［摘 要］ 目的：探討芒果苷 （MGF） 通過(guò)調(diào)控Wnt/β-連環(huán)蛋白 （β-catenin） 信號(hào)通路對(duì)大鼠髖部骨折愈合的作用，闡明其相關(guān)作用機(jī)制。方法：建立SD大鼠髖部骨折模型，造模成功后將大鼠分為模型組、MGF 組和MGF+XAV-939 （Wnt/β-catenin 信號(hào)通路抑制劑） 組， 另設(shè)假手術(shù)組， 每組15 只。術(shù)后第1 天各組大鼠按分組方法給予MGF 或XAV-939 干預(yù)，每2 d 給藥1 次，共14 次。采用Lane-Sandhu X 射線評(píng)分法評(píng)估術(shù)后第2 和4 周各組大鼠骨折愈合情況， 顯微CT （Micro CT） 檢測(cè)各組大鼠骨顯微結(jié)構(gòu)參數(shù)骨體積（BV）、骨小梁數(shù)量（Tb. N）、骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV） 和骨小梁厚度（Tb. Th），HE 染色觀察各組大鼠骨痂組織形態(tài)表現(xiàn)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 法檢測(cè)各組大鼠血清中成骨標(biāo)志物骨堿性磷酸酶（BALP） 和Ⅰ型前膠原N 端前肽（PINP） 及破骨標(biāo)志物抗酒石酸酸性磷酸酶5b （TRACP-5b） 和Ⅰ型膠原羧基末端肽（CTX） 水平，Western blotting 法檢測(cè)各組大鼠骨痂組織中β-catenin、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 （Runx2） 和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 （BMP-2） 蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠骨折后第2和4周骨折線清晰，骨折部位存在較多纖維組織，未發(fā)現(xiàn)骨性骨痂，Lane-Sandhu X 射線評(píng)分及骨顯微結(jié)構(gòu)參數(shù)BV、Tb. N、BV/TV 和Tb. Th 均降低（Plt;0. 05）， 血清中BALP 水平降低（Plt;0. 05）， PINP、TRACP-5b 和CTX 水平升高（Plt;0. 05），骨痂組織中β-catenin、Runx2 和BMP-2 蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 05）。與模型組比較，MGF 組大鼠骨折后第2 周新生骨痂明顯增多，第4 周骨折線基本消失，骨折愈合較快，骨折部位大量纖維組織被骨組織替代，骨性骨痂量明顯增多，Lane-Sandhu X 射線評(píng)分及骨顯微結(jié)構(gòu)參數(shù)BV、Tb. N、BV/TV和Tb. Th 均升高（Plt;0. 05）， 血清中BALP 水平升高（Plt;0. 05）， PINP、TRACP-5b 和CTX 水平降低（Plt;0. 05）， 骨痂組織中 β -catenin、 Runx2 和 BMP-2 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05）。與MGF 組比較，MGF+XAV-939 組大鼠骨折后第2 和4 周骨折部位僅有少量新生骨痂，髓腔未形成，Lane-Sandhu X 射線評(píng)分及骨顯微結(jié)構(gòu)參數(shù)BV、Tb. N、BV/TV 和Tb. Th 均降低（Plt;0. 05），血清中BALP 水平降低（Plt;0. 05），PINP、TRACP-5b 和CTX 水平升高（Plt;0. 05），骨痂組織中β-catenin、Runx2和BMP-2蛋白表達(dá)水平降低 （Plt;0. 05）。結(jié)論：MGF可促進(jìn)大鼠髖部骨折愈合，其作用機(jī)制可能與激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 芒果苷； 髖部骨折； 愈合； XAV-939； Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路

［中圖分類號(hào)］ R285.5； R683 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

髖關(guān)節(jié)骨折多發(fā)于骨質(zhì)疏松的中老年人群，也可因外力損傷導(dǎo)致， 髖關(guān)節(jié)是全身最大的球窩關(guān)節(jié)， 骨折后導(dǎo)致關(guān)節(jié)面參差不齊， 在影響關(guān)節(jié)活動(dòng)的同時(shí)可引發(fā)關(guān)節(jié)炎［1］。對(duì)于輕度無(wú)位移的髖關(guān)節(jié)骨折可采用牽引治療， 嚴(yán)重的髖關(guān)節(jié)損傷則需手術(shù)干預(yù)，但術(shù)后常伴有切口感染和肺部并發(fā)癥等風(fēng)險(xiǎn)而影響預(yù)后［2-3］，因此尋找一種有效藥物進(jìn)行輔助治療以減少手術(shù)概率很有必要。芒果苷（mangiferin， MGF） 主要存在于芒果的果實(shí)、樹(shù)葉、樹(shù)皮以及射干等植物的花和葉中， 具有降血脂、降血糖、護(hù)肝、抗凋亡和抗炎等藥理作用，因其安全性高和無(wú)不良反應(yīng)被廣泛應(yīng)用于臨床［4-6］。研究［7］ 表明：MGF 可通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和抑制破骨吸收改善小鼠骨質(zhì)疏松，但MGF 在髖部骨折愈合過(guò)程中是否能發(fā)揮作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)復(fù)制大鼠髖部骨折模型并給予MGF 干預(yù)，觀察MGF 對(duì)大鼠髖部骨折愈合過(guò)程的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器

SPF 級(jí) 雄 性SD 大鼠60 只，10 月齡，購(gòu)自斯貝福（北京） 生物技術(shù)有限公司， 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)： SCXK（京） 2019-0010，于室溫22 ℃～24 ℃、濕度50%～60% 和12 h 明/暗交替的控制環(huán)境中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。MGF 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，Wnt/β - 連環(huán)蛋白（β -catenin） 信號(hào)通路抑制劑XAV-939 購(gòu)自美國(guó)Selleck 公司，HE 染色試劑盒和RIPA 裂解緩沖液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所，大鼠骨堿性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，BALP）、Ⅰ型前膠原N 端前肽（type Ⅰ procollagenN-terminal propeptide，PINP）、抗酒石酸酸性磷酸酶5b （tartrate resistant acid phosphatase-5b，TRACP-5b） 和Ⅰ 型膠原羧基末端肽（carboxyterminalpeptide of type Ⅰ collagen， CTX） 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒購(gòu)自武漢基因美生物科技有限公司，抗β -catenin、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 （Runtassociated transcription factor 2， Runx2） 和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 （bone morphogenetic protein-2，BMP-2）抗體購(gòu)自江蘇親科生物研究中心有限公司。X 線攝片機(jī)購(gòu)自日本Koda 公司，顯微CT （Micro CT） 購(gòu)自瑞士SCANCO 公司，GelDoc XR System 凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD 公司，全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司。

1. 2 髖部骨折大鼠模型制備和分組

按照參考文獻(xiàn)［8］ 中的方法建立髖部骨折大鼠模型，具體操作如下： 大鼠異氟烷吸入麻醉后仰臥固定于操作臺(tái)，緊貼左后肢大粗隆位置放置打擊器鈍骨刀，使砝碼從20 cm 處自由落下，打擊髖關(guān)節(jié)造成髖骨骨折。大鼠麻醉復(fù)蘇后繼續(xù)分籠飼養(yǎng)， 自由進(jìn)食飲水，不限制活動(dòng)。X 射線檢測(cè)大鼠髖關(guān)節(jié)骨折線清晰視為造模成功。將建模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、MGF 組和MGF+XAV-939 組， 每組15 只，另設(shè)置假手術(shù)組大鼠15 只，假手術(shù)組大鼠不使用砝碼打擊，其他建模步驟同模型組大鼠。其中MGF 組和MGF+XAV-939 組大鼠從術(shù)后第1 天開(kāi)始，于骨折局部皮下軟組織內(nèi)注射200 μL MGF （10 μmol·L-1）和（或） XAV-939 （1 g·L-1），每2 d 給藥1 次，連續(xù)干預(yù)28 d 后取材進(jìn)行檢測(cè)，假手術(shù)組和模型組大鼠注射等量生理鹽水。

1. 3 Lane-Sandhu X 射線評(píng)分法評(píng)估各組大鼠骨折愈合情況

各組大鼠術(shù)后第2和4周采用X射線檢查左后肢髖部骨折部位， 通過(guò) Lane-SandhuX 射線評(píng)分法評(píng)估各組大鼠骨折愈合情況。Lane-Sandhu X 射線評(píng)分法包括骨形成、骨連接和骨塑形3 個(gè)方面11 項(xiàng)內(nèi)容。骨形成：0 分為無(wú)骨形成， 1 分為骨形成占骨缺損lt;25%， 2 分為骨形成占骨缺損25%～50%， 3 分為骨形成占骨缺損51%～75%， 4 分為骨形成占骨缺損gt;75%。骨連接： 0 分為骨折線清楚， 2 分為骨折線部分存在，4 分為骨折線消失。骨塑形： 0 分為未見(jiàn)骨塑形，2 分為骨髓腔形成，4 分為皮質(zhì)骨塑形。最終評(píng)分越高表明骨折愈合情況越好。每只大鼠評(píng)分為骨形成、骨連接和骨塑形3 部分評(píng)分之和。

1. 4 Micro CT檢測(cè)各組大鼠骨顯微結(jié)構(gòu)參數(shù)

將各組大鼠骨折部位標(biāo)本置于Micro CT 分析專用掃描筒內(nèi)， 調(diào)整高斯濾鏡參數(shù)， 設(shè)置為 σ=1. 2，support=1， 設(shè)定閾值為205～1 000， 以便區(qū)分骨組織和其他物質(zhì)。將骨折端骨痂組織設(shè)定為感興趣區(qū)域（volume of interest，VOI），并在VOI 內(nèi)進(jìn)行定量分析， 骨顯微結(jié)構(gòu)參數(shù)包括骨體積（bonevolume， BV）、 骨小梁數(shù)量（number of bonetrabeculae， Tb. N）、 骨體積分?jǐn)?shù)（bone volumefraction，BV/TV） 和骨小梁厚度（bone trabeculaethickness， Tb. Th）， 觀察新生骨質(zhì)在微觀結(jié)構(gòu)上的差異。

1. 5 HE 染色觀察各組大鼠骨痂組織病理形態(tài)表現(xiàn)

取各組大鼠骨折部位骨痂組織標(biāo)本，4% 中性甲醛溶液固定48 h， 放置于14. 5% 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetie acid， EDTA） 溶液中脫鈣4 周。脫鈣后的組織經(jīng)過(guò)沖洗、梯度酒精脫水和石蠟包埋等處理， 沿長(zhǎng)軸冠狀面方向制作成5 μm 厚的組織切片， 行常規(guī)HE 染色， 顯微鏡下觀察骨痂組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1. 6 ELISA 法檢測(cè)各組大鼠血清中成骨和破骨標(biāo)志物水平

經(jīng)大鼠腹主動(dòng)脈收集血液后分離血清，按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)要求檢測(cè)各組大鼠血清中成骨標(biāo)志物BALP 和PINP 及破骨標(biāo)志物TRACP-5b 和CTX 水平。

1. 7 Western blotting法檢測(cè)各組大鼠骨痂組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

取各組大鼠骨折部位骨痂組織，加入RIPA 裂解緩沖液用組織研磨器研磨勻漿后， 提取總蛋白并定量變性。取10 μL 總蛋白加入預(yù)制好的15% 聚丙烯酰胺凝膠中， 先用80 V 電壓分離30 min， 然后再調(diào)至120 V 分離1. 5 h。半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride， PVDF） 膜上（16 V，16 min）。室溫下5% 的脫脂奶粉封閉1 h，用含有目的蛋白抗體的一抗稀釋液（β-catenin， 兔 抗，1∶ 1 000 稀釋； Runx2， 兔抗， 1∶ 1 000 稀釋；BMP-2， 兔抗， 1∶ 1 000 稀釋； β -actin， 鼠抗，1∶ 1 000 稀釋） 于4 ℃冰箱搖床上孵育過(guò)夜。TPS漂洗3 次，每次10 min；用含辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗（1∶ 10 000） 稀釋液室溫下孵育1 h。TPS 洗滌3 次， 每次10 min， 加入ECL 顯色液用Gel-Doc XR System 凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。以β-actin作為內(nèi)參，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1. 8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 17. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠Lane-Sandhu X 射線評(píng)分，骨顯微結(jié)構(gòu)參數(shù)BV、Tb. N、BV/TV 和Tb. Th值，血清中 BALP、PINP、TRACP-5b 和 CTX 水平，骨痂組織中 GSK3β、 p-GSK3β、 β-catenin、Runx2 和BMP-2 蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以x±s 表示， 多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t 法。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 各組大鼠骨折愈合的 Lane-Sandhu X射線評(píng)分

骨折后第2 和4 周，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠Lane-Sandhu X 射線評(píng)分降低（Plt;0. 05）；與模型組比較， MGF 組大鼠Lane-Sandhu X 射線評(píng)分 升 高（Plt;0. 05）； 與 MGF 組 比 較， MGF+XAV-939 組大鼠Lane-Sandhu X 射線評(píng)分降低（Plt;0. 05）。見(jiàn)表1。

2. 2 各組大鼠骨顯微結(jié)構(gòu)參數(shù)

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠BV、Tb. N、BV/TV 和Tb. Th 均降低（Plt;0. 05）； 與模型組比較， MGF 組大鼠BV、Tb. N、BV/TV 和Tb. Th 均升高（Plt;0. 05）； 與MGF 組比較，MGF+XAV-939 組大鼠BV、Tb. N、BV/TV 和Tb. Th 均降低（Plt;0. 05）。見(jiàn)表2。

2. 3 各組大鼠骨痂組織病理形態(tài)表現(xiàn)

HE染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠髖部骨組織結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠骨折部位有大量纖維組織和軟骨痂生成，無(wú)骨性骨痂；MGF 組大鼠骨折部位板層骨形成，斷端髓腔形成， 已基本完成重塑吸收； MGF+XAV-939 組大鼠骨折部位少量軟骨痂鈣化形成硬骨痂，未形成髓腔及骨痂的改建塑形。見(jiàn)圖1。

2. 4 各組大鼠血清中成骨和破骨標(biāo)志物水平

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中BALP 水平降低（Plt;0. 05）， PINP、TRACP-5b 和CTX 水平升高（Plt;0. 05）； 與模型組比較， MGF 組大鼠血清中BALP 水平升高（Plt;0. 05）， PINP、TRACP-5b和 CTX 水平降低（Plt;0. 05）； 與 MGF 組比較，MGF+XAV-939 組大鼠血清中BALP 水平降低（Plt;0. 05）， PINP、TRACP-5b 和CTX 水平升高（Plt;0. 05）。見(jiàn)表3。

2. 5 各組大鼠骨痂組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠骨痂組織中β-catenin、Runx2 和BMP-2 蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 05）；與模型組比較，MGF 組大鼠骨痂組織中β-catenin、Runx2 和BMP-2 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05）； 與 MGF 組比較， MGF+XAV-939 組大鼠骨痂組織中β -catenin、Runx2 和BMP-2 蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 05）。見(jiàn)圖2。

3 討 論

骨折愈合是一個(gè)從最初的炎癥反應(yīng)、骨痂形成到最后的骨性愈合和骨質(zhì)改建塑形的復(fù)雜而有序的生物學(xué)過(guò)程，影響骨折愈合的因素一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［9-10］。研究［11］ 表明：Wnt 信號(hào)是骨形成蛋白（bone morphogenetic protein， BMP） 的上游調(diào)控因子， Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的激活可以抑制多能間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，并將其轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞， 從而改善骨折導(dǎo)致的骨質(zhì)流失。研究［12］ 表明： MGF 可通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin 信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，改善腸系膜缺血導(dǎo)致的肝損傷。MGF 是否能通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)髖部骨折愈合尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用打擊法建立大鼠髖部骨折模型，并給予MGF 干預(yù)，通過(guò)X 射線觀察各組大鼠骨折愈合情況，結(jié)果表明：MGF 組大鼠Lane Sanhu X 射線評(píng)分高于模型組；通過(guò)HE 染色觀察對(duì)比，模型組大鼠骨折部位無(wú)骨性骨痂形成，MGF 組大鼠骨折部位已形成板層骨和髓腔， 基本完成骨重塑；采用Micro CT 技術(shù)對(duì)骨折愈合情況進(jìn)行評(píng)估，MGF 組大鼠BV、Tb. N、BV/TV 和Tb. Th 均高于模型組，說(shuō)明MGF 可促進(jìn)軟骨骨痂形成及向硬骨骨痂轉(zhuǎn)變，骨折愈合明顯加快。

骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)志物可以在骨折愈合過(guò)程中反映整個(gè)骨形成的代謝狀態(tài)，BALP 是成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志物，可以反映成骨細(xì)胞的成熟和活性［13］。骨形成時(shí)Ⅰ 型前膠原被分泌到細(xì)胞外，裂解出PINP 等片段，而CTX 是破骨細(xì)胞的骨吸收活性的標(biāo)志物，由成熟Ⅰ型膠原被破骨細(xì)胞降解產(chǎn)生，骨折發(fā)生時(shí)血清PINP 和CTX 代償性升高，反映Ⅰ型膠原分解和代謝情況［14-15］?？咕剖崴嵝粤姿崦福╰artrate resistant acid phosphatase， TRACP） 主要來(lái)源于骨吸收過(guò)程中破骨細(xì)胞釋放的一種酸性磷酸酶同工酶， 血清中存在TRACP-5a 和TRACP-5b，前者無(wú)酶活性， TRACP-5b 與骨吸收水平呈正相關(guān)關(guān)系［16］。本研究結(jié)果顯示： 與模型組比較，MGF 組大鼠血清中BALP 水平升高，PINP、CTX和TRACP-5b 水平降低，說(shuō)明MGF 是通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化抑制破骨吸收起到骨折修復(fù)作用。

β-catenin 的表達(dá)水平是檢測(cè)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路激活水平的常用指標(biāo)之一，當(dāng)成骨細(xì)胞外Wnt與膜受體卷曲蛋白結(jié)合后，一系列胞膜和胞質(zhì)蛋白相互作用形成二聚體，從而使β-catenin 在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集， 聚集達(dá)到一定量時(shí)移至細(xì)胞核內(nèi)， 促進(jìn)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的靶基因表達(dá)［17-18］。本研究結(jié)果顯示：MGF 組大鼠骨痂組織中β-catenin 表達(dá)水平較模型組升高，標(biāo)志著Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的激活。BMP-2 作為活性最強(qiáng)的BMP，可獨(dú)立刺激成骨細(xì)胞分化，而Runx2 控制著多個(gè)成骨特異性基因，作為成骨分化過(guò)程的早期標(biāo)志物，在成骨分化中起著關(guān)鍵作用［19］。研究［20］ 表明：BMP-2 是可有效調(diào)控Runx2 基因表達(dá)的上游細(xì)胞因子之一，通過(guò)各種基因通路誘導(dǎo)Runx2 表達(dá)，影響干細(xì)胞的成骨分化。本研究結(jié)果顯示：與模型組比較，MGF 組大鼠骨痂組織中BMP-2 和Runx2 蛋白表達(dá)水平升高，而采用Wnt/β-catenin 信號(hào)通路抑制劑XAV-939干預(yù)后，MGF 對(duì)大鼠髖部骨折的修復(fù)作用明顯降低， 說(shuō)明MGF 通過(guò)激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)關(guān)鍵因子發(fā)揮作用。

綜上所述， 本研究在動(dòng)物水平上初步驗(yàn)證MGF 通過(guò)激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)成骨分化和骨形成，進(jìn)而促進(jìn)大鼠髖部骨折愈合，但尚未進(jìn)行相關(guān)的體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，MGF 對(duì)成骨細(xì)胞的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：

所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：

李東方參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)操作和論文撰寫(xiě)，李浩亮參與動(dòng)物模型制備和取材，李光輝參與實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集整理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，李揚(yáng)負(fù)責(zé)論文審校和參考文獻(xiàn)整理分析。

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[基金項(xiàng)目] 河南省中醫(yī)管理局中醫(yī)藥科學(xué)研究專項(xiàng)（2019JDZX041）