［摘 要］ 目的：采用生物信息學(xué)方法分析M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 （M2-TAMs） 來源唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素15 （Siglec15） 促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC） 惡性生物學(xué)行為的作用，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。方法：應(yīng)用腫瘤免疫評(píng)價(jià)資源 （TIMER） 數(shù)據(jù)庫分析Siglec15在泛癌和癌旁正常組織中的表達(dá)差異及免疫浸潤情況， 實(shí)時(shí)熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測(cè)M2-TAMs 和ESCC EC109 及KYSE150 細(xì)胞中Siglec15 mRNA 表達(dá)水平。在M2-TAMs 與ESCC 細(xì)胞非接觸性共培養(yǎng)基礎(chǔ)上， 分別設(shè)置EC109/KYSE150 組、EC109/KYSE150+si-NC 組（轉(zhuǎn)染si-NC 序列） 和EC109/KYSE150+si-Siglec15 組（分別轉(zhuǎn)染si-Siglec15#1 和si-Siglec15#2 序列），采用CCK-8 法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞劃痕愈合率，Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞中遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：生物信息學(xué)分析，與癌旁正常組織比較，食管癌、結(jié)腸癌和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等泛癌組織中Siglec15 mRNA 表達(dá)水平升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），且食管癌組織中Siglec15 mRNA 表達(dá)水平與巨噬細(xì)胞浸潤呈明顯正相關(guān)關(guān)系（Plt;0. 05）；與EC109 細(xì)胞和KYSE150細(xì)胞比較，M2-TAMs中Siglec15 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 01）。EC109/KYSE150組、EC109/KYSE150+si-NC 組和EC109/KYSE150+si-Siglec15 組細(xì)胞增殖率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。與EC109/KYSE150 組比較，24 和48 h 時(shí)EC109/KYSE150+si-NC 組細(xì)胞劃痕愈合率升高（Plt;0. 01），遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)增加（Plt;0. 05），細(xì)胞凋亡率降低（Plt;0. 01）；與EC109/KYSE150+si-NC 組比較，EC109/KYSE150+si-Siglec15#1 組和EC109/KYSE150+si-Siglec15#2 組細(xì)胞劃痕愈合率降低（Plt;0. 05），遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)減少（Plt;0. 05），細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。結(jié)論：M2-TAMs來源Siglec15可能是促進(jìn)ESCC細(xì)胞遷移和侵襲的關(guān)鍵因子。

［關(guān)鍵詞］ 食管鱗狀細(xì)胞癌； 唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素15； 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞； 細(xì)胞遷移；細(xì)胞侵襲

［中圖分類號(hào)］ R735. 1； Q811. 4 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

食管癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，每年發(fā)病人數(shù)達(dá)60. 4 萬，在所有癌癥中位居第7 位，其死亡率位居第6 位［1］，我國食管癌最常見的組織學(xué)類型為食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cellcarcinoma，ESCC）［2］。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumorassociatedmacrophages， TAMs） 是腫瘤患者體內(nèi)最重要的固有免疫細(xì)胞， 具有明顯的抗炎促癌特征， 其表型與M2 型巨噬細(xì)胞表型較為一致［3-4］。唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素15 （sialic acidbindingimmunoglobulin-like lectin-15，Siglec15） 與B7 家族的同源性高達(dá)30%，表明其具有相似的免疫調(diào)節(jié)功能，并且在某種程度上可以互相促進(jìn)［5］。Siglec15 在正常組織和免疫細(xì)胞中表達(dá)量極低，但在巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，并具有明顯的免疫抑制作用［6］。研究［7-9］ 顯示：Siglec15 在乳腺癌、肺癌和結(jié)腸癌組織中表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，并與腫瘤進(jìn)展及免疫靶向治療有密切關(guān)聯(lián)。但ESCC 中Siglec15 的表達(dá)與調(diào)控作用尚未見報(bào)道。本研究旨在通過檢測(cè)Siglec15 在ESCC 及M2 型TAMs （M2-like TAMs， M2-TAMs） 中表達(dá)情況，并建立M2-TAMs 與ESCC 細(xì)胞共培養(yǎng)模型，探討M2-TAMs 來源Siglec15 對(duì)ESCC 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，為ESCC 的分子靶向治療提供新的思路。

1 材料與方法

1. 1 數(shù) 據(jù) 庫 分 析

利 用 腫 瘤 免 疫 評(píng) 價(jià) 資 源（Tumor Immune Estimation Resource， TIMER） 2. 0數(shù)據(jù)庫（http：//timer. cistrome. org/）分析Siglec15在泛癌組織和正常組織中的表達(dá)水平，通過TIMER數(shù)據(jù)庫（https：//cistrome. shinyapps. io/timer/）“Gene” 模塊分析食管癌組織中主要免疫細(xì)胞如CD8+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（dendriticCells，DCs） 等的免疫細(xì)胞浸潤情況。

1. 2 細(xì)胞、主要試劑和儀器

人ESCC EC109細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 人ESCCKYSE150 細(xì)胞購自上海復(fù)祥生物科技有限公司，人單核細(xì)胞白血病THP-1 細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。青-鏈霉素雙抗、1640 培養(yǎng)基和β-巰基乙醇購自美國Gibco 公司，胰酶-EDTA 購自北京Solarbio公司， 佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA） 購自北京四正柏生物科技有限公司， 胎牛血清（fetal bovine serum， FBS） 購自德國BI 公司，白細(xì)胞介素4 （interleukin-4，IL-4） 和白細(xì)胞介素13 （interleukin-13， IL-13） 購自美國Peprotech 公司， 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-timefluorescence quantitative PCR， RT-PCR） 檢測(cè)試劑盒購自天根生化科技（北京） 有限公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所，Matrigel 基質(zhì)膠購自美國 BD Biosciences 公司，Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，Siglec15、Siglec15 陰性對(duì)照序列（si-NC）和siRNA 序列（si-Siglec15#1 及si-Siglec15#2）由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并制備。BD FACSAria Ⅲ流式細(xì)胞儀購自美國BD Biosciences公司，超凈工作臺(tái)購于新加坡ESCO 公司，紫外分光光度儀購自美國賽默飛世爾科技公司，倒置顯微鏡購于日本奧林巴斯公司， 熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司，-20 ℃冰箱購自海爾集團(tuán)公司。

1. 3 細(xì)胞培養(yǎng)

采用含有10% FBS和1%青-鏈霉素雙抗的1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)貼壁生長的EC109 和KYSE150 細(xì)胞及懸浮生長的THP-1 細(xì)胞。在1640 培養(yǎng)基體系中加入0. 82% β-巰基乙醇，所有細(xì)胞均置于37 ℃、5% CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)和密度，背景干凈無污染，細(xì)胞生長處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)即可進(jìn)行傳代。

1. 4 M2-TAMs條件培養(yǎng)基收集

取對(duì)數(shù)生長期THP-1 細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)。6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種細(xì)胞1. 5×106 個(gè)， PMA 20 μL，每孔補(bǔ)足 2 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；24 h 后換液分別添加20 μg·L-1 IL-4 和IL-13 繼續(xù)誘導(dǎo)48 h，獲得M2-TAMs。 48 h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，1 000 r·min-1 離心5～8 min，收集上層的培養(yǎng)基置于新的管中（棄去細(xì)胞沉淀）。 此上清即為M2-TAMs 條件培養(yǎng)基。

1. 5 M2-TAMs中si-Siglec15轉(zhuǎn)染及分組

分別將si-NC、si-Siglec15#1 和si-Siglec15#2 按照轉(zhuǎn)染說明書對(duì)已誘導(dǎo)獲得的M2-TAMs 進(jìn)行轉(zhuǎn)染， 采用RT-qPCR 法檢測(cè)， 細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。 在 M2-TAMs與 ESCC 細(xì)胞非接觸性共培養(yǎng)基礎(chǔ)上進(jìn)行分組：EC109 組、KYSE150 組、EC109+si-NC 組（轉(zhuǎn)染si-NC 序列）、KYSE150+si-NC （轉(zhuǎn)染si-NC 序列）、EC109+si-Siglec15 組和KYSE150+si-Siglec15 組（分別轉(zhuǎn)染si-Siglec15#1 和si-Siglec15#2 序列）。

1. 6 RT-qPCR 法 檢 測(cè) M2-TAMs 和 EC109 及KYSE150細(xì)胞中Siglec15 mRNA表達(dá)水平

TRIzol法分別提取 M2-TAMs、 EC109 和 KYSE150 細(xì)胞RNA 并驗(yàn)證純度為1. 8～2. 2， 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作逆轉(zhuǎn)錄為cDNA， 使用SYBR greenMaster Mix 進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增。以GAPDH 為內(nèi)參， 采用 2－△△Ct 法分別計(jì)算不同細(xì)胞中 Siglec15mRNA 表達(dá)水平。引物序列：Siglec15，上游引物5'-TACTTCTGCCGCGTGGAGTT-3'， 下游引物5'-CAGCACCGAGATGTTGACGA-3'；GAPDH，上游引物5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'，下游引物5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'。

1. 7 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性

細(xì)胞分組方法見“1. 5”。采用25T 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)ESCC 細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)。向每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔中加入3 000 個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。4～5 h 待其貼壁，棄掉原培養(yǎng)基， 按照實(shí)驗(yàn)分組， 將 si-NC、si-Siglec15#1 和si-Siglec15#2 依次加入所需培養(yǎng)基。每孔總體積為200 μL， 置于37 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別在0、48 和72 h 取出96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，向?qū)嶒?yàn)孔中加入CCK-8試劑（培養(yǎng)體系10%），避免產(chǎn)生氣泡影響吸光度（A） 值， 置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育2～5 h， 全程注意避光操作。孵育完成后取出96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 置于暗盒中上機(jī)檢測(cè)。 采用酶標(biāo)儀于 450 nm 波長處檢測(cè)每孔細(xì)胞 A 值， 以 A 值代表各組細(xì)胞增殖活性。

1. 8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞劃痕愈合率

細(xì)胞分組方法見“1. 5”。在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔鋪1×106個(gè)細(xì)胞， 置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h， 待其貼壁過夜后融合率為 100%。細(xì)胞貼壁后去除原培養(yǎng)基，用尺比對(duì)后采用 100 μL 移液器吸頭保持力度一致，垂直于孔板劃直線，每孔平行劃取 3 條豎直線。PBS 緩沖液緩慢洗滌3 次，避免沖散單層貼壁細(xì)胞，分別按照分組方法加入新鮮無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。在劃痕結(jié)束后立即在顯微鏡下拍照，記為0 h 的圖像。分別在6、24 和48 h 再次拍照。每孔每次至少拍取3 個(gè)固定位置， 采用Image J 軟件測(cè)定劃痕面積，計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率=（起始劃痕面積－ 遷移后劃痕面積） /起始劃痕面積×100%。

1. 9 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞中遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)

細(xì)胞分組方法見“1. 5”。提前12 h 饑餓處理25T 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的ESCC 細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)。向24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每個(gè)孔的上室（8 μm孔徑） 加入細(xì)胞懸液和培養(yǎng)基，總體積為200 μL。下室加入480 μL 1640 原液和120 μL 血清。每孔細(xì)胞數(shù)為 10 000 個(gè)， 每組設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔。將鋪好的24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將小室從 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中取出， PBS 緩沖液漂洗3 次。在 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入 4% 多聚甲醛（每孔 600 μL），將小室浸泡于多聚甲醛中 20 min，防止細(xì)胞形態(tài)改變。再次取出小室， 用PBS 緩沖液漂洗3 次， 倒扣晾干。將結(jié)晶紫用雙蒸水稀釋為0. 1% 濃度（現(xiàn)配現(xiàn)用），加入24 孔小室中（每孔600 μL），將晾干的小室浸泡于結(jié)晶紫中，避光染色20 min。將小室取出，用PBS 緩沖液浸洗，用棉簽擦去小室內(nèi)未遷移的細(xì)胞，倒扣晾干，置于顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，即遷移細(xì)胞數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)需將Martrigel 基質(zhì)膠用1640 原液按1∶8 稀釋后均勻鋪放到24 孔小室的上層，總體積為每孔50 μL，其余步驟同上。

1. 10 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率

細(xì)胞分組法見“1. 5”。采用無EDTA 胰酶處理后貼壁細(xì)胞可被快速離心，從而獲取細(xì)胞懸浮液。收集未經(jīng)處理的貼壁/懸浮細(xì)胞至少每管1×106 個(gè)，按照實(shí)驗(yàn)所需抗體標(biāo)記，分別準(zhǔn)備空白管（僅有未經(jīng)處理細(xì)胞）、單標(biāo)陽性管（僅含有一種抗體標(biāo)記） 和混染管（含有標(biāo)記所有抗體）。收集各組細(xì)胞， 在含1×107 個(gè)細(xì)胞樣本的FACS 管中添加50 μL 流式緩沖劑Buffer，并根據(jù)凋亡檢測(cè)試劑盒說明書添加10 μL的PI 和5 μL Annexin Ⅴ-FITC， 室溫下避光孵育15～20 min。孵育結(jié)束后， 直接加入300～500 μL流式Buffer 重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=右上象限細(xì)胞百分率+右下象限細(xì)胞百分率。

1. 11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 26. 0 和 GraphPadprism 9. 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立且重復(fù)3 次。各組細(xì)胞中Siglec15 mRNA 表達(dá)水平、細(xì)胞增殖活性、劃痕愈合率、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞凋亡率均符合正態(tài)分布，以-x±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 不同組織和細(xì)胞中 Siglec15 mRNA表達(dá)水平及其與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性

多種腫瘤組織中均有Siglec15 mRNA 表達(dá)，且食管癌、結(jié)腸癌和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等泛癌組織中Siglec15 mRNA 表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）（圖1A）。免疫細(xì)胞浸潤分析顯示：食管癌組織中Siglec15 mRNA 表達(dá)水平與巨噬細(xì)胞浸潤呈明顯正相關(guān)關(guān)系（Plt;0. 05）（圖1B）。懸浮生長的THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA、IL-4 和IL-13 處理后誘導(dǎo)為貼壁生長的M2-TAMs， M2-TAMs 中白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10） 和精氨酸酶1 （arginase-1，Arg-1） 表達(dá)水平明顯升高。采用RT-qPCR 法檢測(cè)M2-TAMs、EC109 和KYSE150 細(xì)胞中Siglec15 mRNA 表達(dá)水平， 結(jié)果顯示： 與M2-TAMs （0. 947 64±0. 0184 67） 比較， EC109和 KYSE150 細(xì)胞中 Siglec15 mRNA 表達(dá)水平（0. 165 70±0. 063 91 和0. 051 67±0. 029 96） 降低（Plt;0. 05），提示ESCC 腫瘤微環(huán)境中Siglec15 可能主要來源于M2-TAMs。

2. 2 各組細(xì)胞增殖活性

按不同分組方法處理各組細(xì)胞， 分別共培養(yǎng)24、48 和72 h， 不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞增殖活性比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05），提示M2-TAMs 中的Siglec15 不影響ESCC細(xì)胞增殖活性。見圖2。

2. 3 各組細(xì)胞劃痕愈合率、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)

與 EC109/KYSE150 組比較，24 和 48 h 時(shí)EC109/KYSE150+si-NC 組細(xì)胞劃痕愈合率升高（Plt;0. 01），細(xì)胞中遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)增多（Plt;0. 05）； 與EC109/KYSE150+si-NC 組比較，EC109/KYSE150+si-Siglec15#1 組和EC109/KYSE150+si-Siglec15#2 組細(xì)胞劃痕愈合率降低（Plt;0. 05），細(xì)胞中遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)減少（Plt;0. 05）。見圖3～5 和表1。

2. 4 各 組 細(xì) 胞 凋 亡 率

與 EC109/KYSE150 組比較， EC109/KYSE150+si-NC 組細(xì)胞凋亡率降低（Plt;0. 01）； 與 EC109/KYSE150+si-NC 組比 較， EC109/KYSE150+si-Siglec15#1 組 和EC109/KYSE150+si-Siglec15#2 組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見圖6 和7。

3 討 論

ESCC 是全球常見的惡性腫瘤之一，大多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已進(jìn)入中晚期，預(yù)后較差［10-11］。免疫靶向治療為許多腫瘤患者帶來福音，隨著免疫治療的發(fā)展，進(jìn)展期ESCC 患者采用免疫靶向治療有良好的療效，《中國食管癌放射治療指南（2021 年版） 》已經(jīng)推薦部分藥物作為二線及以上治療的選擇，但仍然存在療效不佳和免疫耐藥的情況［12-13］。腫瘤免疫微環(huán)境的異質(zhì)性是免疫治療的主要挑戰(zhàn)之一，近年來研究［14-16］ 顯示：腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞、DCs和CD4+T 淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞會(huì)逐漸極化或分化為促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的M2-TAMs、耐受性DCs 和調(diào)節(jié)性CD4+T 細(xì)胞，免疫細(xì)胞之間的相互作用更加速了腫瘤免疫逃逸的發(fā)生。通過對(duì)ESCC 關(guān)鍵免疫細(xì)胞分布和功能的研究及對(duì)其在不同腫瘤微環(huán)境中動(dòng)態(tài)變化的分析，可以更好地了解關(guān)鍵的免疫細(xì)胞在ESCC 發(fā)生發(fā)展中的作用，為其有效的免疫治療提供參考。

TAMs 是腫瘤患者體內(nèi)最重要的固有免疫細(xì)胞，具有明顯的抗炎促癌特征，表型傾向M2 巨噬細(xì)胞表型，因此針對(duì)其表型轉(zhuǎn)換的腫瘤免疫治療取得了良好的效果［17］。腫瘤組織中高密度的M2-TAMs誘導(dǎo)免疫抑制，參與組織重塑和促血管生成，是導(dǎo)致多種腫瘤預(yù)后差的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［18］。CD47 在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平較高，且可與巨噬細(xì)胞表面抗人信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α （signal regulatory protein alpha，SIRPα） 跨膜蛋白結(jié)合，形成CD47-SIRPα 復(fù)合物，有效抑制巨噬細(xì)胞的吞噬作用，有助于腫瘤的生長和擴(kuò)散［19-20］。 M2-TAMs 分泌的趨化因子主要參與腫瘤的免疫抑制、基質(zhì)重塑、血管生成、細(xì)胞侵襲和遷移［21］。

最初研究［6］ 顯示： Siglec15 與破骨細(xì)胞分化、骨重塑和微生物感染有關(guān)。一項(xiàng)關(guān)于膀胱癌的研究［22］ 表明： 大多數(shù)高Siglec15 水平的膀胱癌患者主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibilitycomplex，MHC） 分子水平明顯降低，導(dǎo)致其抗原呈遞和處理能力有所降低，因此膀胱癌患者可能成為抗Siglec15 免疫治療的最佳選擇。一項(xiàng)關(guān)于高通量篩選人跨膜蛋白質(zhì)組中調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞活性靶點(diǎn)的研究［23］ 顯示： Siglec15 可能作為免疫調(diào)節(jié)因子參與T 淋巴細(xì)胞功能。進(jìn)一步研究［24］ 顯示：Siglec15 可能主要表達(dá)于髓系細(xì)胞表面，參與透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌、骨肉瘤、肺腺癌等實(shí)體腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Siglec15 在ESCC 中的表達(dá)情況研究較少，且其在ESCC 中的作用尚未明確。

為了更深入地研究腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞源性Siglec15 對(duì)ESCC 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，本研究首先進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示：Siglec15 在食管癌組織中高表達(dá)，并與巨噬細(xì)胞浸潤呈明顯正相關(guān)關(guān)系。本研究對(duì)ESCC 細(xì)胞系和M2-TAMs 中Siglec15 mRNA 表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：M2-TAMs 中Siglec15 mRNA 表達(dá)水平明顯高于ESCC 細(xì)胞， 提示Siglec15 可能是ESCC 腫瘤微環(huán)境中M2-TAMs 產(chǎn)生的重要細(xì)胞因子，與ZHOU 等［25］ 的一項(xiàng)關(guān)于ESCC 患者隊(duì)列分析的研究結(jié)果一致。本研究構(gòu)建了Siglec15 敲降的M2-TAMs模型，采用PMA、IL-4和IL-13孵育刺激THP-1 單核細(xì)胞，成功獲得M2-TAMs，并采用了KELLER 等［26］ 的轉(zhuǎn)染方法進(jìn)一步探討M2-TAMs源性Siglec15 對(duì)腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，結(jié)果顯示： Siglec15 敲低后M2-TAMs 并未對(duì)ESCC 細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響，但與M2-TAMs 共培養(yǎng)后ESCC 細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)，Siglec15 敲低后ESCC 細(xì)胞的遷移和侵襲能力則明顯受到抑制，提示M2-TAMs 來源的Siglec15 可增強(qiáng)ESCC 的遷移和侵襲能力，該結(jié)論也在骨肉瘤中得到證實(shí)［27］。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細(xì)胞凋亡有密切關(guān)聯(lián)［28］， 本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡的情況，結(jié)果顯示：M2-TAMs 共培養(yǎng)后的ESCC 細(xì)胞抗凋亡能力明顯增強(qiáng)，而Siglec15 敲低后ESCC 細(xì)胞的凋亡能力無明顯改善，提示M2-TAMs 來源Siglec15 可能并未參與ESCC 抗凋亡的調(diào)控。

綜上所述， 腫瘤微環(huán)境中M2-TAMS 可能是Siglec15 主要來源的免疫細(xì)胞， Siglec15 可能是參與TAMs 促進(jìn)ESCC 細(xì)胞遷移和侵襲的關(guān)鍵細(xì)胞因子。

利益沖突聲明：

所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：

任祎琳參與選題、數(shù)據(jù)收集整理和論文撰寫，臧翌辰、薛樂樂和楊凱歌參與實(shí)驗(yàn)操作過程，陳素芳和王魏楠參與論文中數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，羅成華和梁偉華參與論文審校，王良海、李鋒和胡建明參與指導(dǎo)論文撰寫。

[參考文獻(xiàn)]

［1］ SUNG H， FERLAY J， SIEGEL R L， et al. Globalcancer statistics 2020： GLOBOCAN estimates ofincidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185countries［J］. CA Cancer J Clin， 2021， 71（3）： 209-249.

［2］ 地力亞爾·吾斯曼江， 王 巖， 張玉俊， 等. 2006—2020年中國食管癌死亡趨勢(shì)及其年齡-時(shí)期-隊(duì)列模型分析［J］. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)， 2023， 31（7）： 1323-1329.

［3］ ANDERSON N R， MINUTOLO N G， GILL S， et al.Macrophage-based approaches for cancerimmunotherapy［J］. Cancer Res， 2021， 81（5）： 1201-1208.

［4］ LI M J， HE L Y， ZHU J， et al. Targeting tumorassociatedmacrophages for cancer treatment［J］. CellBiosci， 2022， 12（1）： 85.

［5］ CAO X， ZHOU Y D， MAO F， et al. Identification andcharacterization of three Siglec15-related immune andprognostic subtypes of breast-invasive cancer［J］. IntImmunopharmacol， 2022， 106： 108561.

［6］ FAN M K， ZHANG G C， XIE M F， et al. Siglec-15 asa new perspective therapy target in human giant celltumor of bone［J］. Curr Oncol， 2022， 29（10）： 7655-7671.．

［7］ MUTKA M， JOENSUU K， HEISKALA M， et al.Core needle biopsies alter the amounts of CCR5， Siglec-15， and PD-L1 positivities in breast carcinoma［J］.Virchows Arch， 2023， 483（2）： 215-224.

［8］ LIANG H F， CHEN Q， HU Z C， et al. Siglec15facilitates the progression of non-small cell lung cancerand is correlated with spinal metastasis［J］. Ann TranslMed， 2022， 10（6）： 281.

［9］ DU H， TANG J L， LI X Y， et al. Siglec-15 is animmune suppressor and potential target forimmunotherapy in the pre-metastatic lymph node ofcolorectal cancer［J］. Front Cell Dev Biol ， 2021 ，9： 691937.

［10］ROGERS J E， SEWASTJANOW-SILVA M，WATERS R E， et al. Esophageal cancer： emergingtherapeutics［J］. Expert Opin Ther Targets， 2022 ，26（2）： 107-117.

［11］RUSTGI A K， EL-SERAG H B. Esophagealcarcinoma［J］. N Engl J Med， 2014， 371（26）： 2499-2509.

［12］SALMI S， SIISKONEN H， SIRONEN R， et al. Thenumber and localization of CD68+ and CD163+macrophages in different stages of cutaneousmelanoma［J］. Melanoma Res， 2019， 29（3）： 237-247.

［13］PETRILLO A， SMYTH E C. Immunotherapy forsquamous esophageal cancer： a review［J］. J Pers Med，2022， 12（6）： 862.

［14］QI L， YU H Q， ZHANG Y， et al. IL-10 secreted byM2 macrophage promoted tumorigenesis throughinteraction with JAK2 in glioma［J］. Oncotarget， 2016，7（44）： 71673-71685.

［15］BOSTEELS C， NEYT K，VANHEERSWYNGHELS M， et al. Inflammatorytype 2 cDCs acquire features of cDC1s and macrophagesto orchestrate immunity to respiratory virus infection［J］.Immunity， 2020， 52（6）： 1039-1056.e9.

［16］TOOR S M， MURSHED K， AL-DHAHERI M， et al.Immune checkpoints in circulating and tumor-infiltratingCD4+ T cell subsets in colorectal cancer patients［J］.Front Immunol， 2019， 10： 2936.

［17］QUARANTA V， SCHMID M C. Macrophagemediatedsubversion of anti-tumour immunity［J］. Cells，2019， 8（7）： 747.

［18］HUANG R L， WANG S Q， WANG N， et al. CCL5derived from tumor-associated macrophages promotesprostate cancer stem cells and metastasis via activatingβ -catenin/STAT3 signaling［J］. Cell Death Dis， 2020，11（4）： 234.

［19］MATLUNG H L， SZILAGYI K， BARCLAY N A，et al. The CD47-SIRPα signaling axis as an innateimmune checkpoint in cancer［J］. Immunol Rev， 2017，276（1）： 145-164.

［20］JIA X， YAN B J， TIAN X Q， et al. CD47/SIRPαpathway mediates cancer immune escape andimmunotherapy［J］. Int J Biol Sci， 2021， 17（13）： 3281-3287.

［21］汪 鵬， 仇建南， 王忠夏， 等. 肝癌微環(huán)境中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的研究進(jìn)展［J］. 臨床肝膽病雜志， 2023，39（5）： 1212-1218.

［22］HU J， YU A Z， OTHMANE B， et al. Siglec15 shapesa non-inflamed tumor microenvironment and predicts themolecular subtype in bladder cancer［J］. Theranostics，2021， 11（7）： 3089-3108.

［23］CHEN J， TAN Y， SUN F H， et al. Single-celltranscriptome and antigen-immunoglobin analysis revealsthe diversity of B cells in non-small cell lung cancer［J］.Genome Biol， 2020， 21（1）： 152.

［24］LIU W T， JI Z， WU B R， et al. Siglec-15 promotes themigration of liver cancer cells by repressing lysosomaldegradation of CD44［J］. FEBS Lett， 2021， 595（17）：2290-2302.

［25］ZHOU S， WANG Y T， ZHANG R， et al. Associationof sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin 15 withphenotypes in esophageal squamous cell carcinoma in thesetting of neoadjuvant chemoradiotherapy［J］. JAMANetw Open， 2023， 6（1）： e2250965.

［26］KELLER A A， MAE? M B， SCHNOOR M， et al.Transfecting macrophages ［J］. Methods Mol Biol，2018， 1784： 187-195.

［27］ZHENG B X， SONG K L， SUN L L， et al. Siglec-15-induced autophagy promotes invasion and metastasis ofhuman osteosarcoma cells by activating the epithelialmesenchymaltransition and Beclin-1/ATG14pathway［J］. Cell Biosci， 2022， 12（1）： 109.

［28］張紹謹(jǐn)， 閆澤晨， 李 騰， 等. 長鏈非編碼RNA SNHG15對(duì)腎細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、 凋亡、 遷移和侵襲的影響［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）， 2023， 58（6）： 781-785.

[基金項(xiàng)目] 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81960435）；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)指導(dǎo)性科技計(jì)劃項(xiàng)目（2022DZ003）