［摘 要］ 目的：探討血管性血友病因子裂解酶 ADAM 金屬肽酶含血小板反應(yīng)蛋白 1 型 13（ADAMTS13） 間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域在血管性血友病因子（vWF） 裂解過(guò)程中的生物學(xué)功能， 闡明ADAMTS13在血栓性血小板減少性紫癜 （TTP） 發(fā)病機(jī)制中的作用。方法：將ADAMTS13間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基 TEDRLPR 以點(diǎn)突變技術(shù)逐個(gè)基因突變（突變體M1～M7）， 將構(gòu)建的ADAMTS13 與其突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人胚腎 HEK293 細(xì)胞，穩(wěn)定表達(dá)后提純重組蛋白。觀察野生型和突變型 ADAMTS13 在變性條件、剪切應(yīng)力作用和 ADAMTS13 抗體處理后裂解 vWF 的能力。結(jié)果：熒光共振能量轉(zhuǎn)移 （FRET） 實(shí)驗(yàn)， 與野生型 ADAMTS13 比較， ADAMTS13 突變體M4 （R635A） 和突變體M7 （R638A） 對(duì)FRET-vWF73 剪切能力降低（Plt;0. 05）。變性條件下，野生型ADAMTS13 可以將vWF 多聚體裂解， 與野生型ADAMTS13 比較， ADAMTS13 突變體M4 （R635A） 和突變體M7 （R638A） 的裂解活性明顯降低（Plt;0. 01）。在體外剪切應(yīng)力作用下，與野生型 ADAMTS13 比較， ADAMTS13 突變體 M4 （R635A） 和突變體M7 （R638A） 裂解vWF 多聚體的能力明顯降低（Plt;0. 01）。 與野生型 ADAMTS13 比較， ADAMTS13 突變體M4（R635A） 和突變體M7 （R638A） 與vWF 之間的結(jié)合力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）， 表明ADAMTS13 的C 末端與vWF 之間存在多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。ADAMTS13 抗體處理可在一定程度上抑制野生型和突變型 ADAMTS13 裂解 vWF 的能力。結(jié)論：間隔區(qū)突變后 ADAMTS13 的活性降低。ADAMTS13 突變體M4 （R635A） 和突變體M7 （R638A） 可能是ADAMTS13 在底物識(shí)別時(shí)的重要作用位點(diǎn)。

［關(guān)鍵詞］ 血管性血友病因子裂解酶； ADAM 金屬肽酶含血小板反應(yīng)蛋白1 型13；間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域；血管性血友病因子； 血栓性血小板減少性紫癜

［中圖分類號(hào)］ R554. 6 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ Ａ

ADAM 金屬肽酶含血小板反應(yīng)蛋白1 型13（ADAM metalloproteinase with thrombospondintype 1 motifs 13， ADAMTS13） 是一種血管性血友病因子裂解酶。血栓性血小板減少性紫癜（thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP） 是由ADAMTS13 嚴(yán)重缺乏或活性減低（低于正常值10%） 引起的罕見(jiàn)且危及生命的血栓性微血管?。?］。TTP 可導(dǎo)致微血管病性溶血性貧血、嚴(yán)重血小板減少和播散性微血管富血小板血栓相關(guān)的器官缺血［2］。在缺乏ADAMTS13 情況下，血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF） 聚合物未得到充分加工，導(dǎo)致血小板自發(fā)黏附，表現(xiàn)為嚴(yán)重的危及生命的微血管血栓形成［3］。

先天性TTP 是由ADAMTS13 基因中的雙等位基因突變引起，需要2 個(gè)功能喪失突變才可完全滅活A(yù)DAMTS13 基因產(chǎn)物。而大部分TTP 是由ADAMTS13 與自身抗體結(jié)合并損害其功能引起［4］。在獲得性血栓性血小板減少性紫癜（acquiredthrombotic thrombocytopenic purpura，aTTP） 急性期，ADAMTS13 自身抗體通過(guò)與間隔結(jié)構(gòu)域結(jié)合，將ADAMTS13 的構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)殚_(kāi)放形式［5］。有研究者［6］ 將急性免疫性血小板減少性紫癜（immunethrombocytopenic purpura，iTTP） 患者的免疫球蛋白G （immunoglobulin G， IgG） 純化， 并添加到健康供體的血漿中，此時(shí)血漿中ADAMTS13 為封閉構(gòu)象，結(jié)果顯示：在大多數(shù)情況下急性iTTP 患者血漿中具有開(kāi)放性構(gòu)象的抗ADAMTS13 自身抗體，可以誘導(dǎo)正常人血漿中ADAMTS13 由封閉形式至開(kāi)放形式的構(gòu)象變化，表明ADAMTS13 自身抗體的存在和 ADAMTS13 活性與 TTP 的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)。 目前治療 TTP 主要采用ADAMTS13 酶替代療法（治療性血漿置換） 和免疫抑制劑（通常是類固醇和抗CD20 單克隆治療），以消除抗ADAMTS13 抗體并使ADAMTS13 活性正?；?］。研究［7-9］ 顯示： 在aTTP 患者中，ADAMTS13 抑制性自身抗體最常見(jiàn)的結(jié)合位點(diǎn)在間隔區(qū)， 其次是富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域（cysteinerich，CysR）。ADAMTS13 間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域?qū)ζ浠钚杂兄匾饔茫?0］。本研究旨在探討ADAMTS13 間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域突變對(duì)其活性的影響，分析ADAMTS13在 vWF 裂解過(guò)程中的生物學(xué)功能，為T(mén)TP 發(fā)病機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 質(zhì) 粒 、細(xì) 胞 和 菌 株

含 人 ADAMTS13 的pcDNA3. 1/V5-His-TOPO 質(zhì)粒由美國(guó)堪薩斯大學(xué)鄭興龍教授饋贈(zèng)。pcDNA3. 1/V5-His-TOPO 載體和pSecTag/FRT/V5-His TOPO 載體均購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司。HEK293 細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)組織培養(yǎng)庫(kù)（American Tissue Culture Collection， ATCC），DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于北京康為世紀(jì)科技有限公司。大腸桿菌購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1. 2 主 要 實(shí) 驗(yàn) 試 劑 和 儀 器

DMEM、 OPTIMEM、 0. 25% 胰 酶-EDTA 溶液、 pen-strep 雙抗溶液、 G418 抗生素、 PCR 純化試劑盒、Lipofectamine2000 和鼠抗V5 單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司， 凝膠回收試劑盒購(gòu)于德國(guó)Qiagen公司，小量和中量提取質(zhì)粒試劑盒購(gòu)于北京康為世紀(jì)科技有限公司， SOC 培養(yǎng)基購(gòu)于青島海博生物科技有限公司，酪蛋白酸鈉購(gòu)于德國(guó)Sigma 公司，SeaKem HGT Agarose 購(gòu) 于 瑞 士 Lonza 公 司，Coomassie Blue 購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，抗人vWF 抗體、兔多克隆抗鼠HRP 結(jié)合抗體購(gòu)于丹麥Dako Cytomation 公司，Puf DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶和Ni-NTA 親和柱購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾科技公司， Pefabloc 購(gòu)于美國(guó)Roche AppliedScience 科技公司， 抗V5 IgG-IR dye800CW 和抗ADAMTS13 抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam 公司， HumanvWF Pure 購(gòu)于美國(guó)BD Biosciences 公司， 驢抗兔IgG （H+L） 二抗購(gòu)于美國(guó)Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司， 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer， FRET）-vWF73 購(gòu)于美國(guó)Peptide Institute 公司， 10× 磷酸鹽緩沖液（phospate buffered saline， PBS） 和胰蛋白酶購(gòu)于北京索萊寶公司，胎牛血清（fetal bovineserum， FBS） 購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司?？炝魉貿(mào) 瓊脂糖凝膠（Q-sepharose fast flow，QFF） 離子交換柱和Superose6 10/300 GL 分子篩購(gòu)于美國(guó)GE 公司，核酸和蛋白含量測(cè)定儀購(gòu)于瑞士Tecan 公司，基因擴(kuò)增儀購(gòu)于英國(guó) PerkinElmer 公司， PCR 漩渦式混合器和二氧化碳培育箱購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾科技公司， Odyssey 成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)LI-COR 科技公司，超凈工作臺(tái)購(gòu)于意大利BIOAIR 公司，倒置顯微鏡購(gòu)于日本OLYMPUS 公司，BIOCAPT200E型成像系統(tǒng)、電泳儀、半干轉(zhuǎn)印槽、酶標(biāo)儀和熒光酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Bio Tek 公司，分光光度計(jì)購(gòu)于南京恒瑞分析儀器有限公司， 渦旋振蕩器購(gòu)于德國(guó)VORTEX 公司。

1. 3 ADAMTS13突變體質(zhì)粒制備、蛋白表達(dá)和提純

采用含人ADAMTS13 的pcDNA3. 1/V5-His-TOPO 質(zhì)粒按照參考文獻(xiàn)［11］ 中的方法進(jìn)行ADAMTS13 點(diǎn)突變，使用PCR 純化試劑盒得到純化的突變體質(zhì)粒。將構(gòu)建好的ADAMTS13 及其突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293 細(xì)胞中， 采用Westernblotting 法檢測(cè)野生型和突變型ADAMTS13 蛋白表達(dá)情況，穩(wěn)定表達(dá)后得到ADAMTS13 蛋白。使用G418 篩選收集細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的ADAMTS13 及其突變體的重組蛋白上清液，經(jīng)由Q-fast flow 離子結(jié)合柱、Ni-NTA 親和層析柱和superose 610/300GL分子篩后最終得到純化的重組蛋白。

1. 4 Western blotting 法 檢 測(cè) 野 生 型 和 突 變 型ADAMTS13的相對(duì)分子質(zhì)量

差異分光光度計(jì)檢測(cè)純化的重組蛋白濃度。采用Western blotting 法檢測(cè)野生型和突變型ADAMTS13， 利用Odyssey 成像系統(tǒng)顯像得到野生型和突變型ADAMTS13 相對(duì)分子質(zhì)量。

1. 5 FRET 實(shí) 驗(yàn) 檢 測(cè) ADAMTS13 點(diǎn) 突 變 對(duì)FRET-vWF73 裂解的影響

將野生型和突變型ADAMTS13 分別與FRET-vWF73 結(jié)合， 將不同濃度（0、2、4、8、10 和12 μmol·L－1） 重組FRET-vWF73 （recombination FRET-vWF73，rFRET-vWF73） 與野生型和突變型ADAMTS13置于含反應(yīng)溶液（總體積200 μL） 的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中孵育。采用熒光微量平板讀取器于37 °C條件下監(jiān)測(cè)熒光產(chǎn)生速率， 每 5 min 1 次， 持續(xù)60 min。采用Sigma Plot 軟件將數(shù)據(jù)整合至Michaelis-Menten 方程中， 得到動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km 和Kcat。Km為米氏常數(shù)，即酶促反應(yīng)達(dá)最高速度（Vmax）一半時(shí)底物的濃度；Kcat 為催化常數(shù)，表示單位時(shí)間內(nèi)酶分子催化底物轉(zhuǎn)化的次數(shù)，［E］ 為酶的濃度，Kcat＝Vmax/ ［E］，反映一個(gè)酶促反應(yīng)的速度。1. 6 檢測(cè)變性條件下野生型和突變型ADAMTS13對(duì) vWF 的裂解活性 將 vWF （37. 5 mg·L－1） 分別與野生型和突變型ADAMTS13 置于透析膜（0. 25 μm） 上，將血漿透析膜置于50 μL、pH 8. 0 的緩沖液中（10 mmol·L－1 Tris-HCl， 含有1. 5 mol·L－1尿素），37 ℃下孵育4 h。1% SeaKem HGT 瓊脂糖凝膠分離變性蛋白， 采用Western blotting 法檢測(cè)vWF 裂解產(chǎn)物。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜，加入抗 vWF 抗體后，利用 Odyssey 成像系統(tǒng)（美國(guó) LI-COR 公司）顯像，觀察vWF 裂解產(chǎn)物分布情況。

1. 7 檢 測(cè) 剪 切 應(yīng) 力 作 用 下 野 生 型 和 突 變 型ADAMTS13 對(duì) vWF 的裂解活性

為模擬生理?xiàng)l件，觀察ADAMTS13 的活性，采用微型渦流振蕩器合成剪切應(yīng)力后， 分別觀察野生型和突變型ADAMTS13 對(duì) vWF 的裂解情況。將 vWF（37. 5 mg·L－1） 與野生型和突變型ADAMTS13 分別置于0. 2 mL 離心管中， 然后在振蕩器上震蕩10 min， 離心， 加熱變性， 1%SeaKem HGT 瓊脂糖凝膠分離后采用Western blotting 法檢測(cè)vWF 裂解產(chǎn)物。在變性的條件下，ADAMTS13 可將超大型vWF 多聚體（unusually large-vWF， UL-vWF）裂解， 將原本表現(xiàn)為高相對(duì)分子質(zhì)量（highrelative molecular weight， HMW） 的部分裂解為低相對(duì)分子質(zhì)量（low relative molecular weight，LMW） 的產(chǎn)物。當(dāng)ADAMTS13 裂解UL-vWF 時(shí)，LMW 越多，HMW 越少，HMW/LMW 比值越小，表明ADAMTS13 的裂解活性越強(qiáng)，反之則表明其裂解活性越弱。

1. 8 檢測(cè)野生型和突變型 ADAMTS13與 vWF的結(jié) 合 力

于 96 孔 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 板 中 將 37. 5 mg·L－1vWF 孵育1 h 后用PBS 緩沖液洗滌3 次， 在20 mmol·L－1 Tris-HCl 和150 mmol·L－1 NaCl 中用2. 5%BSA 封閉， 加入10 mmol·L－1 EDTA， 加入100 μL 野生型和突變型 ADAMTS13， 孵育2 h。PBS 緩沖液洗滌3 次，然后與過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的兔多克隆抗鼠HRP 結(jié)合抗體共同溫育1 h。TBS 緩沖液洗滌3 次，加入100 μL 3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（3， 3'， 5， 5'-tetramethylbenzidine， TMB） 避光孵育 10 min。 加入 1. 5 mmol·L－1 H2SO4 50 μL，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處吸光度（A） 值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。采用GraphPad Prism 軟件計(jì)算Bmax值和 Kd 值，并計(jì)算 Bmax/Kd 比值，表示 ADAMTS13 與vWF 的結(jié)合能力。

1. 9 Western blotting法檢測(cè)ADAMTS13抗體處理后vWF產(chǎn)物蛋白表達(dá)水平

將vWF（37. 5 mg·L－1）以20 mmol·L－1 Tris-HCl （pH 8. 0） 稀釋后分別與ADAMTS13抗體37 ℃孵育2 h，取5 mmo·l L－1 CaCl2［內(nèi)含1×Protein protease inhibitor （EDTA-free）］以20 mmol·L－1 Tris-HCl （pH 8. 0） 溶液稀釋，與37 ℃活化1 h 的野生型和突變型ADAMTS13（終濃度為50 mmol·L－1 ） 混合后置于0. 5 mL EP管中（總體系為40 μL），37 ℃反應(yīng)1 h。加入終濃度為20 mmol·L－1 EDTA 終止酶切反應(yīng)。1%SeaKem HGT 瓊脂糖凝膠分離后， 采用Westernblotting 法檢測(cè)vWF 產(chǎn)物蛋白表達(dá)水平。

1. 10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Sigma Plot 13. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。UL-vWF 的HMW/LMW 比值及ADAMTS13 與vWF 之間的Bmax 和Kd 以x±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 ADAMTS13 突變體質(zhì)粒的構(gòu)建

采用定點(diǎn)誘變的方法， 以編碼人野生型ADAMTS13 的pcDNA3. 1/V5-His-TOPO 為模板。從TTP 患者血漿中分離出抗ADAMTS13 IgG 自身抗體并找到靶向位點(diǎn)， 分別為7 個(gè)氨基酸殘基TEDRLPR（Thr632、Glu633、Asp634、Arg635、Leu636、Pro637 和Arg638）。將位于ADAMTS13 間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域中Thr632 和Arg638 之間的7 個(gè)氨基酸殘基用丙氨酸逐步替換， 構(gòu)建出不同的突變體（M1：T632A； M2： E633A； M3： D634A； M4：R635A； M5： L636A； M6： P637A； M7：R638A）。見(jiàn)圖1。

2. 2 HEK293細(xì)胞中野生型和突變型ADAMTS13蛋白表達(dá)情況

將野生型和突變型ADAMTS13質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至HEK293 細(xì)胞， 篩選可以穩(wěn)定表達(dá)ADAMTS13 的細(xì)胞， 由瓊脂糖凝膠離子交換柱、Ni-NTA 親和柱和Superose6 10/300 GL 分子篩純化后， 得到純化的ADAMTS13， Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示：野生型和突變型ADAMTS13 蛋白相對(duì)分子質(zhì)量正確，表達(dá)完整。見(jiàn)圖2。

2. 3 點(diǎn) 突 變 后 ADAMTS13 對(duì) rFRET-vWF73裂 解 的 剪 切 能 力

FRET 實(shí) 驗(yàn) 中 Kcat/Km 比 值（L·mol－1·s－1）： 野生型ADAMTS13 為0. 734， 突變體M1 （T632A） 為0. 932， 突變體M2（E633A） 為0. 709， 突變體M3 （D634A） 為0. 464， 突變體M4 （R635A） 為0. 281， 突變體M5 （L636A） 為0. 954， 突變體M6 （P637A） 為0. 927，突變體M7 （R638A） 為0. 356。與其他突變體比較，突變體M4 和M7 在酶切rFRET-vWF73時(shí)的Kcat/Km 比值降低， 即其剪切能力降低。同等條件下，野 生 型 ADAMTS13 的 Kcat/Km 比值分別約為突變體M4 和突變體M7 的2. 6 倍和2. 0 倍。

2. 4 變性條件下 ADAMTS13點(diǎn)突變后對(duì) vWF的裂解活性

與野生型 ADAMTS13 比較，突變體M4 和M7 裂解UL-vWF 時(shí)的HMW/LMW 比值明顯升高（Plt;0. 01），其余ADAMTS13 突變體裂解UL-vWF 時(shí)的HMW/LMW 比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見(jiàn)圖3。

2. 5 剪切應(yīng)力作用下 ADAMTS13 點(diǎn)突變后對(duì)vWF的裂解能力

在微型渦旋振蕩器產(chǎn)生的高剪切應(yīng)力的作用下，野生型和突變型ADAMTS13 對(duì)vWF 的裂解能力發(fā)生變化。Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果顯示：與野生型ADAMTS13 比較，突變型ADAMTS13 裂解UL-vWF 的產(chǎn)物減少， 突變體M4 和M7 的HMW/LMW 比值明顯升高（Plt;0. 01），表明突變體M4 和M7 對(duì)UL-vWF 的裂解能力明顯降低。見(jiàn)圖4。

2. 6 突變型 ADAMTS13與 vWF結(jié)合力

與野生型ADAMTS13 比較，突變型ADAMTS13 與vWF之間的結(jié)合力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）， 表明ADATMS13 的C 末端與vWF 之間可能存在多個(gè) 結(jié) 合 位 點(diǎn) （表 1）， M4 （R635A） 和 M7（R638A） 位點(diǎn)的突變可以減弱酶切能力但不會(huì)影響整體的結(jié)合力。

2. 7 ADAMTS13 抗體作用后野生型和突變型ADAMTS13 在剪切應(yīng)力作用下裂解 vWF 的能力

加入ADAMTS13 抗體后， 野生型和突變型ADAMTS13 裂解vWF 的LMW 產(chǎn)物較未加入時(shí)減少，表明ADAMTS13 抗體一定程度上抑制了野生型和突變型ADAMTS13 裂解vWF 的能力， 提示ADATMS13 與vWF 之間可能存在多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，剪切力對(duì)于ADAMTS13 裂解vWF 的過(guò)程至關(guān)重要。見(jiàn)圖5。

3 討 論

TTP 是一種罕見(jiàn)且危及生命的血栓性微血管病，部分急性發(fā)作患者經(jīng)過(guò)治療后可存活，但幸存患者在后期隨訪中復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)仍然很高［12］。ADAMTS13 是一種血漿金屬蛋白酶，可切割血管性血友病因子， 對(duì)于正常止血起重要作用［13］。TTP 患者的血液中，ADAMTS13 活性被抑制或與促進(jìn)其清除的自身抗體靶向結(jié)合， 導(dǎo)致可切割UL-vWF 具有活性的ADAMTS13lt;10% ［3］。對(duì)于ADAMTS13 金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)和功能的研究，是尋找TTP 等疾病治療方法的關(guān)鍵。

vWF73 是可被ADAMTS13 裂解的最小片段，且較 vWF 更加敏感， 因此對(duì) ADAMTS13 及其突變體的研究中， 經(jīng)常使用 GST-vWF73-H 或FRETS-vWF73 ［14］。 正常情況下， vWF 呈球狀，其折疊的蛋白構(gòu)象將一些功能區(qū)隱藏， 對(duì)ADAMTS13 的結(jié)合裂解敏感度不高。血液中存在高速流動(dòng)的流體力，可以將折疊成球狀的vWF 展開(kāi)成為鏈狀， 暴露相關(guān)功能結(jié)構(gòu)域， 使其可以被ADAMTS13 更好地識(shí)別并裂解［15］。研究［16］ 顯示：通過(guò)渦旋產(chǎn)生的剪切力模擬血液流動(dòng)狀態(tài)，在剪切力作用下，Spacer 區(qū)域缺失的ADAMTS13 突變體對(duì)vWF 的親和性降低，表明該區(qū)域在vWF 識(shí)別中十分關(guān)鍵。本研究結(jié)果顯示：靜止條件下，將經(jīng)過(guò)變性處理的vWF 與野生型和各突變型ADAMTS13作用后，與野生型ADAMTS13 比較，M4 和M7 突變體裂解UL-vWF 時(shí)的HMW/LMW 比值明顯升高， 表明M4 和M7 突變體的裂解能力較野生型ADAMTS13 受限；在體外剪切應(yīng)力作用下，與野生型ADAMTS13 比較， 突變型ADAMTS13 對(duì)UL-vWF 的裂解產(chǎn)物減少， 其中突變體M4 和M7的HMW/LMW 比值明顯升高。本研究結(jié)果顯示：ADATMS13 與vWF 之間可能存在多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。本研究結(jié)果表明： 在變性條件、剪切應(yīng)力和ADAMTS13 抗體存在的情況下， ADAMTS13 中的Spacer 結(jié)構(gòu)域在與vWF 識(shí)別并酶切裂解的過(guò)程中起重要的作用，突變體M4 和突變體M7 可能是ADAMTS13 與vWF 識(shí)別結(jié)合的重要位點(diǎn)。

目前，相關(guān)研究［17-18］ 對(duì)TTP 的治療提出新的方案，如漿細(xì)胞靶向治療（如硼替佐米和達(dá)雷木單抗） 和輸注重組ADAMTS13 等。有隊(duì)列研究［19］證實(shí)：TTP 患者急性期后監(jiān)測(cè)ADAMTS13 活性和自身抗體的水平，可以作為達(dá)到緩解和無(wú)病隨訪期間復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)變量。研究［20-21］ 表明：ADAMTS13不僅在TTP 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，在動(dòng)靜脈血栓、炎癥、血管生成和腫瘤生物學(xué)過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。

綜上所述， 本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ADAMTS13 間隔區(qū)突變后的活性降低。ADAMTS13 突變體M4 和突變體M7 可能是ADAMTS13 在底物識(shí)別時(shí)的重要作用位點(diǎn)。因Spacer 結(jié)構(gòu)域的研究局限于體外，在體內(nèi)生理環(huán)境下Spacer 結(jié)構(gòu)域的作用還有待進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：

所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：

王萌和吳昊參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和論文撰寫(xiě)，王萌、吳昊和趙藝?guó)檯⑴c實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)分析，李華和金圣宇參與研究設(shè)計(jì)和研究方案制定，金圣宇參與論文最終修訂和審校。

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