成分泌。CTGF是潛在的調(diào)控體外泌乳功能的關(guān)鍵生長(zhǎng)因子，下一步研究我們將驗(yàn)證CTGF對(duì)于乳成分跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控作用以及β1整聯(lián)蛋白信號(hào)途徑對(duì)其多種生物學(xué)作用是否都是必不可少的。

4 結(jié) 論

在體外培養(yǎng)體系中，DCMECs貼壁生長(zhǎng)時(shí)，CTGF調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡信號(hào)分子，促進(jìn)增殖抑制凋亡，在經(jīng)典催乳復(fù)合物誘導(dǎo)DCMECs泌乳分化時(shí)，CTGF能夠協(xié)同調(diào)控乳脂和乳蛋白合成關(guān)鍵信號(hào)分子，增強(qiáng)細(xì)胞泌乳分化；CTGF可以通過與β1整聯(lián)蛋白之間的蛋白質(zhì)相互作用實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)作用。

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（編輯 郭云雁）