摘要： 【目的】構(gòu)建p53 基因突變模型，為研究p53 基因突變引發(fā)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展提供細(xì)胞模型資源?！痉椒ā坷肅RISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，根據(jù) p53V149F 突變位點(diǎn)的序列，在線設(shè)計(jì)合成單鏈向?qū)gRNA，構(gòu)建CRISPR 打靶載體；將重組載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，流式分選陽性細(xì)胞群，提取細(xì)胞基因組，Sanger 測(cè)序分析Cas9 核酸酶對(duì)靶位點(diǎn)的切割情況，構(gòu)建同源修復(fù)模板，通過T7EN1 試驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)編輯效率；將重組載體和同源模板通過電轉(zhuǎn)染方法共同轉(zhuǎn)染至成纖維細(xì)胞中，通過單克隆挑取、PCR 和Sanger 測(cè)序鑒定挑取含目標(biāo)突變的細(xì)胞株?！窘Y(jié)果】成功構(gòu)建靶向p53 基因目標(biāo)區(qū)域的CRISPR/Cas9 打靶載體；獲得5 個(gè)含目標(biāo)突變的克隆點(diǎn)，點(diǎn)突變率為10%，測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)套峰，表明出現(xiàn)基因型多樣化；1 個(gè)細(xì)胞克隆的測(cè)序結(jié)果無雜峰，TA 克隆鑒定結(jié)果表明：一個(gè)等位基因存在p53V149F 位點(diǎn)突變，另一個(gè)等位基因存在240 bp 缺失?！窘Y(jié)論】成功構(gòu)建了含p53V149F 的細(xì)胞系，并對(duì)基因的功能進(jìn)行了初步驗(yàn)證，為進(jìn)一步構(gòu)建兩基因同時(shí)修飾模型奠定了基礎(chǔ)，并為藥物篩選提供可用的細(xì)胞模型資源，為創(chuàng)制模擬疾病發(fā)生的遺傳模式和臨床表現(xiàn)的小型豬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 基因編輯；打靶載體；癌癥；p53 基因

中圖分類號(hào)： Q78 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 1004–390X （2024） 03?0064?08

CRISPR/Cas9 技術(shù)是構(gòu)建基因編輯模型的重要手段，其優(yōu)勢(shì)使其成為生物和治療應(yīng)用基因工程的有利工具，被用于在活細(xì)胞或生物體中抑制/激活基因表達(dá)或標(biāo)記特定基因組位點(diǎn)的功能域，以探索發(fā)育機(jī)制、基因表達(dá)調(diào)控和動(dòng)物行為[1]。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)作為通過靶向基因修飾進(jìn)行作物改良的有力工具，可對(duì)基因組序列進(jìn)行精確地切割和修飾。ZHAO 等[2]利用CRIPSRi 系統(tǒng)在豬的細(xì)胞水平抑制了導(dǎo)入的GFP 基因表達(dá)，為在哺乳動(dòng)物中開展基因表達(dá)調(diào)控研究提供了良好的借鑒。在研制用于器官移植和其他疾病研究的家豬模型中，已有研究利用CRISPR/Cas9 技術(shù)獲得豬腎細(xì)胞系PK15 中全部62 個(gè)拷貝的 PERV pol（多聚酶） 基因敲除的豬腎細(xì)胞系[3]。此外，在動(dòng)物疾病模型的研究中，已獲得了皮膚白化病、帕金森疾病相關(guān)基因敲除體細(xì)胞克隆豬[4]以及白化病癥狀的兔子[5]。CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)旨在使精確的靶點(diǎn)產(chǎn)生目的基因突變，從而獲得目的靶向基因區(qū)域的打靶載體，通過有效的技術(shù)解析腫瘤發(fā)生的機(jī)制，確定藥物開發(fā)的靶點(diǎn)，提高武裝細(xì)胞進(jìn)行治療的可能性，進(jìn)而加速癌癥研究[6]。

從20 世紀(jì)被發(fā)現(xiàn)以來，癌癥的發(fā)病率不斷上升，全球每年登記的癌癥新病例超過1 400 萬例[7]，其特征是異常細(xì)胞不受控制地增殖和免疫系統(tǒng)的異常識(shí)別，被認(rèn)為是“永不愈合的傷口”，但若能及早發(fā)現(xiàn)，所有的癌癥都可以治愈[8]。癌癥的常規(guī)治療主要靠消滅癌細(xì)胞或抑制其增殖，但復(fù)發(fā)的患者依然占比較高，無法獲得長(zhǎng)期生存。因此，充分了解癌癥從發(fā)病到轉(zhuǎn)移再到復(fù)發(fā)的機(jī)制對(duì)其治療具有重要意義。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)癌癥的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了多方面的研究，結(jié)果表明：癌癥的發(fā)病與p53、K-Ras、EGFR、P16等多個(gè)基因突變相關(guān)，特別是與p53 顯著相關(guān)[9]。約50% 的人類癌癥中存在p53 突變[10]，在某些特定癌癥的亞型中，如三陰性乳腺癌[11]、轉(zhuǎn)移性微衛(wèi)星陽性的結(jié)直腸癌[12]、鱗狀食管癌[13]等，至少80% 的病例發(fā)生p53 突變。由于p53 參與了多種腫瘤抑制途徑，其功能在人類癌癥中經(jīng)常受損。p53 突變通常是功能喪失，也可能提供新形態(tài)（功能獲得） 活動(dòng)，如促進(jìn)癌細(xì)胞干性、細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)癌癥發(fā)展[14]。

p53 作為一種關(guān)鍵的腫瘤抑制因子[15]，受細(xì)胞內(nèi)外眾多的信號(hào)刺激，通過抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)DNA 損傷修復(fù)等過程抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在應(yīng)對(duì)DNA 損傷和異常生長(zhǎng)信號(hào)時(shí)， p53 和鼠雙微體（murine double minute2，MDM2） 基因之間的相互作用被阻斷，p53變得穩(wěn)定，使得p53 主要通過靶基因的轉(zhuǎn)激活來調(diào)節(jié)一系列不同的細(xì)胞反應(yīng)。持續(xù)的DNA 損傷會(huì)阻止轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，從而阻礙細(xì)胞功能并促進(jìn)細(xì)胞衰老和凋亡。DNA 損傷、電離輻射和活性氧都可以穩(wěn)定突變的p53[16-17]，突變主要發(fā)生在125～300 密碼子的DNA 結(jié)合區(qū)域內(nèi)[18]，這是p53 與DNA 結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能的必需區(qū)域。p53在惡性腫瘤中幾乎普遍失活，因此，它是抗癌新藥開發(fā)中極具吸引力的靶點(diǎn)。p53 激活的結(jié)果受其動(dòng)態(tài)、與其他蛋白質(zhì)的相互作用以及翻譯后修飾的控制。盡管已有多種針對(duì)功能失調(diào)的p53 治療癌癥的策略，但到目前為止，只有2 種策略產(chǎn)生了用于臨床試驗(yàn)的化合物[19]。本研究以豬成纖維細(xì)胞構(gòu)建含p53V149F 的細(xì)胞系，并對(duì)基因功能進(jìn)行初步驗(yàn)證，以期為進(jìn)一步構(gòu)建兩基因同時(shí)修飾的模型奠定基礎(chǔ)，并為藥物篩選提供可用的細(xì)胞模型資源，也為創(chuàng)制模擬疾病發(fā)生的遺傳模式和臨床表現(xiàn)的小型豬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試質(zhì)粒：PGL3-U6-sgRNA-EGFP 和spCas9，由上?？萍即髮W(xué)黃行許教授課題組饋贈(zèng)；供試33 日齡滇南小耳豬成纖維細(xì)胞系由云南省動(dòng)物基因編輯與體細(xì)胞克隆技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 p53sgRNA 載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建

通過網(wǎng)站http：//crispr.mit.edu 設(shè)計(jì)與人157 密碼子區(qū)域同源的豬p53 基因（NC_010454.4） V149第5 號(hào)外顯子的sgRNA （TGGCACCCGTGTCCGCGCCA）。以滇南小耳豬DNA 為模板，以p53-snp（F：CAGCTATGATTTCCGTCTAGGG； R：GCTGTGTCGAAAAGTGTTTCTG）為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段為400 bp。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，5 min；95 ℃，30 s；68～58 ℃ （每進(jìn)行1 個(gè)循環(huán)退火溫度下降1 ℃），30 s；72 ℃，1 min；10 個(gè)循環(huán)；95 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，1 min；25 個(gè)循環(huán)；72 ℃，7 min；12 ℃ 保存。PCR 結(jié)束后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行Sanger 測(cè)序，比對(duì)分析峰圖并進(jìn)行sgRNA 的SNP 檢測(cè)；將sgRNA 正反鏈退火后形成雙鏈，連接到線性化的載體PGL3-U6-sgRNA-EGFP 和PGL3-U6-sgRNA-puro，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化涂板，利用氨芐青霉素抗性LB 平板篩選，挑取菌落進(jìn)行PCR 鑒定，并將其中1 個(gè)陽性克隆菌進(jìn)行Sanger 測(cè)序，以獲得正確的PGL3-U6-p53sgRNA 載體，再通過試劑盒（北京天根，DP118-02） 提取PGL3-U6-p53sgRNA和spCas9 質(zhì)粒備用。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

滇南小耳豬成纖維細(xì)胞系培養(yǎng)于含有10% 胎牛血清和1% 雙抗的DMEM 培養(yǎng)液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中（5% CO2），待細(xì)胞的生長(zhǎng)覆蓋率達(dá)到60%～70% 時(shí)收集細(xì)胞用于后續(xù)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

1.4 p53sgRNA 活性鑒定和供體構(gòu)建

將提取的質(zhì)粒PGL3-U6-p53sgRNA-EGFP 和spCas9 按照1∶2 的比例通過電轉(zhuǎn)染（LONZA4D-Nucleofector） 豬成纖維細(xì)胞（即試驗(yàn)組），以只加入轉(zhuǎn)染試劑、不加質(zhì)粒的處理為對(duì)照組，48 h后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。采用流式細(xì)胞分選儀分選綠色熒光陽性細(xì)胞，收集陽性細(xì)胞，離心去除上清液，加細(xì)胞裂解液10 μL 裂解細(xì)胞，取樣品1 μL 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，程序、引物和體系同1.2 節(jié)。將PCR 產(chǎn)物送至測(cè)序公司進(jìn)行Sanger 測(cè)序，利用Snapgene 軟件進(jìn)行序列比對(duì)，分析sgRNA 對(duì)p53 基因的編輯情況；通過T7EN1 對(duì)PCR 純化產(chǎn)物進(jìn)行酶切，程序?yàn)椋?5 ℃，5 min；94 ℃，2 s，200 個(gè)循環(huán)（每進(jìn)行1 個(gè)循環(huán)退火溫度下降0.1 ℃）；75 ℃，600 個(gè)循環(huán)（每進(jìn)行1 個(gè)循環(huán)退火溫度下降0.1 ℃）；16 ℃，2 min，進(jìn)行退火反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后向體系中加入T7EN1 酶0.5 μL，置于恒溫水浴鍋中37 ℃ 酶切30 min；加入5×Loading Buffer 滅活酶，使用1.2% 凝膠進(jìn)行電泳鑒定；將sgRNA 打靶位置的左右50 nt 基因序列（包含C 到T 突變堿基） 進(jìn)行ssODN 合成作為供體。

1.5 p53V149F 細(xì)胞系的單克隆培養(yǎng)與鑒定

將提取的質(zhì)粒PGL3-U6-p53sgRNA-puro、質(zhì)粒spCas9、ssODN 按照1∶2∶2 的比例通過電轉(zhuǎn)染豬成纖維細(xì)胞48 h，利用有限稀釋的方法分離和培養(yǎng)單克隆細(xì)胞。具體為：加入3 μg/mL 嘌呤霉素篩選陽性細(xì)胞，48 h 后收集細(xì)胞；按照每皿100～150 個(gè)的密度接種到培養(yǎng)皿（直徑9 cm） 中，單克隆生長(zhǎng)培養(yǎng)15 d，取單細(xì)胞克隆點(diǎn)鑒定基因型；以裂解液裂解的單細(xì)胞克隆點(diǎn)作為模板，通過PCR 和Sanger 測(cè)序鑒定p53 基因位點(diǎn)的編輯情況，程序、引物和體系同1.2 節(jié)；再將克隆點(diǎn)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行TA 克隆，通過Sanger 測(cè)序分析基因型。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)源p53 基因打靶策略

豬p53 基因mRNA 總長(zhǎng)1 849 bp，編碼386個(gè)氨基酸。在豬p53 基因第5 號(hào)外顯子第149 號(hào)氨基酸編碼的堿基位置設(shè)計(jì)sgRNA （圖1），連接到sgRNA 的表達(dá)載體骨架，根據(jù)細(xì)胞水平的活性驗(yàn)證找到Cas9 的切口位置（PAM 結(jié)構(gòu)上游3、4 號(hào)堿基之間），設(shè)計(jì)包含目標(biāo)突變的ssODN。通過共轉(zhuǎn)染sgRNA 質(zhì)粒、Cas9 質(zhì)粒和ssODN，對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行切割，造成雙鏈斷裂。由于提供了外源重組模板，通過機(jī)體同源重組修復(fù)機(jī)制從而引入點(diǎn)突變，實(shí)現(xiàn)p53 基因的第149 號(hào)氨基酸由纈氨酸突變?yōu)楸奖彼?，?duì)應(yīng)p53 基因mRNA5的94 號(hào)堿基由胞嘧啶（C） 突變?yōu)轼B嘌呤（G），從而獲得p53V149F。

2.2 p53sgRNA 目標(biāo)區(qū)域SNP 檢測(cè)

滇南小耳豬成纖維細(xì)胞系DNA 通過PCR 擴(kuò)增和凝膠電泳，獲得865 bp 的目的條帶（圖2a）。將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行Sanger 測(cè)序比對(duì)基因組序列，結(jié)果顯示：峰圖無雜峰且與參考基因組序列一致（圖2b）。表明豬p53 的sgRNA 打靶區(qū)域不存在SNP 位點(diǎn)，可直接用于sgRNA 打靶設(shè)計(jì)。

2.3 p53 基因sgRNA 表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果

經(jīng)氨芐青霉素抗性LB 平板篩選，共挑取8個(gè)單菌落進(jìn)行PCR 鑒定，PCR 產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示：8 個(gè)菌落都能擴(kuò)增出單一的240 bp 目的條帶，與目標(biāo)大小一致（圖3a）；陽性克隆菌的Sanger測(cè)序結(jié)果表明已成功構(gòu)建PGL3-U6-p53sgRNApuro和PGL3-U6-p53sgRNA-EGFP 載體（圖3b）。

2.4 p53 基因sgRNA 表達(dá)載體細(xì)胞水平驗(yàn)證

質(zhì)粒PGL3-U6-sgRNA-EGFP 和spCas9 電轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞48 h 后，觀察到較強(qiáng)的GFP 熒光蛋白表達(dá)，而對(duì)照組未觀察到熒光，表明p53 基因sgRNA 表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞（圖4a）；T7EN1酶切試驗(yàn)結(jié)果顯示：野生型原始條帶（865 bp） 未被切割，而共轉(zhuǎn)染PGL3-U6-p53sgRNA-EGFP 和spCas9 質(zhì)粒的細(xì)胞基因組PCR 條帶被切割為597和268 bp 的目的條帶（圖4b），表明在sgRNA 打靶位置Cas9 核酸酶發(fā)生了靶向切割；Sanger 測(cè)序峰圖顯示：從PAM 前3、4 號(hào)堿基之間出現(xiàn)雜峰（圖4c） 。

2.5 p53 基因供體構(gòu)建結(jié)果

選擇切口位置（目標(biāo)區(qū)域sgRNA 的PAM 結(jié)構(gòu)上游3、4 號(hào)堿基之間） 左右各50 nt 作為同源臂，合成含C 到T 突變位點(diǎn)的ssODN 作為同源重組修復(fù)的模板（圖5）。

2.6 單克隆細(xì)胞篩選及鑒定

經(jīng)過PCR 擴(kuò)增和Sanger 測(cè)序50 個(gè)克隆點(diǎn)中，共有5 個(gè)克隆點(diǎn)含有目標(biāo)點(diǎn)突變（圖6a），其中P36 號(hào)克隆點(diǎn)測(cè)序未出現(xiàn)雜峰（圖6b）；該克隆點(diǎn)的TA 克隆和Sanger 測(cè)序鑒定結(jié)果顯示：該克隆點(diǎn)為單等位基因V149F 位點(diǎn)突變，缺失240 bp片段（圖6c）。

3 討論

對(duì)p53 基因的編碼區(qū)進(jìn)行序列檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：86% 的突變聚集在125～300 密碼子[20]，而目前針對(duì)p53 突變的癌癥模型構(gòu)建以R175H （豬167 位點(diǎn)同源） 為主[21-23]。有研究繪制了加合物在人類p53 基因的分布， 在密碼子157 （豬149 同源）CpG 序列的鳥嘌呤上形成了強(qiáng)且有選擇性的加合物，這是導(dǎo)致肺癌發(fā)生的主要突變位點(diǎn)[24]，但目前鮮有對(duì)于該位點(diǎn)的研究報(bào)道。本研究獲得一個(gè)存在p53V149F 的p53 等位基因；而另一個(gè)等位基因存在240 bp 缺失，缺失的原因可能是：同源修復(fù)后，Cas9 核酸酶對(duì)靶向區(qū)域的二次切割，鑒定含目標(biāo)突變的克隆點(diǎn)為10% （5/50），點(diǎn)突變編輯效率偏低。YANG 等[25]和WANG 等[26]對(duì)成纖維細(xì)胞中點(diǎn)突變的編輯效率分別為11.4% （21/184） 和5.6% （5/90），這可能是受細(xì)胞類型、周期、同源重組模板質(zhì)粒遞送效率等因素的影響，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)同源重組修復(fù)途徑發(fā)生的概率較低，造成點(diǎn)突變基因編輯效率也偏低，后續(xù)試驗(yàn)將對(duì)這些影響因素進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

通過在轉(zhuǎn)染過程中添加DNA ligase IV 抑制劑（SCR7）[27]、在同源修復(fù)模板上的PAM 結(jié)構(gòu)引入同義突變改變ssODN 上的PAM 結(jié)構(gòu)[28]、使用RNP 體系（Cas9 蛋白與體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA） 代替質(zhì)粒基因編輯工具[29-30]等方法可以有效提高基因編輯點(diǎn)突變的發(fā)生頻率。在克隆點(diǎn)鑒定時(shí)，有5 個(gè)單克隆雖然含有目標(biāo)點(diǎn)突變，但測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)大量套峰和雜峰，表明該克隆點(diǎn)可能含有多種基因型。這是由于本研究使用藥物篩選和有限稀釋的方式進(jìn)行單克隆培養(yǎng)和挑取，細(xì)胞間出現(xiàn)粘連所致。將藥物篩選標(biāo)記換成熒光基團(tuán)，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行單細(xì)胞分選，或許能改善粘連的狀況，這將在后續(xù)的研究中進(jìn)行驗(yàn)證。此外，針對(duì)p53 點(diǎn)效率偏低的問題，后續(xù)研究將改進(jìn)同源修復(fù)突變模板，突變修復(fù)模板ssODN 中的PAM 結(jié)構(gòu)，避免Cas9 核酸酶對(duì)靶向區(qū)域的二次切割；同時(shí)，在轉(zhuǎn)染結(jié)束后向培養(yǎng)液中添加SCR7，抑制非同源性末端連接，提高同源重組概率，最終利用CRISPR/Cas9 技術(shù)，結(jié)合構(gòu)建內(nèi)源性p53V149F點(diǎn)突變基因修飾成纖維細(xì)胞系，通過核移植獲得基因修飾的動(dòng)物模型。

4 結(jié)論

本研究運(yùn)用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)構(gòu)建了有效的基因編輯質(zhì)粒，并通過細(xì)胞水平的驗(yàn)證和T7EN1 酶切試驗(yàn)驗(yàn)證了該質(zhì)粒的有效性；通過編輯后的細(xì)胞基因組測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)了重組模板ssODN，經(jīng)共轉(zhuǎn)染基因編輯質(zhì)粒和ssODN、藥物篩選以及單克隆培養(yǎng)獲得含有目標(biāo)突變的細(xì)胞系，證明了利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)靶向p53基因發(fā)生單堿基替換（G→T） 的定點(diǎn)精確編輯是切實(shí)可行的。

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責(zé)任編輯：何承剛

基金項(xiàng)目：云南省重大科技專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目（202102AA100054）。