［摘 要］ 目的：探討冬凌草甲素對(duì)人鼻咽癌HONE-1細(xì)胞增殖、遷移、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和凋亡的影響，闡明其相關(guān)抗腫瘤機(jī)制。方法：鼻咽癌HONE-1細(xì)胞經(jīng)不同濃度 （0、5、10、20、40、80 和160 mg·L-1） 冬凌草甲素處理48 h 后，采用CCK-8 法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖抑制率，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)的用藥濃度。HONE-1 細(xì)胞分為對(duì)照組、3 mg·L-1 冬凌草甲素組和6 mg·L-1 冬凌草甲素組，培養(yǎng)24 和48 h 后，采用CCK-8 法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性，5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷（EdU） 法檢測(cè)各組細(xì)胞中EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率， 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞中克隆形成數(shù)， Transwell 小室實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞中遷移細(xì)胞數(shù)和劃痕愈合率， 實(shí)時(shí)熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測(cè)各組細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶1 （CDK1） 和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶4 （CDK4） mRNA 表達(dá)水平，Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）和多腺苷二磷酸核糖聚合酶1（PARP1）蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：CCK-8法確定冬凌草甲素48 h 半數(shù)抑制濃度（IC50） 為12. 18 mg·L-1，以1/4 IC50 和1/2 IC50 值為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用藥濃度。與對(duì)照組比較， 24 和48 h 時(shí)3 和6 mg·L-1 冬凌草甲素組細(xì)胞增殖活性降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）， EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）， 細(xì)胞中克隆形成數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)減少（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），劃痕愈合率降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），細(xì)胞中CDK1 和CDK4 mRNA 表達(dá)水平降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）， E-cadherin、Caspase-3 和PARP1 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），Vimentin蛋白表達(dá)水平降低 （Plt;0. 05）。結(jié)論：冬凌草甲素可通過(guò)抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)及EMT，進(jìn)而抑制人鼻咽癌HONE-1 細(xì)胞增殖、克隆形成和遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。

［關(guān)鍵詞］ 冬凌草甲素； 鼻咽腫瘤； 細(xì)胞周期； 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化； 細(xì)胞凋亡

［中圖分類(lèi)號(hào)］ R285. 5； R739. 63 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

我國(guó)是鼻咽癌高發(fā)國(guó)家之一［1］，且南方發(fā)病率高于北方。鼻咽癌是一種發(fā)生于鼻咽部上皮內(nèi)黏膜的鱗狀細(xì)胞癌，以遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為特征［2］，因鼻咽位置隱蔽，同時(shí)鼻咽癌的早期癥狀比較復(fù)雜，缺乏特異性表現(xiàn)，易被忽視，故多數(shù)患者就診時(shí)常處于晚期階段［3］。鼻咽癌治療方式主要是以放療為主［4］、化療為輔的綜合治療，但有許多患者易產(chǎn)生放療抵抗和化療耐藥。冬凌草甲素是一種從唇形科香茶菜屬植物中分離出來(lái)的有生物活性的二萜類(lèi)天然物質(zhì)［5］。既往研究［6-9］ 表明：冬凌草甲素具有抗炎和抗氧化的功效，同時(shí)還具有誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制血管生成等明顯的抗癌活性及肝腎和心臟保護(hù)活性。冬凌草甲素在肺癌、甲狀腺癌和肝癌等多種腫瘤中發(fā)揮一定的抗腫瘤作用， 但其在鼻咽癌中的作用鮮有報(bào)道。本研究探討冬凌草甲素對(duì)人鼻咽癌HONE-1 細(xì)胞增殖和凋亡的影響，闡明其相關(guān)抗腫瘤機(jī)制。

1 材料與方法

1. 1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

人鼻咽癌HONE-1細(xì)胞由濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心提供。冬凌草甲素購(gòu)于上海麥克林生化科技股份有限公司，DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)于上海龍?zhí)锷锟萍加邢薰?，胎牛血清?gòu)于中國(guó)ExCell Bio 科技有限公司，CCK-8 試劑購(gòu)于美國(guó)Genview 公司，5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine EdU） 試劑盒購(gòu)于蘇州優(yōu)逸蘭迪生物科技有限公司，Transwell 小室購(gòu)于武漢來(lái)博賽斯科技有限公司，預(yù)染蛋白marker 購(gòu)于中國(guó)臺(tái)灣SMOBIO 科技有限公司， 聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF） 膜和ECL 顯影液購(gòu)于美國(guó)Millipore 公司，結(jié)晶紫染液和RIPA 裂解液購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司， TRIzol 試劑、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF） 和脫脂奶粉購(gòu)于生工生物工程（上海） 股份有限公司，十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDSPAGE）購(gòu)于上海雅酶生物科技有限公司， 5×loading buffer 購(gòu)于上海碧云天生物科技有限公司，GAPDH 抗體、E- 鈣黏蛋白（E-cadherin） 抗體、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 （cysteinylaspartate specific proteinase-3， Caspase-3） 抗體和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1 （poly ADP-ribosepolymerase 1，PARP1） 抗體購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，波形蛋白（Vimentin） 抗體購(gòu)于天津博士德生物科技有限公司，SYBR qPCR SuperMixplus 購(gòu)于中國(guó)Novoprotein 生物公司， 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司。CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱和多功能酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Thermo FisherScientific 公司，普通光學(xué)顯微鏡購(gòu)于中國(guó)Motic 公司， 熒光顯微鏡購(gòu)于日本Olympus 公司， Countstar 全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購(gòu)于上海睿鈺生物科技有限公司，渦旋混合儀購(gòu)于寧波新芝生物科技股份有限公司， 實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time fluorescencequantitative PCR， RT-qPCR） 儀、電泳槽和凝膠成像儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad 公司。

1. 2 細(xì)胞培養(yǎng)

HONE-1 細(xì)胞在 DMEM 培養(yǎng)基（含10% 胎牛血清和1% 鏈霉素-青霉素雙抗） 中，置于37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HONE-1 細(xì)胞， 用0. 25% 胰蛋白酶消化， 在顯微鏡下觀(guān)察， 細(xì)胞變圓、間距變大并有細(xì)胞脫落時(shí)加入等體積的完全培養(yǎng)基終止消化， 用移液槍輕柔吹打直至貼壁細(xì)胞完全脫落。將吹打混勻的細(xì)胞懸液移至高壓滅菌的離心管中，1 000 r·min-1 離心5 min，棄上清，加入1 mL完全培養(yǎng)基重懸， 1∶ 3 比例接種至培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)或制成單細(xì)胞懸液備用。

1. 3 CCK-8法檢測(cè)不同濃度冬凌草甲素組細(xì)胞增殖抑制率和各組細(xì)胞增殖活性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HONE-1 細(xì)胞制成單細(xì)胞重懸液，按照臺(tái)盼藍(lán)∶細(xì)胞重懸液=1∶ 1 比例混合均勻。調(diào)整細(xì)胞密度為3×104 mL-1，取100 μL 接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，用濃度為0、5、10、20、40、80 和160 mg·L-1冬凌草甲素培養(yǎng)48 h，每孔加5 μL CCK-8 試劑繼續(xù)培養(yǎng)3 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處吸光度（A） 值， 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次， 取不同時(shí)間點(diǎn)的平均A 值， 并且以0 h 的平均A 值進(jìn)行歸一化處理后，繪制隨藥物濃度變化的細(xì)胞增殖抑制率曲線(xiàn)，計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率= （對(duì)照組A 值－實(shí)驗(yàn)組A 值） /對(duì)照組A 值×100%， 采用GraphPad Prism 8. 0. 1統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算冬凌草甲素半數(shù)抑制濃度（halfmaximal inhibitory concentration， IC50）。將單細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中， 待細(xì)胞貼壁且鋪滿(mǎn)培養(yǎng)皿50%～60% 時(shí)，以不加藥組細(xì)胞為對(duì)照組，以加入不同濃度（1/4 IC50 和1/2 IC50， 即3 和6 mg·L-1）冬凌草甲素組為實(shí)驗(yàn)組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，調(diào)整細(xì)胞密度為3×104 mL-1，取100 μL 接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。在細(xì)胞貼壁24 和48 h時(shí)每孔加入5 μL CCK-8 試劑，3 h 后檢測(cè)各組細(xì)胞A 值，以A 值代表各組細(xì)胞增殖活性。

1. 4 EdU法檢測(cè)各組HONE-1細(xì)胞中EdU陽(yáng)性細(xì)胞率

細(xì)胞分組方法見(jiàn)“1. 3”。取各組細(xì)胞制成單細(xì)胞重懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為2×104 mL-1，取100 μL 接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔， 培養(yǎng)48 h 后， 采用EdU 試劑盒進(jìn)行染色，染色完成后采用熒光顯微鏡觀(guān)察拍照。在熒光顯微鏡下，EdU 標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞為紅色。隨機(jī)選取3 個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率。EdU陽(yáng)性細(xì)胞率=EdU 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1. 5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞中克隆形成數(shù)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為300 mL-1， 接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分組和處理方法見(jiàn)“1. 3”。在37 ℃、5% CO2細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)10 d，更換培養(yǎng)基2 次，待肉眼觀(guān)察到細(xì)胞集落后終止培養(yǎng)。棄上清， 用PBS 緩沖液清洗3 次，80% 無(wú)水乙醇固定30 min。棄掉固定液， 用PBS 緩沖液清洗3 次， 結(jié)晶紫溶液染色15 min。用流水沖洗， 干燥后拍照， 計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)。

1. 6 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞中遷移細(xì)胞數(shù)

細(xì)胞分組方法見(jiàn)“1. 3”。取各組HONE-1 細(xì)胞制成單細(xì)胞重懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1. 5×104 mL-1， Transwell 小室下室加入含有20% FBS 的培養(yǎng)基800 μL，輕輕放入小室避免產(chǎn)生氣泡，小室上室加入200 μL 細(xì)胞懸液。輕輕震蕩后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育72 h。孵育完成后棄掉上室細(xì)胞懸液，用棉簽輕輕擦掉上室底層的細(xì)胞，結(jié)晶紫溶液染色10 min，用PBS 緩沖液浸泡數(shù)次，倒置顯微鏡下采集圖像。各組隨機(jī)選取6 個(gè)視野，計(jì)數(shù)各組細(xì)胞中遷移細(xì)胞數(shù)。

1. 7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞劃痕愈合率

細(xì)胞分組方法見(jiàn)“1. 3”。取各組生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞制成單細(xì)胞重懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后取5×105個(gè)細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待細(xì)胞貼壁且鋪滿(mǎn)孔板后，取一直尺使其平面橫穿于孔板上方，使用20 μL 滅菌槍頭，垂直并緊貼直尺進(jìn)行劃痕，每孔橫縱各一條劃痕。劃痕結(jié)束后，采用PBS 緩沖液清洗3 次，去除滑落的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2 細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)，分別于0、24 和48 h 后取樣拍照。測(cè)量各組不同時(shí)間段的劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞劃痕愈合率。細(xì)胞劃痕愈合率= （0 h 劃痕寬度-24 或48 h 劃痕寬度） /0 h 劃痕寬度×100%。

1. 8 RT-qPCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中CDK1和CDK4mRNA 表達(dá)水平

細(xì) 胞 分 組 方 法 見(jiàn) “1. 3”。 收集各組細(xì)胞沉淀， 參照說(shuō)明書(shū)采用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA， 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA， 使用Nanodrop測(cè)定逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物濃度， 并 用 DEPC 水 稀 釋 至200 mg·L-1 ， 以GAPDH 為內(nèi)參擴(kuò)增CDK1 和CDK4 基因。引物序列： CDK1， F 5'-GTGCATCTACACCGACAACTCCA-3'，R 5'-TGAGCTTGTTCACCAGGAGCA-3'； CDK4， F 5'-CTCTGCGTCCAGCTGCTCCG-3'，R 5'- AGGGAGACCCTCACGCCAGC-3'； GAPDH， F 5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3'， R 5'- CCCAATACGACCAAATCCGTT-3'。反應(yīng)條件： 95 ℃ 、15 s，53 ℃、30 s，72 ℃、20 s，共35 個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA 水平。

1. 9 Western blotting 法 檢 測(cè) 各 組 細(xì) 胞 中E-cadheren、Vimentin、Caspase-3和 PARP1蛋白表達(dá)水平

細(xì)胞分組方法見(jiàn)“1. 3”。收集各組細(xì)胞，以預(yù)冷的PBS 緩沖液充分洗滌細(xì)胞2 次，加入適量RIPA 裂解液∶ PMSF=100∶ 1 比例配制的蛋白裂解液（現(xiàn)用現(xiàn)配） 后冰上裂解30 min，每10 min 震蕩混勻1 次使其充分裂解， 4 ℃、12 000 r·min-1 離心10 min， 取上清轉(zhuǎn)移至新的EP 管中， 加入1/4的5× 蛋白上樣緩沖液， 金屬浴100 ℃， 10 min 變性。采用SDS-PAGE 電泳。上樣體積為10 μL，中間上蛋白樣品，兩邊上maker 并用1×蛋白上樣緩沖液補(bǔ)齊上樣體積。半干法將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5% 脫脂牛奶常溫封閉1 h，分別加入一抗E-cadherin、Vimentin、Caspase-3、PARP1和GAPDH 抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次10 min，洗膜完成后加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠抗體（稀釋比例1∶1 000） 常溫孵育1 h， TBST 洗膜3 次， 每次10 min。配制ECL顯影液，采用化學(xué)發(fā)光法顯色曝光。采用Image J圖像分析系統(tǒng)對(duì)圖像掃描，計(jì)算各組細(xì)胞中目的蛋白的表達(dá)水平。目的蛋白的表達(dá)水平=目的蛋白條帶的灰度值/內(nèi)參GAPDH 灰度值×100%。

1. 10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8. 0. 1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)， 各組細(xì)胞增殖活性、EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率、克隆形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)和劃痕愈合率，各組細(xì)胞中CDK1 和CDK4 mRNA 表達(dá)水平，各組細(xì)胞中E-cadheren、Vimentin、Caspase-3和PARP1 蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以-x± s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 冬凌草甲素的 IC50和各組細(xì)胞增殖活性

不同濃度（0、5、10、20、40、80 和160 mg·L-1） 冬凌草甲素（每組3 個(gè)復(fù)孔） 分別作用于HONE-1 細(xì)胞48 h 后，隨著冬凌草甲素濃度升高，各組細(xì)胞增殖抑制率明顯升高。根據(jù)以上結(jié)果計(jì)算出冬凌草甲素的 IC50 為12. 18 mg·L-1。 與對(duì)照組比較，24 和48 h 時(shí)3 和6 mg·L-1 冬凌草甲素組細(xì)胞增殖活性降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見(jiàn)圖1。

2. 2 各組細(xì)胞中 EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率

與對(duì)照組（34. 35%±1. 01%） 比較，3 和6 mg·L-1冬凌草甲素組EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率（29. 83%±1. 33% 和19. 34%±0. 32%） 降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見(jiàn)圖2。

2. 3 各組細(xì)胞克隆形成數(shù)

與對(duì)照組（81. 00個(gè)±5. 66 個(gè)） 比較，3 和6 mg·L-1 冬凌草甲素組克隆形成數(shù)（51. 00 個(gè)±2. 83 個(gè)和3. 50 個(gè)±0. 707 個(gè)） 減少（Plt;0. 05）。見(jiàn)圖 3。

2. 4 各組細(xì)胞中遷移細(xì)胞數(shù)

與對(duì)照組（52. 00個(gè)±3. 00 個(gè)） 比較，3 和6 mg·L-1 冬凌草甲素組細(xì)胞中遷移細(xì)胞數(shù)（42. 00個(gè)±3. 00個(gè)和22. 67個(gè)±1. 53個(gè)）減少（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見(jiàn)圖4。

2. 5 各組細(xì)胞劃痕愈合率

與對(duì)照組 （59. 80%±7. 02% 和86. 70%±2. 83%） 比較，3 和6 mg·L-1 冬凌草甲素組細(xì)胞24 h 劃痕愈合率（26. 42%±1. 21% 和6. 09%±4. 44%） 和48 h 劃痕愈合率（47. 25%±3. 75% 和9. 62%±4. 66%） 降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見(jiàn)圖5。

2. 6 各組細(xì)胞中 CDK1 和 CDK4 mRMA 表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，3 和6 mg·L-1 冬凌草甲素組細(xì)胞中CDK1 和CDK4 mRNA 表達(dá)水平降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見(jiàn)圖6。

2. 7 各組細(xì)胞中 E-cadherin、Vimentin、Caspase-3和 PARP1 蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組比較， 3 和6 mg·L-1冬凌草甲素組細(xì)胞中E-cadherin、Caspase-3和PARP1 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）， Vimentin 蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 05）。見(jiàn)圖7。

3 討 論

近年來(lái)， 國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究［10-14］ 表明： 冬凌草甲素對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有一定的抑制作用。在肺癌中，冬凌草甲素能抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與放療聯(lián)合使用時(shí)可通過(guò)增加細(xì)胞DNA 損傷和細(xì)胞凋亡來(lái)增強(qiáng)放療反應(yīng)，同時(shí)也可有效抑制異種移植瘤的生長(zhǎng)， 可通過(guò)下調(diào)B 細(xì)胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2） 和上調(diào)Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2-associated X protein， Bax） 增強(qiáng)肺癌的放療敏感性；在甲狀腺癌中，冬凌草甲素可通過(guò)下調(diào)非受體型蛋白酪氨酸激酶家族信號(hào)通路抑制EMT 和血管生成；在肝癌中，其衍生物可通過(guò)線(xiàn)粒體途徑觸發(fā)肝癌細(xì)胞的凋亡；但其在鼻咽癌中的作用少見(jiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示：采用冬凌草甲素處理后，與對(duì)照組比較，HONE-1 細(xì)胞的增殖能力、克隆形成能力、遷移能力和劃痕愈合能力均減弱，表明冬凌草甲素能夠抑制HONE-1 細(xì)胞的增殖和遷移。

細(xì)胞周期蛋白是一類(lèi)與細(xì)胞周期功能狀態(tài)密切相關(guān)的蛋白質(zhì)家族，可通過(guò)與特定蛋白激酶結(jié)合并激活其活性，從而在細(xì)胞周期的不同階段發(fā)揮調(diào)控作用［15］。CDK1 和CDK4 是高度保守的絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr） 蛋白激酶，在細(xì)胞周期循環(huán)中發(fā)揮重要作用［16-17］。本研究結(jié)果顯示：冬凌草甲素處理后人鼻咽癌HONE-1 細(xì)胞中CDK1 和CDK4mRNA 表達(dá)水平降低， 提示冬凌草甲素能抑制鼻咽癌HONE-1 細(xì)胞的分裂能力。

EMT 是指上皮細(xì)胞通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程，在癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了重要作用［18］， 其主要的特征為細(xì)胞黏附分子表達(dá)水平降低［19-20］，細(xì)胞角蛋白細(xì)胞骨架轉(zhuǎn)化為Vimentin 為主的細(xì)胞骨架及形態(tài)上具有間充質(zhì)細(xì)胞的特征［21］。通過(guò)EMT， 上皮細(xì)胞失去了細(xì)胞極性，失去了與基底膜的連接等上皮表型，獲得了較高的遷移、侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力等間質(zhì)表型。本研究結(jié)果顯示：冬凌草甲素作用后，HONE-1 細(xì)胞中E-cadherin 蛋白表達(dá)水平升高，Vimentin 蛋白表達(dá)水平降低，說(shuō)明冬凌草甲素可控制HONE-1 細(xì)胞的EMT 過(guò)程，抑制其遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解。Caspase-3 是細(xì)胞凋亡過(guò)程中主要的終末剪切酶，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用［22］。多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerases，PARPs） 是一個(gè)超大蛋白酶家族， 在DNA 修復(fù)、染色質(zhì)組織、基因組完整性、炎癥過(guò)程和細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用［23］， 也是細(xì)胞凋亡核心成員含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteineaspastic acid-specific proteases， Caspases） 的切割底物。PARP1 作為PARPs 家族的重要成員之一，能快速標(biāo)記細(xì)胞DNA 損傷的位置，通過(guò)相關(guān)系統(tǒng)來(lái)清除DNA 的損傷［24］。本研究結(jié)果顯示：冬凌草甲素處理后， 鼻咽癌HONE-1 細(xì)胞中Caspase-3 和PARP1 蛋白表達(dá)水平升高， 表明冬凌草甲素可以誘導(dǎo)鼻咽癌HONE-1 細(xì)胞凋亡，但其具體促凋亡機(jī)制仍有待深入研究。

綜上所述，冬凌草甲素可抑制鼻咽癌HONE-1細(xì)胞的增殖能力、克隆形成能力和遷移能力，并參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程，進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。本研究為尋找鼻咽癌新的治療方法奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：

所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：

梁超參與研究設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)操作和論文撰寫(xiě)，代娟娟參與實(shí)驗(yàn)操作，周寧參與數(shù)據(jù)收集、整理和分析，王丹丹和趙杰參與細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞處理， 安迪參與論文校對(duì)，武艷參與論文審校。

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