酶的固定化技術(shù)是指通過(guò)物理或化學(xué)方法使游離的酶附著在不溶于水的載體上，讓酶保持活性且進(jìn)行反復(fù)利用，減少酶的流失、降低酶的使用成本、提高反應(yīng)效率，較多地應(yīng)用于聚甘油酯的生產(chǎn)過(guò)程中。20世紀(jì)70年代以來(lái)，我國(guó)一直都在開展對(duì)固定化技術(shù)的研究，目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了固定化酶在食品、醫(yī)療、能源和環(huán)境治理等領(lǐng)域的應(yīng)用。然而，現(xiàn)有的固定化技術(shù)仍存在適用范圍小和成本較高等問(wèn)題，需要利用新式材料開發(fā)更高效且可持續(xù)的固定化酶，控制酶反應(yīng)并增強(qiáng)其可重復(fù)使用性，實(shí)現(xiàn)更具成本效益的工藝。

聚甘油脂是一種被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織（FAO/WHO），以及歐盟、美國(guó)、日本、中國(guó)等組織和國(guó)家審定批準(zhǔn)用作食品添加劑的綠色、安全和多功能性非離子乳化劑。聚甘油酯的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)法和酶催化法，化學(xué)法是主流。在食品領(lǐng)域，固定化脂肪酶已被廣泛應(yīng)用于脂肪酸酯合成、油脂改性、芳香味酯類化合物以及抗壞血酸酯類抗氧化劑的合成等反應(yīng)中。

1. 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

具有特定孔徑和表面積的聚丙烯酸樹脂顆粒（用于固定脂肪酶）；具有高催化活性和選擇性的酶種（TypeⅡ型（L874999）脂肪酶）；磷酸鹽緩沖溶液（pH控制在5-9）；三聚甘油（合成聚甘油酯的原料）；不飽和脂肪酸（如油酸或亞油酸）。

實(shí)驗(yàn)前需要先對(duì)聚丙烯酸樹脂顆粒進(jìn)行預(yù)處理：用95wt%乙醇浸泡4-12h，沖洗至無(wú)乙醇?xì)馕?，然后?-5wt%鹽酸溶液浸泡2-4h，水洗至中性，再用1-2wt%氫氧化鈉浸泡2-4h，水洗至中性，最后抽濾去除水分后低溫保存?zhèn)溆?。脂肪酶需置于磷酸鹽緩沖溶液中浸泡1-3h，然后離心取上清液備用。

1.2 酶的固定化方法

在去離子水中調(diào)節(jié)聚丙烯酸樹脂顆粒的pH，使其高于脂肪酶的等電點(diǎn)（pI）1.5-2.5個(gè)單位。將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的聚丙烯酸樹脂顆粒置于含有脂肪酶的上清液中，確保樹脂顆粒與上清液的質(zhì)量體積比為1：8-1：4。在20℃-40℃條件下，以70-80rpm的轉(zhuǎn)速攪拌反應(yīng)0.5-3h。取出聚丙烯酸樹脂顆粒，干燥后即得到固定化脂肪酶。

1.3 聚甘油酯生產(chǎn)

將油酸和固定化脂肪酶混合均勻混合均勻，在55℃-65℃下攪拌反應(yīng)3-5h，反應(yīng)結(jié)束后，以固定化脂肪酶催化多不飽和脂肪酸制備聚甘油脂，聚甘油脂與油酸的摩爾比為1：1，固定化脂肪酶的添加量是聚甘油脂和油酸總質(zhì)量的2%-5%。

2. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

設(shè)置不同組別，分別改變酶的固定化條件（如pH、溫度、攪拌轉(zhuǎn)速等），以及聚甘油酯的合成條件（如原料比例、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等），觀察各因素對(duì)聚甘油酯得率的影響。篩選出對(duì)得率影響較大的幾個(gè)因素，再進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以確定最佳工藝條件。通過(guò)稱量反應(yīng)前后物質(zhì)的質(zhì)量變化，判定聚甘油酯的產(chǎn)量和得率。組別分別設(shè)置為A、B、C組。組別A：改變酶的固定化pH（設(shè)置pH為5.5、6.5、7.5）；組別B：改變酶的固定化溫度（設(shè)置溫度為25℃、35℃、45℃）；組別C：改變攪拌轉(zhuǎn)速（設(shè)置轉(zhuǎn)速為60、80、100rpm）。

在每個(gè)組別下，分別開展酶的固定化和聚甘油酯的合成實(shí)驗(yàn)。記錄每個(gè)條件下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，特別是聚甘油酯的產(chǎn)量。在初步實(shí)驗(yàn)后，選出對(duì)得率影響較大的幾個(gè)因素（如pH、溫度、攪拌轉(zhuǎn)速等），再設(shè)計(jì)一個(gè)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)束后記錄下每個(gè)條件下的聚甘油酯得率。初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

根據(jù)表1可知，pH、溫度對(duì)聚甘油酯得率的影響較大。接下來(lái)，設(shè)計(jì)一個(gè)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化這些條件。先確定每個(gè)因素的水平范圍，設(shè)定pH的范圍是7-9，溫度的范圍是20℃-40℃，原料比例的范圍是1：1-1：3。然后按照L16（43）正交表（見(jiàn)表2）的設(shè)計(jì)安排實(shí)驗(yàn)。完成所有實(shí)驗(yàn)后，收集數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析，使用方差分析（ANOVA）確定哪些因素對(duì)聚甘油酯得率的影響較為顯著。聚甘油酯得率方差分析（ANOVA）見(jiàn)表3。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)能夠明確各因素對(duì)聚甘油酯得率的影響，并找到最佳的工藝條件組合，由表4可知，試驗(yàn)6（pH為7.5、溫度為35℃、原料比例為1：1）獲得了最高的聚甘油酯產(chǎn)量。

3. 結(jié)果與討論

3.1 固定化條件對(duì)酶活性與穩(wěn)定性的影響

在實(shí)驗(yàn)中，如果酶活性受到抑制，就會(huì)導(dǎo)致聚甘油酯的產(chǎn)量減少。具體來(lái)看，在pH為5.5的條件下，酶的活性會(huì)受到抑制，從而導(dǎo)致聚甘油酯產(chǎn)量減少。同樣，在溫度為45℃的條件下，酶的活性也受到了抑制，從而降低了聚甘油酯產(chǎn)量。此外，其他因素如底物濃度、酶濃度、反應(yīng)時(shí)間等，也都會(huì)影響聚甘油酯的產(chǎn)量。因此，在實(shí)驗(yàn)中需要通過(guò)調(diào)整固化比例、改變pH和溫度、設(shè)定適宜的攪拌轉(zhuǎn)速等方式，確保酶與底物的充分混合，進(jìn)而提高酶的活性，以獲得最佳的聚甘油酯產(chǎn)量。

3.2 固定化酶在聚甘油酯生產(chǎn)中的最佳工藝條件

通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定了固定化酶在聚甘油酯生產(chǎn)中的最佳工藝條件：pH為7.5、溫度為35℃、原料比例為1：1，在此條件下，三聚甘油酯產(chǎn)量達(dá)到最高的17.1g。實(shí)踐也發(fā)現(xiàn)，固定化酶在連續(xù)五批次的生產(chǎn)中均表現(xiàn)出了出色的穩(wěn)定性和耐用性，其活性保持率均高于85%，在長(zhǎng)期連續(xù)生產(chǎn)過(guò)程中保持了高效率，降低了酶更換的頻率，減少了生產(chǎn)成本。

最重要的是，用固定化酶生產(chǎn)聚甘油酯，減少了雜質(zhì)和副產(chǎn)物的生成，使得聚甘油酯的純度更高、色澤更淺、氣味更純正，品質(zhì)有所提高。這些數(shù)據(jù)都證實(shí)，固定化酶在提高聚甘油酯產(chǎn)量和品質(zhì)方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。