［摘 要］ 目的：探討鹿茸多肽 （VAP） 對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥 （PMOP） 模型大鼠的保護作用，并闡明其可能的作用機制。方法：60只12周齡SD雌性大鼠隨機分為假手術組、模型組、阿侖膦酸鈉組（1 mg·kg-1·d-1 阿侖膦酸鈉灌胃）、低劑量VAP 組（100 mg·kg-1·d-1VAP 灌胃）、中劑量VAP 組（200 mg·kg-1·d-1 VAP 灌胃） 和高劑量VAP 組（300 mg·kg-1·d-1 VAP 灌胃），每組10 只。除假手術組外，其余各組大鼠摘除雙側(cè)卵巢，復制PMOP 大鼠模型。雙能X 射線骨密度儀檢測各組大鼠股骨骨密度（BMD），酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 法檢測各組大鼠血清中血鈣（Ca2+）、血磷（P）、骨堿性磷酸酶（BALP） 和Ⅰ型前膠原N 端前肽（PINP） 水平，采用相關試劑盒檢測各組大鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD） 活性和丙二醛（MDA） 水平， HE 染色法觀察各組大鼠骨組織病理形態(tài)表現(xiàn)，Western blotting 法檢測各組大鼠骨組織中磷脂酰肌醇-3 激酶（PI3K）、磷酸化PI3K （p-PI3K）、蛋白激酶B（AKT） 和磷酸化AKT （p-AKT） 蛋白表達水平。結果：與假手術組比較，模型組大鼠股骨BMD 降低（Plt;0. 01）；與模型組比較，阿侖膦酸鈉組、中劑量VAP 組和高劑量VAP 組大鼠股骨BMD升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。與假手術組比較，模型組大鼠血清中Ca2+、P、BALP 及PINP 水平和SOD 活性降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），MDA 水平升高（Plt;0. 01）；與模型組比較，中劑量VAP 組大鼠血清中P 水平升高（Plt;0. 01），阿侖膦酸鈉組和高劑量VAP 組大鼠血清中Ca2+、P、BALP 及PINP 水平和SOD 活性升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），MDA 水平降低（Plt;0. 05）。HE 染色，與假手術組比較，模型組大鼠骨組織中骨小梁纖細，大片斷裂，髓腔擴大；與模型組比較，阿侖膦酸鈉組、中劑量VAP 組和高劑量VAP 組大鼠骨組織中骨小梁粗壯，排列緊密，骨細胞數(shù)量多。Western blotting法，與假手術組比較，模型組大鼠骨組織中p-PI3K/PI3K 和p-AKT/AKT 比值降低（Plt;0. 01）；與模型組比較，各劑量VAP 組大鼠骨組織中p-PI3K/PI3K 比值升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），阿侖膦酸鈉組和高劑量VAP組大鼠骨組織中p-AKT/AKT比值升高 （Plt;0. 01）。結論：VAP對大鼠PMOP具有改善作用，其機制可能與VAP 調(diào)控骨組織中PI3K/AKT 信號通路及降低骨組織氧化應激有關。

［關鍵詞］ 骨質(zhì)疏松癥； 鹿茸多肽； 氧化應激； 磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B 信號通路

［中圖分類號］ R285. 5； R589； R681 ［文獻標志碼］ A

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis， OP） 分為原發(fā)性OP 和繼發(fā)性OP， 原發(fā)性OP 包括絕經(jīng)后OP（postmenopausal osteoporosis，PMOP）、老年性OP和特發(fā)性OP［1］。據(jù)報道，近 10 年全國 OP 的發(fā)病率為 23%， 男性和女性的發(fā)病率分別為 16% 和27% ［2］。 目前 OP 已經(jīng)成為世界性的公共衛(wèi)生問題。隨著人口老齡化趨勢日益嚴重，PMOP 患者的患病率逐年上升。絕經(jīng)后的婦女隨著年齡的增長，雌激素不斷流失，骨量丟失會加快，骨形成速率降低，同時骨質(zhì)量會下降，最終導致骨脆性增加，危害女性患者的健康，影響其生活質(zhì)量，增加了社會負擔［3］。氧化應激是由于活性氧（reactive oxygenspecies，ROS） 在機體內(nèi)產(chǎn)生和消除平衡被打破，進而產(chǎn)生超正常水平的 ROS， 導致機體細胞損傷和細胞凋亡，最終對細胞的功能產(chǎn)生影響從而發(fā)展成不同類型的疾?。?］。研究［5］ 顯示： 氧化應激標志物水平升高時，骨量會降低。鹿茸是鹿科動物額外脊上生長的一種附屬性器官，在我國有著悠久的藥用歷史記載［6］。 鹿茸多肽（velvet antlerpolypeptide，VAP） 是鹿茸的主要生理活性物質(zhì)和藥用活性成分。本課題組前期研究［7-8］ 顯示：聚丙交酯-乙交酯微球搭載VAP 對PMOP 大鼠模型具有明顯的保護作用； 在骨重建過程中， VAP 能夠使成骨細胞成熟， 同時促進軟骨細胞形成。 研究［9］顯示：VAP 對PMOP 大鼠具有預防作用，但是其具體的作用機制目前尚不明確。本研究通過探討VAP 對PMOP 大鼠的影響，以闡明VAP 抗氧化應激進而保護PMOP 的作用機制，為臨床采用VAP治療PMOP 提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物、主要試劑和儀器

12周齡SPF級SD 大鼠60 只，雌性，體質(zhì)量180～220 g，購自吉林省長春市億斯實驗動物技術有限責任公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK （吉） 2020-0002。本研究所用實驗動物操作均遵守實驗動物倫理保護法，并經(jīng)過長春中醫(yī)藥大學實驗倫理委員會批準通過（倫理批準號：2020232）。實驗用大鼠的飼養(yǎng)、給藥、模型制備和模型制備后的組織取材均在長春中醫(yī)藥大學實驗動物中心進行，動物使用許可證號：SYXK（吉） 2018-0014。 大鼠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境設施中，24 h 自由飲食飲水， 動物飼料、墊料和飲用水消毒滅菌處理后使用，籠具及墊料定期由專人清理和更換。VAP由長春中醫(yī)藥大學藥學院制備，每1 g VAP約含生藥鹿茸28. 9 g， 批號： 20201120。阿侖膦酸鈉（ 杭州默沙東制藥有限公司， 批號：H20160100），血鈣（calcium，Ca2+） 檢測試劑盒、血磷（phosphorus， P） 檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 活性檢測試劑盒和丙二醛（malondialdehyde， MDA） 檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司， 貨號： BC0725、BC1655、BC0175 和BC0025），大鼠骨堿性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，BALP） 和大鼠Ⅰ型前膠原N 端前肽（procollagen of type Ⅰ N-terminalpropeptide， PINP） 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinkedimmunosorbent assay，ELISA） 檢測試劑盒（江蘇酶免生物科技有限公司，貨號：MM-0619R1和MM-20710R1）， BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司， 貨號： P0012），磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K） 抗體和磷酸化PI3K （phosphorylated PI3K，p-PI3K） 抗體（英國Abcam 公司，貨號：ab86714和ab182651）， 蛋白激酶B （protein kinase B，AKT） 抗體和磷酸化AKT （phosphorylated AKT，p-AKT） 抗體（美國 CST 公司， 貨號： 4691s 和4060s）。骨密度儀（美國HOLOGIC 公司， 型號：Discovery Wi）， 多功能微孔酶標儀（美國賽默飛世爾科技公司，型號：Multiskan FC），生物顯微鏡（德國LEICA 公司， 型號： DM250）， 電泳儀（美國Bio-Rad 公司，型號：BE6085），多功能化學發(fā)光成像儀（英國UVltec公司，型號：Q9-Aliance）。

1. 2 實 驗 動 物 分 組 和 PMOP 模 型 制 備

60 只SD 大鼠適應性喂養(yǎng)3 d 后隨機分為假手術組、模型組、阿侖膦酸鈉組、低劑量VAP 組、中劑量VAP組和高劑量VAP 組，每組10 只。各組大鼠腹腔注射麻醉后，除假手術組外，其余各組大鼠行摘除雙側(cè)卵巢手術， 復制PMOP 大鼠模型， 術后腹腔注射青霉素鈉，避免傷口感染。假手術組大鼠在上述相同的位置行切開手術但不摘除卵巢，其余操作同上。造模后，低、中和高劑量VAP 組大鼠分別灌胃給予100、200 和300 mg·kg-1·d-1 VAP，假手術組大鼠給予等體積的生理鹽水灌胃，阿侖膦酸鈉組大鼠給予阿侖膦酸鈉2 mg·kg-1·d-1 灌胃， 持續(xù)90 d。末次給藥2 h 后，大鼠麻醉后行腹主動脈取血，按組別分裝好血清，?80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 雙能 X射線骨密度儀檢測各組大鼠股骨骨密度（bone mineral density， BMD）

處死各組大鼠后，取右側(cè)股骨組織約1 cm，采用雙能X 射線骨密度儀按照儀器說明書操作檢測各組大鼠股骨BMD。

1. 4 ELISA 法 檢 測 各 組 大 鼠 血 清 中 Ca2+ 、P、BALP 和 PINP 水 平

取 各 組 大 鼠 血 清 ， 按 照ELISA 試劑盒說明書中的方法分別檢測各大鼠血清中Ca2+ 、P、BALP 和PINP 水平（單位分別為mmol·L-1、mmol·L-1、μg·L-1 和μg·L-1）。

1. 5 采用試劑盒檢測各組大鼠血清中SOD活性和MDA水平

取各組大鼠血清， 按照試劑盒說明書中的方法分別檢測各組大鼠血清中SOD 活性（U·mL-1） 和MDA 水平（μmol·L-1）。

1. 6 HE 染色觀察各組大鼠骨組織病理形態(tài)表現(xiàn)

實驗完成后，剝離各組大鼠的股骨，采用 4%多聚甲醛固定，將固定好的骨組織放入脫鈣液中浸泡脫鈣24 h， 分別加入酒精梯度脫水， 二甲苯透明，石蠟包埋制成石蠟切片。經(jīng)過HE 染色，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察各組大鼠骨組織病理形態(tài)表現(xiàn)并拍照。

1. 7 Western blotting 法檢測各組大鼠骨組織中p-PI3K

PI3K、p-AKT和AKT蛋白表達水平 將凍存的各組大鼠股骨組織取出，常溫靜置解凍，剪碎后于勻漿管中裂解、勻漿和破碎，取上清液采用BCA 法測定蛋白濃度； 配制電泳液和轉(zhuǎn)膜液， 配膠、上樣、轉(zhuǎn)膜、5% 脫脂奶粉封閉，剪膜，加一抗搖床過夜，室溫孵育二抗，ECL 顯色，以β-actin為內(nèi)參，采用凝膠成像系統(tǒng)進行分析并保存，采用Image J 圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β -actin 蛋白條帶灰度值。同時計算p-PI3K/PI3K 和p-AKT/AKT 比值。

1. 8 統(tǒng)計學分析

采用 SPSS 22. 0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組大鼠股骨BMD，各組大鼠血清中Ca2+、P、BALP、PINP 和MDA 水平及SOD 活性， 各組大鼠骨組織中p-PI3K/PI3K 和p-AKT/AKT 比值均符合正態(tài)分布，以-x±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2. 1 各組大鼠股骨BMD

與假手術組比較，模型組大鼠股骨BMD 降低（Plt;0. 01）； 與模型組比較，阿侖膦酸鈉組、中劑量VAP 組和高劑量VAP 組大鼠股骨 BMD 升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見表1。

2. 2 各組大鼠血清中 Ca2+、P、BALP 和 PINP水平

與假手術組比較，模型組大鼠血清中Ca2+、P、BALP 和PINP 水平降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）；與模型組比較，中劑量VAP 組大鼠血清中P 水平升高（Plt;0. 01）， 阿侖膦酸鈉組和高劑量VAP 組大鼠血清中Ca2+、P、BALP 和PINP 水平升高（Plt;0. 05）。見表2。

2. 3 各組大鼠血清中

SOD活性和 MDA水平 與假手術組比較， 模型組大鼠血清中SOD 活性降低（Plt;0. 05）， MDA 水平升高（Plt;0. 01）； 與模型組比較，阿侖膦酸鈉組和高劑量VAP 組大鼠血清中 SOD 活性升高（Plt;0. 05）， MDA 水平降低（Plt;0. 05）。見表3。

2. 4 各組大鼠骨組織病理形態(tài)表現(xiàn)

HE染色顯微鏡下觀察：假手術組大鼠骨小梁粗壯，骨細胞分布均勻，結構緊密；與假手術組比較，模型組大鼠骨組織中骨小梁細小，出現(xiàn)大面積斷裂，髓腔變大，骨細胞排列不均勻；與模型組比較，阿侖膦酸鈉組和高劑量VAP 組大鼠骨組織中骨小梁更為粗壯，髓腔變小。見圖1。

2. 5 各組大鼠骨組織中 p-PI3K/PI3K 和 p-AKT/AKT比值

與假手術組比較，模型組大鼠骨組織中p-PI3K/PI3K 和p-AKT/AKT 比值降低（Plt;0. 01）；與模型組比較，各劑量VAP 組大鼠骨組織中p-PI3K/PI3K 比值升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），阿侖膦酸鈉組和高劑量VAP 組大鼠骨組織中p-AKT/AKT 比值升高（Plt;0. 01）。見圖2 和表4。

3 討 論

目前， 我國PMOP 發(fā)病率不斷升高［10］。臨床治療PMOP 的常用藥物主要包括二膦酸鹽和鍶鹽等，但是長期應用機體對該類藥物的耐藥性增加，同時可能伴隨著多種不良反應［11］。在我國治療骨病的歷史中，中醫(yī)藥發(fā)揮了重要作用，鹿茸是其中的核心藥材之一，多年來在臨床上廣泛應用且未見明顯的不良反應［12］。VAP 作為鹿茸的主要藥效成分， 對多種原因引起的OP 具有明顯的保護作用。本研究采用摘除雙側(cè)卵巢的方法復制大鼠PMOP模型，與假手術組比較，模型組大鼠股骨BMD 降低，股骨組織中的骨小梁整體排布紊亂，骨小梁變細， 有部分已經(jīng)斷裂， 表明PMOP 動物模型建立成功。

MDA 是一種氧化應激因子，可反映機體的氧化損傷程度，對于機體細胞有一定的毒性［13］。SOD 活性和MDA 水平可以作為正常機體評判氧化應激程度的指標，SOD 在機體內(nèi)起到清除ROS 的作用， 以此減輕機體的氧化應激損傷［14］。本研究結果顯示：PMOP 大鼠給予VAP 干預后，血清中SOD 活性升高， MDA 水平降低， 且呈劑量依賴性，表明VAP 對PMOP 具有治療作用，且其作用機制可能與抗氧化應激有關。

PI3K 是存在于細胞中的一種信號轉(zhuǎn)導分子，具有磷脂酰肌醇激酶的活性，多種來自于細胞外信號的刺激、激素和氧化環(huán)境等均可對PI3K 產(chǎn)生激活作用［15］。AKT 是PI3K 的重要載體， AKT 活化后可以促進參與相關細胞生長和凋亡的蛋白質(zhì)磷酸化， 進而傳達細胞生長信號［16］。PI3K/AKT 信號通路參與細胞的存活和代謝等多種生理過程 ［17］，作為調(diào)控成骨細胞和破骨細胞功能的信號通路網(wǎng)的中心，對維持骨質(zhì)疏松癥骨組織動態(tài)平衡具有重要作用［18］。研究［19］ 表明：PI3K/AKT 信號通路可以促進成骨細胞的增殖、分化和骨形成進而達到抑制OP 的目的。研究［20-22］ 顯示：地塞米松可以通過下調(diào)p-PI3K 的表達進而抑制成骨細胞和MC3ET3-E1細胞中PI3K/AKT 信號通路的激活， 最終抑制細胞增殖并誘導其凋亡；給予PI3K/AKT/mTOR 信號通路抑制劑LY294002 干預后， PI3K 和p-AKT表達水平均降低，表明PI3K/AKT/mTOR 通路在體外成骨的過程中發(fā)揮了積極的調(diào)節(jié)作用。激活PI3K/AKT 信號通路可對成骨細胞表達VEGF 發(fā)揮誘導的作用，進而加速血管的形成過程，同時提高BMD，增加骨形成，發(fā)揮治療OP 的作用［23-24］。本研究結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠骨組織中p-PI3K/PI3K 和p-AKT/AKT 比值降低，說明PMOP 的發(fā)生與PI3K/AKT 信號通路有關； 經(jīng)過VAP 給藥干預后， 大鼠骨組織中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT 比值升高， 表明PI3K/AKT 信號通路被激活， 進一步證明VAP 可有效激活PI3K/AKT 信號通路，進而促進骨形成，發(fā)揮治療PMOP的作用。

綜上所述， VAP 對PMOP 大鼠具有明顯的保護作用，并且其效果可能與VAP 劑量有一定關聯(lián)，其抗PMOP 的作用機制可能通過介導PI3K/AKT信號通路途徑對抗氧化應激過程進而實現(xiàn)骨保護作用。但PMOP 的發(fā)生機制復雜， 由多種因素共同參與，因此VAP 通過PI3K/AKT 信號通路發(fā)揮抗PMOP 的作用機制有待進一步研究。

利益沖突聲明：

所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：

遲雪婷參與實驗方案設計、數(shù)據(jù)整理分析和論文撰寫，陳芳園、皮子鳳、律廣富、王雨辰和李銀清參與實驗操作和數(shù)據(jù)收集，黃曉巍和林喆參與實驗設計指導和論文審校。

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[基金項目] 吉林省科技廳科技發(fā)展計劃項目（20210101200JC）；吉林省發(fā)改委創(chuàng)新能力建設項目（2021C011）；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（202210199049）