摘 要 目的：體內(nèi)外評(píng)價(jià)紫歸潤唇膏的抗炎功效。方法：建立脂多糖誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞炎癥模型，檢測(cè)紫歸醇提物對(duì)一氧化氮生成的影響。建立卡泊三醇誘導(dǎo)的特應(yīng)性皮炎樣小鼠模型，研究紫歸潤唇膏對(duì)小鼠耳皮膚厚度、耳皮膚炎癥的嚴(yán)重程度、組織病理及安全性的影響。結(jié)果：25～200 mg/mL紫歸醇提物能夠促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞生長且顯著降低一氧化氮水平。同時(shí)紫歸潤唇膏能夠顯著降低特應(yīng)性皮炎樣小鼠耳部厚度，降低濕疹面積及嚴(yán)重度指數(shù)（eczema area and severity index， EASI）評(píng)分，減少炎癥細(xì)胞浸潤，降低棘層增厚，改善小鼠耳廓皮損炎癥情況，且對(duì)卡泊三醇誘導(dǎo)的特應(yīng)性皮炎樣小鼠肝脾腎無影響。結(jié)論：紫歸潤唇膏具有顯著抗炎功效且具有安全性。

關(guān)鍵詞 紫歸潤唇膏 抗炎 功效評(píng)價(jià)

中圖分類號(hào)：R286； R275.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2024）11-0003-04

引用本文 朱聰聰， 羅楹， 黃梽楠， 等. 紫歸潤唇膏體內(nèi)外抗炎功效評(píng)價(jià)[J]. 上海醫(yī)藥， 2024， 45（11）： 3-6； 22.

Evaluation of the anti-inflammatory effect of Zigui lip balm in vitro and in vivo

ZHU Congcong1，2， LUO Ying3，4， HUANG Zhinan5， ZHU Quangang1，2

（1. Department of Pharmacy， Shanghai Skin Disease Hospital， Shanghai 200443， China； 2. Shanghai Engineering Research Center for Topical Chinese Medicine， Shanghai 200443， China； 3. Department of Dermatology， Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200437， China； 4. Institute of Dermatology， Shanghai Academy of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China； 5. School of Traditional Chinese Materia Medica， China Pharmaceutical University， Nanjing 211100， China）

ABSTRACT Objective： To evaluate the anti-inflammatory effects of Zigui lip balm both in vitro and in vivo. Methods： The model of inflammation was established using lipopolysaccharide-induced RAW 264.7 cells to detect the impact of Zigui alcohol extract on nitric oxide production. The model of atopic dermatitis-like mice induced by capsaicin was established to study the effects of Zigui lip balm on ear skin thickness， severity of ear skin inflammation， histopathology， and safety. Results： Zigui alcohol extract at 25-200 mg/mL could significantly promote the growth of RAW 264.7 cells and reduce nitric oxide levels. Meanwhile， Zigui lip balm could also significantly reduce ear thickness， eczema area and severity index （EASI） scores， inflammatory cell infiltration and decrease epidermal thickening and improve inflammation of the atopic dermatitis-like mice ear skin and in addition， Zigui lip balm had no effect on the liver， spleen， and kidneys of mice with capsaicin-induced atopic dermatitis. Conclusion： Zigui lip balm exhibits significant anti-inflammatory effects and is safe for use.

KEY WORDS Zigui lip balm； anti-inflammatory； effect evaluation

唇炎是一種累及紅唇的炎癥性疾病，易反復(fù)發(fā)作。臨床表現(xiàn)為唇部皮膚干燥、脫屑、皸裂、滲出等[1]。其病因復(fù)雜，按病因可分為刺激性和過敏性接觸性皮炎、特應(yīng)性唇炎、光化性唇炎等，以及罕見病因，例如肉芽腫性唇炎、腺性唇炎等[2-3]。目前多用激素類或抗生素類軟膏外用治療，輔以維生素調(diào)理。但激素的長期使用，會(huì)產(chǎn)生一些并發(fā)癥且停藥后易反復(fù)。因此，開發(fā)新的安全有效的治療藥物十分必要。

中醫(yī)藥治療炎癥性皮膚病具有豐富臨床經(jīng)驗(yàn)，可作為西藥的補(bǔ)充療法。唇炎在中醫(yī)學(xué)中屬“唇風(fēng)”范疇，是由于風(fēng)濕熱搏結(jié)于唇部肌膚，血虛風(fēng)燥、肌膚失養(yǎng)所致[4]。紫歸潤唇膏由紫草、當(dāng)歸、玉竹、甘草四味藥經(jīng)橄欖油提取與乳木果油、蜂蠟等相關(guān)基質(zhì)混合而制。方中君藥紫草涼血活血、解毒透疹，臣藥當(dāng)歸補(bǔ)血活血，調(diào)經(jīng)止痛，佐藥玉竹養(yǎng)陰潤燥、生津止渴，使藥甘草補(bǔ)脾益氣、清熱解毒并調(diào)和諸藥。結(jié)合病位與用藥順應(yīng)性，將其制備成唇膏劑型，具有良好的應(yīng)用前景。紫歸潤唇膏具有抗炎功效，從而具有改善唇炎的臨床潛力，但缺乏基礎(chǔ)研究。本研究將通過構(gòu)建體內(nèi)外模型來評(píng)價(jià)紫歸潤唇膏的抗炎功效，為中醫(yī)藥在唇炎治療方面的開發(fā)應(yīng)用提供方法參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)8周齡C57BL/6雄性小鼠16只，體質(zhì)量20～22 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。小鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動(dòng)物房的特定無菌環(huán)境中，提供標(biāo)準(zhǔn)飼料和水，環(huán)境溫度控制在20～26 ℃。本研究經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（YYLAC-2023-186-1）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：20220004026395；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK（滬）2018-0040。

1.2 藥物與試劑

紫草（批號(hào)220916）、當(dāng)歸（批號(hào)221209）玉竹（批號(hào)231007）、甘草（批號(hào)230609）均購自上海虹橋中藥飲片有限公司；橄欖油（益海嘉里食品營銷有限公司）；乳木果油（源葉生物技術(shù)有限公司）；蜂蠟、白凡士林、羊毛脂由上海市皮膚病醫(yī)院藥劑科提供；白茶精油由上海修之泉生物科技有限公司提供。一氧化氮試劑盒（購自碧云天生物技術(shù)有限公司）；CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；卡泊三醇（MedChemExpress公司）；哈西奈德溶液[國藥集團(tuán)三益藥業(yè)（蕪湖）有限公司]；BL302A磷酸緩沖液（PBS。Biosharp公司）；小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7（來自上海市皮膚病醫(yī)院）。

1.3 儀器

Spectramax M2多模式酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；HFsafe-1200LC生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；游標(biāo)卡尺（南京拓豐測(cè)量儀器有限公司）；Nikon Eclipse CI正置光學(xué)顯微鏡（日本尼康株式會(huì)社）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 紫歸提取物及紫歸潤唇膏的制備

1）紫歸醇提物（Zigui alcohol extract，ZGAE） 按處方量稱取紫歸方并適當(dāng)粉碎，用8倍量95%乙醇回流提取1 h，過濾，濃縮，最后用蒸發(fā)皿蒸干，備用。

2）紫歸潤唇膏 按處方比稱取紫草、當(dāng)歸、玉竹、甘草粉碎，加5倍飲片重量的橄欖油浸泡24 h，文火加熱煎煮至藥材微焦，過濾除渣，制備成每克油含生藥0.2 g的紫歸油提物，備用。按重量百分?jǐn)?shù)加入紫歸油提物25%，并加入油軟膏輔料橄欖油25%，蜂蠟30%，乳木果油8%，白凡士林10%，羊毛脂1%，白茶精油1%，加熱，混勻，注入唇膏模具，置冰箱中速凍成型，取出唇膏（約含飲片生藥量5%），即得中藥組合物唇膏（紫歸潤唇膏）。

1.4.2 ZGAE對(duì)RAW 264.7細(xì)胞生長的影響

取96孔板，周圍一圈孔里加100 mL磷酸緩沖液，作為空白組；給藥組和對(duì)照組每孔均加入100 mL含4×105個(gè)RAW 264.7細(xì)胞的DMEM完全培養(yǎng)基，于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h。棄上清，對(duì)照組加入100 mL不含藥物的DMEM完全培養(yǎng)基，而給藥組分別加入100 mL含生藥量25、50、100、200 mg/mL的ZGAE，繼續(xù)孵育24 h。利用一次性注射器吸出上清液，并加入含10% CCK-8試劑的培養(yǎng)基，孵育30 min，最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm處的光密度（optical density，OD），并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（給藥組OD450-空白組OD450）/（對(duì)照組OD450-空白組OD450）×100%。

1.4.3 ZGAE對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞炎癥模型一氧化氮濃度的影響

96孔板每孔接種10×104個(gè)RAW 264.7細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后給藥組分別加入50、100、200、400 mg/mL的ZGAE，空白組和模型組加入100 mL完全培養(yǎng)基。孵育1 h后，除空白組外其余組均加入濃度為10 mg/mL脂多糖10 mL，繼續(xù)孵育24 h。收集上清液，參照一氧化氮檢測(cè)試劑盒說明書用酶標(biāo)儀于540 nm波長處檢測(cè)一氧化氮濃度。

1.4.4 紫歸潤唇膏對(duì)卡泊三醇誘導(dǎo)的特應(yīng)性皮炎樣小鼠模型的影響

1）分組與造模方法 采用卡泊三醇誘導(dǎo)的特應(yīng)性皮炎樣小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)研究。將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、紫歸唇膏組及陽性對(duì)照組共四組，每組4只。造模方式：空白對(duì)照組用無水乙醇20 mL涂抹小鼠雙耳廓內(nèi)外側(cè)，其余三組用含有2 nmol/L卡泊三醇乙醇溶劑20 mL涂抹小鼠雙耳廓內(nèi)外側(cè)，均涂抹5 d后，停2 d，再涂抹5 d給藥方式：模型組給予無生藥成分的輔料制備的唇膏5 mg，紫歸唇膏組給予紫歸潤唇膏5 mg，陽性對(duì)照組取哈西奈德溶液20 mL，均涂抹于小鼠雙耳廓內(nèi)外側(cè)，從應(yīng)用卡泊三醇之日起（第0天）開始，每天1次，連續(xù)給藥14 d。

2）觀察指標(biāo) 在第0、4、7、11、14天對(duì)小鼠耳朵的外觀拍照，用游標(biāo)卡尺測(cè)量相同部位耳部皮膚厚度并記錄數(shù)值。根據(jù)濕疹面積及嚴(yán)重度指數(shù)（eczema area and severity index，EASI）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)小鼠耳部皮膚炎癥的嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分，包括紅斑、水腫或滲出、鱗屑、苔癬樣變四部分，表示嚴(yán)重程度的分值依次為：0（無）、1（輕度）、2（中度 ）及3（重度）。

3）組織病理 第14天記錄上述數(shù)據(jù)后，對(duì)小鼠實(shí)施安樂死，取各組小鼠雙耳1 cm×1 cm皮膚組織，用4%福爾馬林溶液固定48 h后石蠟包埋，切片后用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。每張切片隨機(jī)取4個(gè)高倍鏡視野測(cè)量表皮厚度并取其平均數(shù)。

4）安全性評(píng)價(jià) 將小鼠肝脾腎臟組織用4%多聚甲醛固定24 h以上，進(jìn)行石蠟包埋切片，片厚4 mm，進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 ZGAE可降低脂多糖誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞炎癥模型一氧化氮濃度

含生藥量12.5～200 mg/mL的ZGAE可促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞生長（P<0.001），且濃度越高，促進(jìn)效果越明顯（圖1A）。含生藥量25～200 m g/mL的ZGAE能夠抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞炎癥模型分泌一氧化氮，且隨著ZGAE濃度增大，抑制作用增強(qiáng)（圖1B）（P<0.001）。這些結(jié)果提示ZGAE具有抗炎功效。

2.2 紫歸潤唇膏可改善卡泊三醇誘導(dǎo)的特應(yīng)性皮炎樣小鼠模型皮損及皮炎評(píng)分

研究發(fā)現(xiàn)卡泊三醇誘導(dǎo)的小鼠耳廓皮膚厚度較模型組明顯升高（***P<0.001），紫歸唇膏組較模型組耳 部厚度顯著減輕（**P<0.01）（圖2A）。對(duì)各組小鼠耳廓分布在第0、4、7、11、14天拍照并進(jìn)行EASI評(píng)分，與空白對(duì)照組相比，經(jīng)卡泊三醇造模后的小鼠EASI評(píng)分增加（***P<0.001）；而涂抹紫歸潤唇膏及陽性藥物哈西奈德溶液后，EASI評(píng)分明顯下降（***P<0.001）（圖2B），說明紫歸潤唇膏能夠改善皮膚炎癥。

2.3 紫歸潤唇膏可改善卡泊三醇誘導(dǎo)的特應(yīng)性皮炎樣小鼠組織病理情況

組織病理切片顯示，模型組可見表皮增生，真皮內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，棘層肥厚；紫歸唇膏組見表皮稍增厚，真皮內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤較少，棘層增厚不明顯。經(jīng)ImageJ定量，與空白對(duì)照組相比，模型組表皮厚度顯著升 高，而經(jīng)紫歸唇膏治療后，表皮層厚度減少（圖3）。這些結(jié)果說明，紫歸潤唇膏能夠降低表皮增生，減少炎癥細(xì)胞浸潤。

2.4 紫歸潤唇膏外用對(duì)卡泊三醇誘導(dǎo)的特應(yīng)性皮炎樣小鼠肝脾腎無影響

空白組和紫歸潤唇膏組小鼠的肝脾腎組織病理切片顯示，紫歸唇膏組與空白對(duì)照組相比，無明顯差異，表明紫歸潤唇膏用藥期間對(duì)肝脾腎未產(chǎn)生不良反應(yīng)。

3 討論

唇炎作為一種炎癥性皮膚病，根據(jù)分類不同，發(fā)病機(jī)制也不同。接觸性過敏反應(yīng)是唇炎的常見原因。一項(xiàng)泰國的回顧性審查發(fā)現(xiàn)，患唇炎患者中有32%是接觸性唇炎[5]。接觸性唇炎是由直接接觸嘴唇的各種物質(zhì)的刺激或過敏作用引起的嘴唇炎癥反應(yīng)，化妝品和衛(wèi)生用品是最常見的原因，屬于遲發(fā)型超敏反應(yīng)[6]。遲發(fā)型超敏反應(yīng)由 T細(xì)胞介導(dǎo)，巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞在炎癥中起主要作用。由于唇炎缺乏標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞動(dòng)物模型，基于巨噬細(xì)胞在遲發(fā)型超敏反應(yīng)中的重要作用，我們選擇脂多糖誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞炎癥模型作為體外評(píng)價(jià)模型。本研究由于紫歸油提物含生藥量低，無法應(yīng)用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，因此我們采用ZGAE進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

紫歸潤唇膏由紫草、當(dāng)歸、玉竹和甘草組成，其中紫草作為君藥，具有涼血解毒活血功效，對(duì)包括濕疹、銀屑病在內(nèi)的多種皮膚病有效[7]。目前以紫草為核心開發(fā)的中藥復(fù)方治療唇炎療效已明確。如李芳梅等[8]自制的由紫草、當(dāng)歸組成的紫歸唇膏，臨床上能夠明顯修復(fù)皮膚屏障，治療唇炎療效確切。任雪雯等[9]在臨床療效研究中發(fā)現(xiàn)，復(fù)方紫草油能夠很好地改善慢性剝脫性唇炎。李福倫等[10]采用二甲苯致小鼠耳部腫脹模型來評(píng)價(jià)含有紫草、茜草為主的中藥復(fù)方對(duì)唇炎的治療作用。二甲苯致小鼠耳部腫脹模型是常用的抗炎模型，在一定程度上能符合唇炎癥狀。但考慮到唇炎在特應(yīng)性皮炎患者中常見[11]，因此本研究采用卡泊三醇誘導(dǎo)的特應(yīng)性皮炎樣小鼠模型來評(píng)價(jià)紫歸潤唇膏的抗炎特性，對(duì)多種觀察指標(biāo)和方法進(jìn)行 評(píng)估，包括皮損嚴(yán)重程度、皮膚厚度以及組織病理學(xué)分析等。

本研究雖在一定程度明確了紫歸潤唇膏的抗炎功效，但物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制不明，缺乏深入研究。深入分子機(jī)制研究是下一步研究方向。綜上，紫歸潤唇膏具有改善唇炎的潛力，且組方中藥均為常用中草藥，具有一定的安全性，有望用于唇炎的輔助治療。

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