【關(guān)鍵詞】核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3；自發(fā)性高血壓大鼠；腎臟；有氧運(yùn)動；運(yùn)動強(qiáng)度

【中圖分類號】R49 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2023-10-23

2018年我國高血壓指南顯示，成年人群約有27.9%患有高血壓[1]，而其中，腎臟是高血壓最常累及的靶器官。研究證明血壓長期控制不良是高血壓腎病的誘因之一，且確診時通常已是中晚期，治療難度高，預(yù)后較差[2]，而腎臟靶器官損害也是高血壓致死率的主要原因。因此，積極探究高血壓腎病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，并以此指導(dǎo)臨床治療、藥物開發(fā)，意義重大。目前，眾多指南認(rèn)為高血壓腎病的主要治療原則為嚴(yán)格控制血壓達(dá)標(biāo)，其中的主要治療用藥為腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（researchanalyst assessment specialist，RAAS）抑制劑。而RAAS抑制劑雖然已被證明可有效降低高血壓，但是對終末靶器官損傷不起作用[3]。因此，在傳統(tǒng)藥物治療方法之外探索高血壓腎病新的其他有效治療途徑、治療方法很有必要。

本研究通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)[4]：高血壓狀態(tài)下腎臟組織中核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associ?ated protein 3，NLRP3）被激活主要表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞中，包括近端小管和遠(yuǎn)端小管，并少量表達(dá)于腎小球[5]；在另一項(xiàng)有關(guān)鹽敏感型高血壓小鼠腎臟的研究中顯示NLRP3炎癥小體被激活[6]，且抑制NLRP3炎癥小體可降低鹽敏感型高血壓小鼠的血壓和腎臟功能損害。同時，大健康政策推進(jìn)背景下，運(yùn)動療法越來越受到臨床醫(yī)生們的高度重視，這也是本研究的關(guān)注點(diǎn)。有研究證明：經(jīng)常鍛煉可以降低血清中NLRP3炎癥小體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物IL-1β和IL-18 的表達(dá)水平[7]；IL-1β 和IL-18 被認(rèn)為與高血壓高度相關(guān)[8-9]；還有一個與之相關(guān)的Toll樣受體4（toll like receptor 4，TLR4）是先天免疫系統(tǒng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)重要受體，與高血壓等多種心血管疾病[10]以及慢性腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制都相關(guān)[11]；另一項(xiàng)研究證明TLR4 可以通過激活下游前體IL-1β 和前體IL-18表達(dá)啟動NLRP3炎癥小體轉(zhuǎn)錄表達(dá)[12]。

在近年來運(yùn)動療法研究呈現(xiàn)蓬勃發(fā)展之勢的情形下，運(yùn)動訓(xùn)練已被證明有益于慢性腎臟病等多種慢性疾病[13-14]，例如Garcia-Pinto AB 等[15]認(rèn)為低強(qiáng)度體力活動有益于自發(fā)性高血壓大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)形態(tài)改變。同時，也有學(xué)者對運(yùn)動訓(xùn)練保護(hù)腎功能這一觀點(diǎn)提出了質(zhì)疑，例如Barcellos FC等[16]隨機(jī)選取非糖尿病高血壓成人患者和處于2～4階段慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）患者進(jìn)行16周有氧和阻力訓(xùn)練試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)運(yùn)動訓(xùn)練對CKD Ⅱ～Ⅳ期患者的腎小球?yàn)V過率下降沒有影響，這種結(jié)果推測一方面可能是由于人與動物之間的生物種性差異所導(dǎo)致，另一方面可能與運(yùn)動訓(xùn)練類型、強(qiáng)度、時間等因素相關(guān)。以上研究結(jié)論的差異性表明，目前學(xué)界對高血壓腎病進(jìn)行運(yùn)動干預(yù)的觀點(diǎn)仍有爭議，通過運(yùn)動訓(xùn)練保護(hù)高血壓腎臟功能分子機(jī)制的作用靶點(diǎn)的研究還需進(jìn)一步深入研究。

基于以上研究基礎(chǔ)，本研究把低、中強(qiáng)度有氧運(yùn)動影響自發(fā)性高血壓大鼠腎臟NLRP3炎癥小體表達(dá)水平作為研究內(nèi)容，以腎臟內(nèi)和血清中IL-1β和IL-18釋放水平和細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)與大鼠高血壓腎臟損害調(diào)節(jié)的關(guān)聯(lián)性為核心研究目標(biāo)，旨在為臨床高血壓腎病治療探索新方法，并期望對新的靶向藥物開發(fā)發(fā)揮重要推動作用，同時也讓臨床高血壓腎病患者能真正廣泛開展非藥物治療、非臨床健康干預(yù)、提高患者生活品質(zhì)、重新樹立生活信心等有著積極的社會與經(jīng)濟(jì)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

18只8周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）和6只同齡雄性Wistar京都大鼠（WKY）購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司［實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2019-0010］，飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。大鼠隨機(jī)分為WKY 組（WKY）、高血壓對照組（SHR-N）、低強(qiáng)度有氧組（SHR-L）和中強(qiáng)度有氧組（SHR-M），n=6，均安置在重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心［實(shí)驗(yàn)動物使用許可證：SYXK（渝）2022-0016］，并按規(guī)定保證食物和水供給。每組大鼠飼養(yǎng)房間用空調(diào)保證室溫處于（22±2） ℃恒溫狀態(tài)，提供12 h日燈光照+12 h黑暗循環(huán)的模擬自然環(huán)境，上午7：00點(diǎn)亮燈，晚上7：00熄燈。本研究通過重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審核、批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 運(yùn)動方案 運(yùn)動方案參考《心血管研究動物運(yùn)動和訓(xùn)練方案指南》建議以及Luo M等[17-18]的實(shí)驗(yàn)研究方案制定。

首先進(jìn)行１周適應(yīng)性運(yùn)動訓(xùn)練：第一天運(yùn)動時間為10 min，運(yùn)動時間以10 min/d遞增，持續(xù)6 d，坡度均為0°。

然后進(jìn)入運(yùn)動實(shí)驗(yàn)：SHR-L、SHR-M分別在0°坡度的運(yùn)動跑步機(jī)上以12～14 m/min（35％～45% VmaxO2）、18～20 m/min（50％～60% VmaxO2）的速度進(jìn)行有氧運(yùn)動。運(yùn)動時間為每天跑步60 min，每周跑步5 d，共10周。

1.2.2 血壓心率體重檢測 使用智能無創(chuàng)血壓計(jì)（SoftronBP-2010），采用大鼠尾動脈血壓測量法測量大鼠收縮壓和舒張壓。

1.2.3 腎臟病理組織學(xué)觀察 4%多聚甲醛溶液用于處理大鼠腎臟組織并制作石蠟包埋，使用病理切片機(jī)制作石蠟切片。用Masson染色觀察組織形態(tài)，鏡下選取10個視野，觀察膠原沉積情況，用圖像分析軟件Image J 測量細(xì)胞間質(zhì)纖維化組織面積與所測視野面積的比值，作為腎臟功能指標(biāo)（index of renal function，RFI）。

1.2.4 蛋白表達(dá)量檢測 使用Western blot法測定大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1、cleaved-Caspase-1、TLR4、IL-1β、IL-18、GSDMD、GSDMDC1蛋白表達(dá)。用BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)濃度測定結(jié)果及蛋白原液量，取70 μg 蛋白樣品上樣。配制一抗（Cleaved-Caspase1 抗體，Affinity-AF4005，1∶500；Caspase1 抗體，NB100-56564，1∶500；IL18 抗體，Affinity-DF6252，1∶500；GSDMD抗體，Affinity-AF4012，1∶500；GSDMDC1 抗體，NBP2-33422，1∶500；NLRP3 抗體，NBP2-12446，1∶500；TLR4抗體，NB100-56581，1∶500；IL1β抗體，NBP1-19775，1∶500；β-actin抗體，Santa-SC-47778，1∶1 000）；在封閉一、二抗孵育過程前后使用TBST清洗（3×10 min），化學(xué)發(fā)光、顯影，Image J計(jì)算條帶灰度值進(jìn)行圖像分析。

1.2.5 血清尿素氮和肌酐的測定 10 周運(yùn)動結(jié)束后，腹腔注射1% 戊巴比妥麻醉大鼠。采用眼眶取血法，然后以1 500 r/min 離心10 min，并以-80 ℃凍存分離血清。分別通過氧化酶法和尿素酶-谷氨酸脫氫酶法測定血清肌酐（serumcreatinine，Cr）和血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）。

1.2.6 細(xì)胞因子測定 ELISA試劑盒（江蘇美晶，中國）檢測上清細(xì)胞因子IL-18（22 kD），IL-1β（30 kD）濃度。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度（absorbance，A值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中大鼠血清IL-1β、IL-18含量（pg/mL）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。單因素方差分析（one-way ANOVA）比較組間差異性，LSD-t 檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 有氧運(yùn)動訓(xùn)練對SHR血壓的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與SHR-N 組相比，SHR-L 組的收縮壓（F=23.202，P=0.001）和舒張壓（F=24.943，P=0.019）均降低，SHR-M組收縮壓（F=51.811，P=0.000）和舒張壓（F=86.283，P=0.000）有明顯降低；有氧運(yùn)動組間比較，SHR-M組降壓作用較SHR-L 組更明顯（SBP：F=17.607，P=0.028，DBP：F=40.533，P=0.000），見表1。

2.2 SHR血清尿素氮和肌酐檢測水平

與WKY組比較，SHR-N組BUN（F=85.794，P=0.000）和Cr（F=133.406，P=0.000）明顯升高；與SHR-N組比較，SHRL組（BUN：F=28.619，P=0.002，Cr：F=24.734，P=0.000）、SHRM組（BUN：F=113.962，P=0.000，Cr：F=256.850，P=0.000）BUN 和Cr 均下降；有氧運(yùn)動組間比較，SHR-M 組BUN（F=44.450，P=0.000）和Cr（F=31.764，P=0.001）下降更明顯（表1）。

2.3 腎臟組織病理學(xué)觀察

大鼠腎臟Masson染色顯示病理變化，見圖1所示，細(xì)胞膠原纖維呈藍(lán)色。WKY中腎小球和腎小管基本正常，僅少部分腎小管擴(kuò)張；SHR-N組腎小球萎縮，大部分腎小管管腔明顯擴(kuò)張，且細(xì)胞間質(zhì)存在大量藍(lán)色膠原纖維，RFI比值高于WKY組（F=905.982，P=0.000）；與SHR-N組相比，SHR-L組（F=54.704，P=0.000）和SHR-M（F=165.815，P=0.000）組腎小球、腎小管病變減輕，膠原纖維減少，其中SHR-M組RFI比值小于SHR-L組（F=27.813，P=0.000）（表1）。

2.4 SHR 腎臟組織中促炎癥因子IL-1β、IL-18 蛋白表達(dá)水平

與WKY 組相比，SHR-N 組促炎癥因子IL-1β（F=234.648，P=0.000）、IL-18（F=124.813，P=0.000）蛋白分子表達(dá)水平明顯升高；與SHR-N、SHR-L組相比，SHR-M組IL-1β（F=32.013，P=0.005 vs. SHR-N，F(xiàn)=29.746，P=0.005 vs.SHR-L）、IL-18（F=28.704，P=0.006 vs. SHR-N，F(xiàn)=15.701，P=0.017 vs. SHR-L）蛋白分子表達(dá)含量降低，而SHR-L 組與SHR-N組相比，SHR-L組IL-1β（F=0.537，P=0.504）、IL-18（F=0.411，P=0.556）蛋白表達(dá)變化不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2～4）。

2.5 SHR 腎臟組織Caspase-1、cleaved-Caspase1 蛋白表達(dá)水平變化

與WKY組相比，SHR-N組Caspase-1蛋白表達(dá)升高（F=373.490，P=0.000）；與SHR-N 組相比，SHR-M 組Caspase-1蛋白分子表達(dá)水平有明顯的降低（F=78.717，P=0.000），而SHR-L組與SHR-N組比較，Caspase-1蛋白分子表達(dá)含量變化不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.028，P=0.368），另外，各組大鼠cleaved-Caspase1蛋白分子表達(dá)含量均不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.447，P=0.300，圖2、5、6）。

2.6 SHR腎臟組織GSDMD、GSDMDC1蛋白表達(dá)水平變化

與WKY 組相比，SHR-N 組GSDMD（F=307.344，P=0.000）、GSDMDC1（F=1590.932，P=0.000）蛋白表達(dá)水平均明顯升高；與SHR-N組相比，SHR-L組GSDMD（F=76.470，P=0.000）、GSDMDC1（F=210.872，P=0.000）蛋白分子表達(dá)水平均明顯降低，SHR-M 組GSDMD（F=267.054，P=0.000）、GSDMDC1（F=616.124，P=0.000）蛋白分子表達(dá)水平均明顯性降低；與SHR-L組相比，SHR-M組GSDMD（F=23.652，P=0.008）、GSDMDC1（F=143.518，P=0.000）蛋白分子表達(dá)含量降低更明顯（圖2、7、8）。

2.7 SHR腎臟組織NLRP3、TLR4 蛋白表達(dá)水平變化

與WKY組相比，SHR-N組NLRP3（F=257.696，P=0.000）、TLR4（F=3254.690，P=0.000）蛋白表達(dá)水平均明顯降低；與SHR-N 組相比，SHR-M 組的NLRP3（F=45.963，P=0.002）、TLR4（F=50.838，P=0.002）蛋白分子表達(dá)水平均明顯降低；與SHR-N 組相比，SHR-L 組的NLRP3（F=12.488，P=0.024）、TLR4（F=21.536，P=0.010）蛋白分子表達(dá)水平降低；有氧運(yùn)動組間相比，SHR-M組NLRP3（F=16.301，P=0.016）、TLR4（F=15.531，P=0.017）蛋白分子表達(dá)水平降低更明顯（圖2、9、10）。

2.8 SHR血清中促炎癥因子IL-18、IL-1β表達(dá)水平變化

與WKY 組相比，SHR-N 組血清促炎癥因子IL-1β（F=191.252，P=0.000）、IL-18（F=763.075，P=0.000）表達(dá)水平均明顯升高；與SHR-N組相比，SHR-L、SHR-M組血清IL-1β（F=93.153，P=0.000 vs. SHR-L，F(xiàn)=143.752，P=0.000 vs. SHRM）、IL-18（F=60.473，P=0.000 vs. SHR-L，F(xiàn)=337.182，P=0.000vs. SHR-M）表達(dá)水平均明顯下降，另外與SHR-L 組相比，SHR-M 組IL-1β（F=32.254，P=0.006）、IL-18（F=47.211，P=0.000）表達(dá)水平更低（圖11、12）

3 討論

有研究證明，有氧運(yùn)動、抗阻運(yùn)動以及兩者聯(lián)合運(yùn)動均能有效降低血壓[19-20]，雖然強(qiáng)有力的證據(jù)支持定期體育鍛煉有益于預(yù)防和管理高血壓[21]，然而并沒有足夠證據(jù)確定運(yùn)動強(qiáng)度與血壓之間的關(guān)系[19]。前期通過文獻(xiàn)研究表明，高強(qiáng)度有氧運(yùn)動可能會加重自發(fā)性高血壓大鼠血壓[22]，因此本研究只比較了低強(qiáng)度與中強(qiáng)度有氧運(yùn)動降低自發(fā)性高血壓大鼠血壓的差異，發(fā)現(xiàn)未進(jìn)行有氧運(yùn)動訓(xùn)練的大鼠血壓持續(xù)升高，而進(jìn)行低、中強(qiáng)度有氧運(yùn)動訓(xùn)練大鼠的血壓明顯降低，其中中強(qiáng)度有氧運(yùn)動比低強(qiáng)度有氧運(yùn)動降壓效果更明顯。該結(jié)果與Zhang YY等[23]研究結(jié)果一致。

在本實(shí)驗(yàn)中，與血壓正常組大鼠相比，自發(fā)性高血壓安靜組大鼠血清肌酐和尿素氮的表達(dá)水平明顯升高，而低、中強(qiáng)度有氧運(yùn)動組大鼠的血清肌酐和尿素氮含量明顯降低，且中強(qiáng)度有氧運(yùn)動組大鼠下降更加明顯。在大鼠腎臟組織Masson染色結(jié)果中顯示有氧運(yùn)動抑制了腎臟中腎小球等結(jié)構(gòu)的病變程度，表明有氧運(yùn)動訓(xùn)練可以改善大鼠腎功能損害，這一結(jié)果與Kohzuki M等[24]發(fā)現(xiàn)一致，在慢性腎功能衰竭的自發(fā)性高血壓大鼠模型中評估了抗高血壓治療對腎功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗高血壓治療進(jìn)一步降低腎小球硬化指數(shù)，表明降壓治療在該大鼠模型中具有額外的腎臟保護(hù)作用。因此，本研究結(jié)果支持“ 中強(qiáng)度有氧運(yùn)動改善自發(fā)性高血壓大鼠腎臟損害作用強(qiáng)于低強(qiáng)度有氧運(yùn)動”的結(jié)論。

高血壓與腎功能存在密切關(guān)系，并主要表現(xiàn)在：腎臟的主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞外液，細(xì)胞外液體積平衡被破壞，導(dǎo)致腎鈉潴留，這是原發(fā)性動脈高血壓發(fā)病機(jī)制的初始事件之一[25]；事實(shí)上腎功能與高血壓可以和RASS 中的重要物質(zhì)Ang-Ⅱ聯(lián)系起來，Ang-Ⅱ可引起口渴，促進(jìn)腎臟鹽分滯留，進(jìn)而血管收縮，并增強(qiáng)兒茶酚胺從神經(jīng)和腎上腺釋放[26]，最終導(dǎo)致血壓升高。有研究者認(rèn)為Ang-Ⅱ?qū)細(xì)胞直接作用是引起高血壓的原因之一，腎臟炎癥損傷中白細(xì)胞、T細(xì)胞以及CD4+和CD8+ T細(xì)胞積累與高血壓發(fā)生有關(guān)[27]。然而值得注意的是，目前臨床上常用抗高血壓治療手段RASS抑制劑對腎臟等終末靶器官損傷似乎不起作用[3]，腎臟等靶器官損害是高血壓嚴(yán)重危險(xiǎn)并發(fā)癥之一，此外高鉀血癥和低血壓是RAAS抑制劑常見的不良反應(yīng)。因此，高血壓腎病治療還需要進(jìn)一步完善分子機(jī)制，開發(fā)安全有效的分子治療靶點(diǎn)。

抑制腎臟NLRP3炎癥小體表達(dá)可以使血壓下降并降低腎臟等終末器官損傷，例如在兩腎一夾（2K1C）小鼠高血壓模型中Krishnan SM等[6]觀察到敲除NLRP3 或ASC 基因可以防止血壓升高，支持NLRP3炎癥小體在誘發(fā)高血壓上起著重要作用的觀點(diǎn)；Zambom FFF等[28]應(yīng)用高血壓大鼠模型發(fā)現(xiàn)阻斷NLRP3炎癥小體激活可降低血壓并抑制腎損害，表明抑制NLRP3炎癥小體激活是降低高血壓和減少腎臟損害的關(guān)鍵靶點(diǎn)。也有其他證據(jù)表明，應(yīng)用NLRP3炎癥小體抑制劑可保護(hù)高血壓所致的腎臟損害[29]。有研究進(jìn)一步證明NLRP3炎癥小體激活后導(dǎo)致IL-1β、TLR4轉(zhuǎn)錄表達(dá)上調(diào)，并最終導(dǎo)致包括高血壓在內(nèi)的多種炎癥性疾病導(dǎo)致的腎臟疾病加重[30-32]。同時有 Zhao JH等[33]的研究發(fā)現(xiàn)如果抑制TLR4、IL-1β等細(xì)胞因子可有效改善高血壓早期腎損害。丁峣[34]研究發(fā)現(xiàn)通過運(yùn)用潛陽育陰顆粒抑制自發(fā)性高血壓大鼠腎組織中IL-1β表達(dá)，可明顯減輕大鼠腎損害?？傊陨献C據(jù)表明下調(diào)腎臟內(nèi)NLRP3炎癥小體活性可能是實(shí)現(xiàn)降低血壓和腎臟等靶器官損傷的又一個具有重要臨床與理論價(jià)值的研究方向。

本研究發(fā)現(xiàn)，自發(fā)性高血壓大鼠腎臟TLR4蛋白表達(dá)以及NLRP3活性明顯升高，而有氧運(yùn)動訓(xùn)練可以有效降低自發(fā)性高血壓大鼠IL-1β、TLR4 和NLRP3炎癥小體等蛋白表達(dá)；與低強(qiáng)度有氧運(yùn)動相比，中強(qiáng)度有氧運(yùn)動作用更明顯。因此，中強(qiáng)度有氧運(yùn)動訓(xùn)練通過下調(diào)腎臟TLR4/NLRP3信號通路改善自發(fā)性高血壓大鼠腎功能損害作用更明顯。本研究不足之處在于，未對其他組織和細(xì)胞中的NLRP3 炎癥小體以及TLR4 進(jìn)行檢測，TLR4 和NLRP3炎癥小體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中和血管平滑肌等細(xì)胞均有豐富表達(dá)[35-36]，因此需要更多的證據(jù)檢驗(yàn)有氧運(yùn)動通過腎臟TLR4/NLRP3信號通路調(diào)控自發(fā)性高血壓大鼠血壓。

綜上所述，有氧運(yùn)動強(qiáng)度差異與自發(fā)性高血壓大鼠腎臟內(nèi)NLRP3炎癥小體表達(dá)、血壓以及腎臟功能損害均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其一，有氧運(yùn)動可能通過下調(diào)自發(fā)性高血壓大鼠腎臟內(nèi)NLRP3炎癥小體表達(dá)降低血壓；其二，與低強(qiáng)度有氧運(yùn)動相比，中強(qiáng)度有氧運(yùn)動通過TLR4/NLRP3信號通路改善自發(fā)性高血壓大鼠腎功能作用更明顯。

（責(zé)任編輯：周一青）