摘 要： 為了在活細(xì)胞RNA 成像中提供更加精準(zhǔn)的工具，本文旨在基于broccoli 的RNA 熒光標(biāo)記創(chuàng)建熒光強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好的綠色熒光適體. 采用理性設(shè)計(jì)對(duì)broccoli 進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)測(cè)定光譜特征和理化性質(zhì)對(duì)broccoli 變體進(jìn)行多輪篩選. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)基于對(duì) RNA 熒光適配體broccoli 的三輪突變篩選，獲得了熒光強(qiáng)度提升3. 3 倍的 broccoli 四位點(diǎn)突變體（命名為Bro）；再利用設(shè)計(jì)的 3WJ 支架，組建了3WJ-n×Bro RNA 熒光適配體家族；采用嵌入串聯(lián)重復(fù)Bro的方式可以顯著提升適體的熒光強(qiáng)度，其中3WJ-4×Bro 的熒光強(qiáng)度超過(guò)3WJ-Bro 的2. 7 倍，且表現(xiàn)出更低的鹽離子依賴性和更高的熱穩(wěn)定性、光穩(wěn)定性和監(jiān)測(cè)靈敏度. 結(jié)果表明本文設(shè)計(jì)出的 3WJ-n×Bro 家族并從中篩選出優(yōu)異的核酸適配體 3WJ-4×Bro，可為在RNA 水平上實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞RNA 成像提供可視化工具.

關(guān)鍵詞： RNA 熒光適體； Broccoli 適體； RNA 成像

中圖分類號(hào)： Q74 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A DOI： 10. 19907/j. 0490-6756. 2024. 046003

1 引言

在生物大分子中，核糖核酸（RNA）具有重要的生物學(xué)功能，參與細(xì)胞內(nèi)的生命活動(dòng)［1］. 在活細(xì)胞中，RNA 也具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、種類繁多的生物學(xué)功能以及復(fù)雜的時(shí)間空間分布. 如線粒體lncRNAIDL 調(diào)控腫瘤細(xì)胞氧化磷酸化產(chǎn)生ATP 及細(xì)胞生長(zhǎng)［2］. 與蛋白質(zhì)相比，RNA 種類更多，但它們中的大部分功能尚未被鑒定，也因此被稱為基因組中的“暗物質(zhì)”［3］. 因此，在分子水平上可視化活細(xì)胞內(nèi)RNA 如何轉(zhuǎn)錄、剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)、降解和亞細(xì)胞定位等過(guò)程具有重要的生物學(xué)意義.

RNA 成像是研究RNA 生物學(xué)的重要工具，RNA 成像技術(shù)在固定細(xì)胞和活細(xì)胞中都得到了快速發(fā)展. 1982 年，Singer 和Ward［4］率先展示了用于RNA 檢測(cè)的熒光原位雜交（FISH）；熒光標(biāo)記的RNA［5］、RNA 干擾［6］和熒光RNA［7］這3 個(gè)系統(tǒng)都是最早開(kāi)發(fā)的在活細(xì)胞中可視化RNA 的方法，到目前為止，用于細(xì)胞RNA 的影像解析技術(shù)主要包括熒光原位雜交技術(shù)、生物酶修飾的RNA 標(biāo)簽技術(shù)、分子信標(biāo)技術(shù)、熒光蛋白-RNA 結(jié)合蛋白技術(shù)以及熒光RNA 技術(shù)，其中前2 種技術(shù)只能用于固定細(xì)胞即死細(xì)胞中RNA 的熒光標(biāo)記，而后3 種技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞RNA 的熒光標(biāo)記與成像. 其中對(duì)于Spinach-DFHBI 的優(yōu)化，一方面是序列優(yōu)化，基于對(duì)Spinach 的理性修飾產(chǎn)生了序列更短的iSpinach（69 nt）［8］和Baby Spinach（51 nt）［9］，但熒光效果提升幅度不顯著. 另一方面是開(kāi)發(fā)了新的熒光素DFHBI-1T［10］，Spinach-DFHBI-1T 復(fù)合物的熒光強(qiáng)度達(dá)到了GFP 的88%，卻存在穩(wěn)定性改善效果不顯著. 隨后，Jaffrey 團(tuán)隊(duì)結(jié)合改進(jìn)的SELEX 篩選和熒光激活的細(xì)胞分選（FACS）篩選到了1 個(gè)49nt 適體Broccoli［11］，有效提高了適體對(duì)高鹽離子的依賴性，然而單個(gè)broccoli 在RNA 成像中低豐度，不易檢測(cè)與成像. Zhang 等采用64 個(gè)串聯(lián)重復(fù)Spinach 標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)mRNA，顯著增強(qiáng)其熒光強(qiáng)度［12］，但較長(zhǎng)的RNA 標(biāo)記可能對(duì)RNA 的正常生理過(guò)程產(chǎn)生影響.

因此，為進(jìn)一步提升broccoli 在細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度和穩(wěn)定性. 本文研究旨在改進(jìn)broccoli 序列以獲得熒光信號(hào)增強(qiáng)的broccoli 單元，通過(guò)設(shè)計(jì)新支架和低拷貝串聯(lián)重復(fù)策略，構(gòu)建高熒光強(qiáng)度和穩(wěn)定性的新適體. 在本實(shí)驗(yàn)中，首先以Spinach2（與broccoli 高度同源）為基礎(chǔ)，對(duì)broccoli 的序列進(jìn)行單位點(diǎn)到多位點(diǎn)的多輪突變和體外熒光篩選出增強(qiáng)4 倍的熒光適體單元Bro. 接著，設(shè)計(jì)了3WJ 新型支架，構(gòu)建了3WJ-n×Bro 適體家族，通過(guò)對(duì)3WJ-n×Bro 家族的折疊效率、離子依賴性、熒光強(qiáng)度、光穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性表征，篩選最優(yōu)適體3WJ-4×Bro. 最后，我們通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)評(píng)估了3WJ-4×Bro 作為RNA 標(biāo)記熒光報(bào)告ROI 的能力.

2 材料與方法

2. 1 材料與儀器

PCR 儀（C1000 thermal cycler）、熒光定量PCR 購(gòu)于Bio-Rad 公司；F-7000 熒光分光光度計(jì)購(gòu)于日立（中國(guó)）有限公司；Thermo Fisher 全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀購(gòu)于賽默飛世爾科技公司；DFHBI-1T（Lucerna）購(gòu)于美國(guó)MedChemexpress 生物科技公司；所有DNA 引物由成都生工生物有限公司合成；DNA 限制性內(nèi)切酶Sac Ⅰ、Sac Ⅱ、Xba Ⅰ等、T4 DNA Ligase 購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司.

2. 2 方法

2. 2. 1 broccoli 變體序列設(shè)計(jì)和篩選

采用RNAfolder（http：//rna. tbi. univie. ac. at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold. cgi）、RNA Composer（http：//rnacomposer. cs. put. poznan. pl/）對(duì)broccoli的序列和晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行最小自由能二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)以及3D 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，對(duì)broccoli 的核心結(jié)構(gòu)序列和側(cè)翼序列進(jìn)行多輪系統(tǒng)突變和熒光篩選；采用Mfold 和RNA Composer 在線工具，以F30 支架序列為基序，設(shè)計(jì)了8 個(gè)新的三叉結(jié)構(gòu)支架（F31-F37）篩選熒光強(qiáng)度最大的適體支架，命名為3WJ.以3WJ-Bro 為基礎(chǔ)，構(gòu)建3WJ-2×Bro、3WJ-4×Bro 和3WJ-6×Bro.

2. 2. 2 載體構(gòu)建與RNA 體外轉(zhuǎn)錄

將合成基因序列，克隆到pBluscript ⅡSK（ +）質(zhì)粒的T7啟動(dòng)子下游（Xba Ⅰ和Sac Ⅰ兩酶切位點(diǎn)之間）. 采用通用引物M13F 和M13R 擴(kuò)增上游帶有T7 啟動(dòng)子的適體DNA 序列. 采用PCR 純化回收試劑盒（全式金公司）進(jìn)行純化回收，測(cè)定濃度，并稀釋到相同濃度作為體外轉(zhuǎn)錄模板；采用Xba Ⅰ 和 Sac Ⅰ 雙酶切載體和pBluescript Ⅱ SK（+）-3WJ-4×Bro，將3WJ-4×Bro 片段亞克隆到pBluescript ⅡSK（ +）-AtCLE 的 Xba Ⅰ和 Sac Ⅰ位點(diǎn)之間，構(gòu)建pBluescript Ⅱ SK（ +）-AtCLE-3WJ-4×Bro，用以提供體外轉(zhuǎn)錄模板.

體外轉(zhuǎn)錄采用in vitro Transcription T7 Kit（TaKaRa）進(jìn)行，輕輕混勻后于37 ℃孵育2 h. 然后加入3 μL RNase free DNase Ⅰ ，輕輕混勻后轉(zhuǎn)入42 ℃孵育30 min，用于去除模板DNA，結(jié)束后測(cè)定RNA 濃度和純度，利用熒光定量PCR 儀器對(duì)broccoli系統(tǒng)突變體進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)［8］. 采用96 孔板加樣. 每樣孔除了包含in vitro Transcription T7Kit 的轉(zhuǎn)錄試劑外，還包含終濃度為60 μmol/LDFHBI-1T、10 mmol/L MgCl2、50 mmol/L KCl.將板放入BioRad CFX96 儀器4 ℃封閉5 min，然后轉(zhuǎn)入37 ℃ 持續(xù)1 h. 采用所有通道（ 包括FAM/SYBR 濾光片）讀板，讀板時(shí)間間隔為2 min. 然后導(dǎo)出數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，比較各突變體的最大熒光值，初始熒光定義為4～8 min 的熒光改變量.

2. 2. 3 相關(guān)理化性質(zhì)檢測(cè)

添加終濃度為50 μmol/L 精制適體RNA 于含有5 mmol/LMgCl2、10 μmol/L DFHBI-1 的1×HEPES 緩沖液中，置于PCR 儀器95 ℃加熱3 min，然后緩慢冷卻到室溫，設(shè)定降溫梯度設(shè)置為1 ℃/min，重折疊適體RNA，采用日立F7000 熒光分光光度儀對(duì)以上反應(yīng)液進(jìn)行光譜掃描，確定最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)；采用CFX96 上的BioRad 軟件確定熔解曲線和自動(dòng)計(jì)算的溫度T 值，適體RNA-DFHBI-1T 復(fù)合物95 ℃加熱3 min，然后緩慢冷卻到室溫，設(shè)定降溫梯度設(shè)置為1 ℃/min，重折疊適體RNA，循環(huán)3 次，每次循環(huán)檢測(cè)熒光恢復(fù)率；適體RNA-DFHBI-1T復(fù)合物采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定初始熒光（Fi），而后在日光燈（1500 lx）下放置5 h，每小時(shí)再次測(cè)定熒光剩余量（Fn），測(cè)定5 次，采用以下公式計(jì)算相對(duì)熒光衰退率（RFDR）：RFDR=（Fi-Fn）/Fi×100%（n=1～5）；形成總體積1 mL 的RNADFHBI-1T 溶液，將反應(yīng)液置于PCR 儀器95 ℃加熱3 min，然后緩慢冷卻到室溫，溫度降幅設(shè)置為1 ℃/min，重折疊適體RNA 采用日立F7000 熒光分光光度儀進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)定，繪制熒光強(qiáng)度對(duì)于鹽濃度的相關(guān)曲線.

3 結(jié)果與分析

3. 1 broccoli 篩選結(jié)果

3. 1. 1 通過(guò)多輪篩選得到broccoli 四突變體Bro

優(yōu)化適體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的方式是探究增強(qiáng)熒光RNA適體的熒光強(qiáng)度和穩(wěn)定性重要途徑之一，首先通過(guò)位點(diǎn)推理突變的方式獲得更優(yōu)broccoli. 我們參考 Spinach（與broccoli 序列高相似）的結(jié)構(gòu)進(jìn)行理性突變，發(fā)現(xiàn)6、7、10、11、35、38、40、42 位上的8 個(gè)G 構(gòu)成核心G 四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，由13U、31U、34A 構(gòu)成了“ 蓋子”結(jié)構(gòu)，這2 部分是broccoli 的核心結(jié)構(gòu).因此我們?cè)谶@部分不進(jìn)行突變處理. 而9、36、43、44 位構(gòu)成了底托結(jié)構(gòu)，于是推測(cè)該部分可能對(duì)G四聯(lián)體的穩(wěn)定性有影響，所以我們對(duì)這4 個(gè)位點(diǎn)也進(jìn)行了系統(tǒng)突變（將該位點(diǎn)的核苷酸分別替換成其他3 種核苷酸之一）. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這4 個(gè)和核苷酸的任意突變都導(dǎo)致了熒光的急劇下降（圖1）. 這表明9、36、43、44 位核苷酸是broccoli 的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)之一. 位于“ 蓋子”平面上方的14、32、33 位核苷酸，我們嘗試對(duì)該結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)突變. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，14C 和33G 突變后導(dǎo)致熒光消失；32C 突變成G 導(dǎo)致熒光較低，而突變成T 熒光相對(duì)于broccoli 增加了1. 8 倍；這表明14C，32T，33G 位點(diǎn)構(gòu)成的“ 蓋頂”結(jié)構(gòu)更有助于“ 蓋子”將DFHBI-1T 穩(wěn)固在G-四聯(lián)體中，從而增強(qiáng)熒光；21～24 位核苷酸可能構(gòu)成broccoli 頂環(huán)，而彼此又是非成對(duì)堿基，可以在空間及其他位置產(chǎn)生作用力，因此，我們對(duì)這些位點(diǎn)也進(jìn)行了突變處理. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，21T 突變?yōu)锳或G，22T 突變?yōu)锳 或G，23C 突變成A 或T 或G，24G 突變?yōu)锳 或C，均可提高了broccoli 的熒光強(qiáng)度，其中突變體bro-23A 的熒光強(qiáng)度是broccoli 的3 倍. 1～5 和45～49 構(gòu)成了基部莖，其中內(nèi)部的3～5 和45～47 位應(yīng)該具備高的T 以維護(hù)broccoli 其自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性. 我們?cè)谶@幾個(gè)位點(diǎn)也做了突變.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，我們?cè)黾訅A基配對(duì)，如4A 變成C 與26位G 配對(duì)或46G 變成T 與4 位A 配對(duì)，5C 突變?yōu)镚 與47 為C 配對(duì)，都顯著提升了broccoli 的熒光強(qiáng)度，而減少堿基配對(duì)則顯示降低熒光強(qiáng)度（圖1）.從上面推理突變中，我們找到可以提升broccoli 熒光的13 個(gè)突變位點(diǎn)，產(chǎn)生了15 個(gè)熒光顯著增強(qiáng)的broccoli 單突變體. 我們?cè)赽roccoli 的不同區(qū)段選擇了熒光顯著增強(qiáng)的7 個(gè)位點(diǎn)突變體bro-4C，bro-5G，bro-22G，bro-23A，bro-32T，bro-43A 和bro-46T（圖1 黑色箭頭所示）.

其次從第1 輪篩選的單突變位點(diǎn)中，我們將以上選擇的7 個(gè)單突變位點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)組合，共產(chǎn)生了21 個(gè)雙突變體，測(cè)定熒光的相對(duì)定量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，17 個(gè)雙突變組合的熒光強(qiáng)度均相對(duì)于其單突變體的熒光有所降低（圖2 綠色所示）. 但我們發(fā)現(xiàn)，有4 對(duì)雙突變組合分別高于該位點(diǎn)兩單突的熒光強(qiáng)度，這說(shuō)明突變的兩位點(diǎn)可以促進(jìn)broccoli 核心的穩(wěn)定性（圖2 綠色所示）. 我們篩選了3 種broccoli雙突變體：5G-46U、23A-32U 和32U-43A. 其熒光強(qiáng)度明顯高于最優(yōu)單突的熒光強(qiáng)度（ 圖2虛線）.

最后從第2 輪篩選出了3 組雙位點(diǎn)突變組合，我們將其組合形成3 組合點(diǎn)突變組合，即5G-23A-32U-46U、5G-32U-43A-46U 和23A-32U-43A，并測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基于5G-46U 和23A-32U 組合的四突變體 5G-23A-32U-46U 的熒光強(qiáng)度均高于兩雙突的熒光強(qiáng)度（圖3a）. 這表明5G-46U 與23A-32U 存在直接或者間接的相互作用可以促進(jìn)broccoli 的有效折疊，提升熒光強(qiáng)度.基于5G-46U 和32U-43A 的四突變體5G-32U-43A-46U 的熒光強(qiáng)度并未得到改善，而且基于23A-32U 和32U-43A 的三突組合23A-32U-43A 熒光反而低于雙突組合（圖3a）. 這進(jìn)一步表明5G 和23A 可以與43A 和46U 作用以穩(wěn)定broccoli 的結(jié)構(gòu). 5G-23A-32U-46U 組合的熒光強(qiáng)，其相對(duì)熒光強(qiáng)度是broccoli 熒光強(qiáng)度（綠色虛線所示）的4. 41倍，是最優(yōu)雙突變體（23A-32U）熒光強(qiáng)度（黑色虛線所示）的1. 2 倍和最優(yōu)單突變體（bro-23A）熒光強(qiáng)度（紅色虛線所示）的1. 3 倍. 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，broccoli 在5、23、32、41、46 的堿基優(yōu)化促進(jìn)了broccoli 二級(jí)結(jié)構(gòu)的折疊（圖3b）. 通過(guò)以上3 輪篩選，我們最終獲得了1 個(gè)優(yōu)化的broccoli 四突變體5G-23A-32U-46U，并將其命名為Bro.

3. 1. 2 3WJ-Bro 設(shè)計(jì)及其體外熒光表現(xiàn)

為了增強(qiáng)Bro 熒光效果的穩(wěn)定性，我們通過(guò)設(shè)計(jì)支架輔助折疊進(jìn)一步增強(qiáng)熒光，以F30 支架融合的Bro 為對(duì)照，將新設(shè)計(jì)8 個(gè)三叉結(jié)構(gòu)支架F31-F37 與Bro 融合進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄成像. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8 個(gè)新設(shè)計(jì)的支架中，5 個(gè)支架（F33～F37）有效提升Bro 的熒光強(qiáng)度，其中F35-Bro 的熒光強(qiáng)度顯著高于F30-Bro.因此，將F35 支架命名為3WJ 支架（圖4a）. 3WJ 與F30 支架序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，3WJ 進(jìn)行了11 位的核苷酸突變和2 個(gè)位點(diǎn)的插入缺失突變（圖4b）. 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，3WJ 設(shè)計(jì)了1 個(gè)新的莖環(huán)結(jié)構(gòu)用于引入適體插入位點(diǎn)（圖4b）. F30-Bro 和3WJBro體外熒光成像結(jié)果顯示， 3WJ-Bro 的熒光亮度明顯高于F30-Bro（圖4c）. 2 種熒光適體的熒光定量結(jié)果顯示，3WJ-Bro 的熒光強(qiáng)度是F30-Bro 熒光強(qiáng)度的1. 2 倍（ 圖4d、4e），表明新設(shè)計(jì)的3WJ 比F30 對(duì)Bro 的熒光提升能力更強(qiáng).

3. 1. 3 3WJ-n×Bro 家族設(shè)計(jì)增強(qiáng)熒光效果

由于3WJ 支架對(duì)Bro 的熒光強(qiáng)度幅度較小，為了進(jìn)一步增強(qiáng)3WJ-n×Bro 的熒光效果，我們嘗試采用串聯(lián)重復(fù)使用的方式，在3WJ 支架中串聯(lián)插入多個(gè)Bro 單元，構(gòu)建1 個(gè)3WJ-n×Bro 家族，探究更有效的提升適體熒光強(qiáng)度的組合. 基于3WJ-Bro，在3WJ 支架中另一個(gè)凸環(huán)再引入1 個(gè)broccoli，形成3WJ-2×Bro，采用MFE 分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)，兩分子Bro 保持正常的折疊狀態(tài)（圖5）. 同時(shí)，我們?cè)O(shè)計(jì)了長(zhǎng)37 nt 莖環(huán)結(jié)構(gòu)連接體（linker1，紅色標(biāo)記）、1 個(gè)42 nt 連接體（linker2，綠色標(biāo)記），用于穩(wěn)定Bro 構(gòu)象. 二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，3WJ-2×Bro，3WJ-4×Bro 和3WJ-6×Bro 的每個(gè)Bro 單元都保持相同的折疊結(jié)構(gòu)（圖5，藍(lán)色標(biāo)記）.

結(jié)果顯示，3WJ-2×Bro 的實(shí)際熒光強(qiáng)度是3WJ-Bro 的2. 0 倍，這與Bro 單元的數(shù)量比一致，表明3WJ-2×Bro 與3WJ-Bro 中的Bro 單元擁有相同水平的折疊. 然而3WJ-4×Bro 和3WJ-6×Bro 的熒光強(qiáng)度僅為3WJ-Bro 的2. 7 倍和1. 9 倍，表明雖然向3WJ 支架中引入多個(gè)Bro 單元可以增加熒光強(qiáng)度，但Bro 數(shù)量的增加會(huì)影響自身的有效折疊，使熒光激發(fā)效率降低. 其中3WJ-4×Bro 熒光強(qiáng)度最高，達(dá)5000 a. u.（圖6b）.

3. 2 3WJ-n×Bro 家族理化性質(zhì)結(jié)果

3. 2. 1 3WJ-n×Bro 家族的熱穩(wěn)定性評(píng)估

適體的熱穩(wěn)定性對(duì)其表征有一定影響，我們對(duì)3WJ-n×Bro 家族的熒光強(qiáng)度隨變性溫度（T）的變化進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3WJ-Bro 的T 值（52 ℃）顯著高于F30-Bro T 值（48. 3 ℃），表明3WJ 對(duì)Bro 的折疊效果強(qiáng)于F30 支架（圖7a）. 在3WJ-n×Bro 家族中，3WJ-2×Bro 與3WJ-4×Bro 的T 分別為53. 1 ℃和54. 3 ℃ ，3WJ-6×Bro 的T 50 ℃ ，3WJ-Bro 和F30-Bro 的T 值均高于Bro 的T（46 ℃），表明3WJ 之間難以維持6 個(gè)Bro 單元的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性（圖7a）. 然后，我們將3WJ-n×Bro RNA 與DFHBI-1T 混合物進(jìn)行95 ℃變性，然后緩慢冷卻到室溫退火，循環(huán)3 次，每次循環(huán)檢測(cè)熒光熒光恢復(fù)率，測(cè)試了3WJ-n ×Bro 在經(jīng)過(guò)多輪熔解、冷卻后的熒光恢復(fù)能力. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在3WJ-n×Bro 家族中，3WJ-2×Bro 和3WJ-4×Bro 的熒光恢復(fù)率最強(qiáng)，達(dá)到了初始熒光的88%. 這表明3WJ-n×Bro 家族在經(jīng)過(guò)多輪熱變性后還能恢復(fù)較高的有效折疊率，從而具有較高的熱穩(wěn)定性，其中3WJ-2×Bro 和3WJ-4×Bro 穩(wěn)定性最好.

3. 2. 2 3WJ-n×Bro 家族的光穩(wěn)定性評(píng)估

通過(guò)測(cè)定各個(gè)復(fù)合物的初始熒光，用488 nm 的激發(fā)光照射2 min 后暴露于日光燈（1500 lx）5 h，每1 h 測(cè)定1 次熒光剩余量，測(cè)定5 次，計(jì)算相對(duì)熒光衰退率（RFDR）來(lái)探究3WJ-n×Bro 家族的光穩(wěn)定性.結(jié)果顯示，在處理后5 h 內(nèi)3WJ-n×Bro 家族的熒光殘余量始終高于F30-Bro 的熒光殘余，3WJ-n×Bro 家族在光處理5 h 內(nèi)表現(xiàn)出相似的熒光衰退率，且遠(yuǎn)小于F30-Bro（圖8）. 這表明3WJ-n×Bro家族擁有相對(duì)高的光穩(wěn)定性. 其中3WJ-4×Bro 較高的熒光強(qiáng)度和較好的光穩(wěn)定性使其具有更好的應(yīng)用潛力.

3. 2. 3 3WJ-n×Bro 家族的鹽離子依賴性評(píng)估

通過(guò)檢測(cè)3WJ-n×Bro 家族在不同濃度Mg2+和K+條件下的熒光強(qiáng)度，探究3WJ-n×Bro 家族對(duì)這2種離子的依賴性. 結(jié)果顯示，當(dāng)Mg2+ 濃度在2 mmol/L 內(nèi)時(shí)，所有適體的熒光強(qiáng)度隨Mg2+濃度增加而急劇升高，Mg2+濃度超過(guò)2 mmol/L 時(shí)熒光增幅降低. 3WJ-n×Bro家族和F30-Bro在5 mmol/LMg2+ 出熒光達(dá)到平臺(tái)期，這與broccoli 的趨勢(shì)相同. 我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)，3WJ-n×Bro 家族和F30-Bro 存在相同的解離常數(shù)Kd （ Kd=1. 4 mmol/L），這表明3WJ-n×Bro 家族和F30-Bro 對(duì)Mg2+具有相同親和性（圖9a）. 適體對(duì)K+的依賴性測(cè)定結(jié)果顯示，當(dāng)K+增加到60 mmol/L 時(shí)，所有適配的熒光強(qiáng)度進(jìn)入平臺(tái)期. 此外，所有適體的表現(xiàn)出有相同的K+結(jié)合親和力（Kd=15 mmol/L）（圖9b），這一結(jié)果與broccoli 相似. 以上結(jié)果表明，3WJ-n×Bro 家族和broccoli 擁有較低的鹽離子依賴性.

3. 2. 4 3WJ-4×Bro 報(bào)告體外ROI 的靈敏度

通過(guò)將3WJ-4×Bro DNA 序列克隆到AtCLE 基因的3 ′UTR 區(qū)，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄獲得3WJ-4×Bro 標(biāo)記的AtCLE RNA. 將AtCLE RNA 稀釋成一系列濃度梯度然后與過(guò)量的DFHBI-1T 孵育5 min 后進(jìn)行熒光成像和熒光定量，以此來(lái)確定3WJ-4×Bro 用于報(bào)告ROI 的靈敏度以及3WJ-4×Brod 的熒光強(qiáng)度與ROI 濃度的關(guān)系. 結(jié)果顯示，當(dāng)AtCLE RNA稀釋低至0. 25 μmol/L 時(shí)可檢測(cè)到明顯的綠色熒光. 隨著AtCLE RNA 含量的增加，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，當(dāng)超過(guò)8 μmol/L 時(shí)，熒光過(guò)曝（圖10a）. 因此3WJ-4×Bro 報(bào)告體外ROI 具有較高的靈敏度. 熒光量化數(shù)據(jù)顯示，AtCLE RNA 含量在0. 25～8 μmol/L 范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度隨AtCLE RNA 濃度增加呈線性增加趨勢(shì)（圖10b）. 因此，基于這種線性關(guān)系，我們提供了體外ROI 定量的新方法.

4 討論

目前SELEX 篩選和系統(tǒng)突變篩選是主要的RNA 熒光適體篩選方式［13］. 本研究中，我們參考Spinach（與broccoli 序列高相似）的結(jié)構(gòu)進(jìn)行理性突變，在第1 輪突變篩選中，在系統(tǒng)突變的18 個(gè)位點(diǎn)中，3、8、9、33、44、47 號(hào)位的核苷酸發(fā)生任何堿基的替換均導(dǎo)致broccoli 熒光的急劇下降，而這些位點(diǎn)并不是G-四聯(lián)體的核心結(jié)構(gòu)，說(shuō)明這些位點(diǎn)的核苷酸對(duì)G-四聯(lián)體二層堆疊結(jié)構(gòu)具有協(xié)助作用. 本輪突變中共10 個(gè)位點(diǎn)的突變可以提升broccoli的熒光強(qiáng)度，21～24 號(hào)位突變成另外2 個(gè)堿基均能提升broccoli 的熒光強(qiáng)度，其他位點(diǎn)只能突變成特定堿基才能提升broccoli 熒光強(qiáng)度（圖1），這可能是21～24 號(hào)位于頂端莖環(huán)區(qū)，該區(qū)域不直接與DFHBI-1T 相互作用，而是幫助broccoli 折疊成合適DFHBI-1T 的空間構(gòu)象. 從第1 輪篩選的單突變位點(diǎn)中，我們將以上選擇的7 個(gè)單突變位點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)組合，共產(chǎn)生了21 個(gè)雙突變體，有4 對(duì)雙突變組合分別高于該位點(diǎn)兩單突的熒光強(qiáng)度. 在第3次突變中，我們找了1 個(gè)熒光強(qiáng)度相對(duì)于broccoli增強(qiáng)了4 倍的broccoli 四突變體（即Bro）. 通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，這種突變組合最穩(wěn)定. 而其他三位點(diǎn)突變熒光強(qiáng)度均低于雙位點(diǎn)突變（圖3）. 這表明這些位點(diǎn)的核苷酸可能存在相互作用，而這些位點(diǎn)同時(shí)突變可能破壞了這種作用.

為了增強(qiáng)適體的熒光強(qiáng)度和穩(wěn)定性，基于F30支架，我們?cè)O(shè)計(jì)了新的3WJ 支架，未直接采用F30支架，主要是考慮到之前有報(bào)道證明broccoli 插入tRNA 支架和F30 支架后在大腸桿菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中容易受到核酸酶不同程度的剪切［14］. 經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的broccoli 熒光強(qiáng)度有所增強(qiáng)，將bro 融入到3WJ 與F30 中，3WJ-Bro 相對(duì)于F30-Bro 熒光有所增強(qiáng)，但增強(qiáng)幅度不到20%（圖4），表明通過(guò)支架提升熒光強(qiáng)度的能力有限. 為了進(jìn)一步提升適體的熒光強(qiáng)度和穩(wěn)定性，我們采用向3WJ 支架串聯(lián)重復(fù)使用Bro 單元的方式增加熒光強(qiáng)度. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種方式雖然增強(qiáng)了適體的熒光強(qiáng)度，但熒光強(qiáng)度的增加與Bro 單元倍數(shù)并不成線性關(guān)系，而且3WJ-2×Bro 熒光強(qiáng)于3WJ-6×Bro. 這表明3WJ支架對(duì)Bro 單元的容納能力有限. 因此，采用這種方法提升熒光強(qiáng)度時(shí)需要考慮改進(jìn)支架的容納空間（圖6）. 為了將3WJ-n×Bro 家族用于ROI 體外檢測(cè)，我們?cè)u(píng)估3WJ-n×Bro 家族對(duì)的ROI 的靈敏度測(cè)試. 結(jié)果顯示，通過(guò)線性回歸發(fā)現(xiàn)，熒光強(qiáng)度與RNA 濃度成線性關(guān)系，這可以為體外RNA 檢測(cè)和定量提供新的方法.

綜上，本研究根據(jù)突變策略我們對(duì)broccoli 進(jìn)行了3 輪突變篩選獲得了熒光強(qiáng)度高于broccoli 熒光3 倍的5G-23A-32U-46U 位點(diǎn)突變的熒光適體Bro. 同時(shí)，我們?cè)O(shè)計(jì)了新的3WJ 支架，結(jié)合broccoli和3WJ 二級(jí)結(jié)構(gòu)，我們采用嵌入串聯(lián)重復(fù)Bro的方式構(gòu)建了3WJ-n×Bro 家族RNA 熒光適體.通過(guò)對(duì)3WJ-n×Bro 家族成員光譜特征、熒光強(qiáng)度、T 值、鹽離子依賴性、光穩(wěn)定性、ROI 靈敏度篩選出熒光強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好的3WJ-4×Bro 適體，為植物活細(xì)胞中RNA 成像研究提供了可視化工具.

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（責(zé)任編輯： 白林含）

基金項(xiàng)目： 高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)-專職博士后研發(fā)基金（2022SCU12100）