[摘要]目的探討冠狀病毒基因芯片的研制方法,建立一種快速定性檢測(cè)人咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等呼吸道感染樣本中的7種冠狀病毒和2種流感病毒核酸的方法。方法根據(jù)互聯(lián)網(wǎng)公布的10種呼吸道感染病毒的基因序列,設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物和探針序列,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳篩選驗(yàn)證后,將探針點(diǎn)樣于醛基修飾基片,完成了檢測(cè)芯片制作。結(jié)果將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物用10倍梯度稀釋法稀釋后進(jìn)行基因芯片檢測(cè),結(jié)果表明可形成雜交斑點(diǎn)的最低檢測(cè)濃度為103copies/mL。結(jié)論研制的冠狀病毒基因芯片具有良好的特異度和靈敏度,可同時(shí)對(duì)SARS-CoV-2及其他呼吸道病毒同時(shí)進(jìn)行高通量快速檢測(cè)。
[關(guān)鍵詞]冠狀病毒;流感病毒;基因芯片
doi:10.3969/j.issn.1674-7593.2024.02.002
Preparation Method of Gene Chip for Rapid Qualitative Detection of Coronavirus inHuman Respiratory Samples and Its Effect Evaluation
Zheng Haoyu1,Zheng Wenxue1,Gu Yinuo1,An Yiming1,Zhang Jiaqi1,Zhang Yuhan1,Zhang Shanshan1,Meng Xiaoting2**,Wang Fang1**
1Department of Pathogen Biology,School of Basic Medical Sciences,Jilin University,Changchun130021;2Department of Histology amp;Embryology,School of Basic Medical Sciences,Jilin University,Changchun130021
**Corresponding author:Meng Xiaoting,email:mengxt@jlu.edu.cn;Wang fang,email:wf@jlu.edu.cn
[Abstract]ObjectiveTo explore the development method of coronavirus gene chip,and to establish a method for rapid qualitative detection of nucleic acids of 7 coronaviruses and 2 influenza viruses in respiratory infection samples such as human throat swabs,sputum,and alveolar lavage fluid.MethodsAccording to the gene sequences of 10 kinds of respiratory infection viruses published on the Internet,the corresponding primers and probe sequences were designed.After screening and verification by agarose gel electrophoresis,the probes were spotted on the aldehyde base modified substrate,completed the detection chip fabrication.ResultsThe PCR amplification product was diluted by 10-fold serial dilution method and then detected by gene chip.The results showed that the lowest detection concentration that could form hybridization spots was 103copies/mL.ConclusionThe developed coronavirus gene chip has good specificity and sensitivity, and can be used for simultaneous high-throughput and rapid detection of SARS-CoV-2 and other respiratory viruses.
[Key words]Coronavirus;Influenza virus;Gene chip
人冠狀病毒(Human corona viruses,HCoVs)感染是引起人類呼吸道疾病的重要病原之一,在常見呼吸道病原體中冠狀病毒檢出率約為3%~10%,是引發(fā)咳嗽、發(fā)熱、喉炎、支氣管炎以及肺炎等臨床癥狀的重要病原[1-2]。目前冠狀病毒感染檢測(cè)主要通過熒光PCR技術(shù),基因芯片技術(shù)一次性可檢測(cè)多種病毒,尤其當(dāng)需要對(duì)臨床癥狀相近病原體進(jìn)行鑒別或?qū)νN屬病原體分型時(shí),基因芯片技術(shù)方法可迅速確定病原體,從而避免檢測(cè)過程中耗時(shí)較長(zhǎng)、檢測(cè)效率較低、檢測(cè)成本較高、檢測(cè)時(shí)效性不強(qiáng)、靈敏度低,特異度差等缺陷,能真正達(dá)到臨床需要,提高臨床療效[3]。節(jié)省了分析數(shù)據(jù)的時(shí)間,在更短的時(shí)間內(nèi)得到多種病毒核酸檢測(cè)的數(shù)據(jù)信息。在冠狀病毒的鑒別診斷和監(jiān)控方面,尤其是針對(duì)新冠疫情病原體快速排查,該技術(shù)將發(fā)揮巨大優(yōu)勢(shì)[4]。目前基因芯片技術(shù)在冠狀病毒檢測(cè)方面的應(yīng)用甚少,本研究擬通過探討冠狀病毒基因芯片的設(shè)計(jì)、研制及初步臨床試驗(yàn)為新的冠狀病毒檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1冠狀病毒基因位點(diǎn)的確定
根據(jù)互聯(lián)網(wǎng)公布的10種呼吸道感染病毒的基
因序列,本研究確定了7種冠狀病毒:2019-nCov,SARS,MERS,HCoV-229E,HCoV-NL63,HCoV-OC43,HCoV-HKU1;3種常見的流感病毒:IFVA-H1N1,IFVA-H3N2和IFVB的特異性基因位點(diǎn)。
1.2試劑和儀器
生產(chǎn)本試劑盒所需的主要原材料分別為:酶、脫氧核糖核苷三磷酸(Deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)(Takara公司)、引物(生工生物工程上海股份有限公司)、探針(生工生物工程上海股份有限公司)、芯片(醛基修飾基片)(昆明寰基生物芯片產(chǎn)業(yè)有限公司)。
1.3芯片探針和引物的合成
針對(duì)每種病毒的候選保守基因設(shè)計(jì)了相應(yīng)的檢測(cè)探針和檢測(cè)引物,合成了DNA探針和引物。并根據(jù)探針、引物組合進(jìn)行了優(yōu)化,確定了引物序列。引物和探針序列見表1、表2。引物和探針的篩選見圖1。
1.4冠狀病毒芯片的制備
1.4.1探針緩沖液用點(diǎn)樣緩沖液將質(zhì)檢合格后的探針稀釋為100 ng/μL的點(diǎn)樣工作液。
1.4.2芯片點(diǎn)樣將點(diǎn)樣工作液按芯片上樣圖加入384孔樣品板中,將醛基修飾基片裝載于點(diǎn)樣tray上,運(yùn)行Arrayjet Marathon點(diǎn)樣儀的點(diǎn)樣程序進(jìn)行芯片點(diǎn)樣,芯片探針布局見圖2。
1.4.3點(diǎn)樣后處理芯片點(diǎn)樣后經(jīng)探針固定、封閉、洗脫、干燥后密封真空包裝。
1.4.4試劑配制(100 000級(jí)潔凈生產(chǎn)區(qū))逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)擴(kuò)增引物混合物的配制分裝:將引物凍干粉按裝量要求稀釋并混合為工作液濃度進(jìn)行分裝。RT-PCR擴(kuò)增試劑混合物的分裝:按照裝量要求,在低溫條件下對(duì)PCR擴(kuò)增試劑混合物進(jìn)行分裝。雜交緩沖液的配制分裝:按照雜交液組分進(jìn)行緩沖液配制及分裝。芯片洗脫液的配制和分裝:按照芯片洗脫液配方配制20×SSC和10%SDS并進(jìn)行分裝。
1.4.5陰性質(zhì)控配制及分裝(10 000級(jí)潔凈生產(chǎn)區(qū))將陰性質(zhì)控克隆質(zhì)粒模板稀釋至工作液濃度并進(jìn)行分裝。
1.4.6試劑盒組裝將PCR擴(kuò)增試劑混合物、PCR擴(kuò)增引物混合物、雜交緩沖液、陰性質(zhì)控放入試劑盒Ⅰ,將芯片、檸檬酸鈉緩沖液(20×SSC)、十二烷基硫酸鈉溶液(10%SDS)放入試劑盒Ⅱ,完成試劑盒組裝,按照規(guī)定的儲(chǔ)存條件入庫(kù)。
2結(jié)果
2.1基因芯片的靈敏度
將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用10倍梯度稀釋法稀釋后進(jìn)行基因芯片檢測(cè),結(jié)果表明可形成雜交斑點(diǎn)的最低檢測(cè)濃度為103copies/mL。
2.2基因芯片的重復(fù)性
不同批次3個(gè)芯片和同批次10個(gè)芯片的基因位置、雜交質(zhì)控和有效性控制清晰可見,陰性質(zhì)控?zé)o信號(hào),芯片背景值低,符合率100%。以上結(jié)果均表明該芯片具有良好的重復(fù)性。
2.3基因芯片的穩(wěn)定性
室溫避光保存6個(gè)月,芯片穩(wěn)定,基因芯片的檢測(cè)仍可正常進(jìn)行。
2.4基因芯片雜交結(jié)果
芯片探針布局中:NC為陰性質(zhì)控探針;IC為提取對(duì)照兼內(nèi)對(duì)照探針;HC為雜交陽性對(duì)照探針;BC為空白點(diǎn);(2019-nCoV) ORF1ab和E和N靶基因?yàn)樾滦凸跔畈《緳z測(cè)探針;SARS、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1為冠狀病毒檢測(cè)探針;H1N1為甲型流感病毒的檢測(cè)探針;H3N2為甲型流感病毒H3N2的檢測(cè)探針;IFV-B為乙型流感病毒的檢測(cè)探針。對(duì)于任意探針位點(diǎn),其熒光值中值≥1.5倍熒光背景值,判斷該位點(diǎn)為“陽性”,否則該位點(diǎn)判斷為“陰性”。判斷NC:若其2個(gè)重復(fù)位點(diǎn)中,滿足“陰性”的位點(diǎn)數(shù)等于2,則繼續(xù)進(jìn)行基因芯片重復(fù)性判讀,否則判讀結(jié)果為“失敗”。判斷IC:若其2個(gè)重復(fù)位點(diǎn)中,滿足“陽性”的位點(diǎn)數(shù)等于2,則繼續(xù)進(jìn)行基因芯片穩(wěn)定性判讀,否則判讀結(jié)果為“失敗”。判斷HC:若其2個(gè)重復(fù)位點(diǎn)中,滿足“陽性”的位點(diǎn)數(shù)等于2,則繼續(xù)進(jìn)行基因芯片雜交結(jié)果判讀,否則判斷結(jié)果為“失敗”。判斷病原體檢測(cè)探針:例如US-2019-nCov-N探針,若其2個(gè)重復(fù)位點(diǎn)滿足“陽性”的位點(diǎn)數(shù)等于2,則判為新型冠狀病毒(2019-nCoV)檢測(cè)結(jié)果為“陽性”;否則判斷結(jié)果為“陰性”。陰性標(biāo)準(zhǔn)品和正常人標(biāo)本基因芯片檢測(cè)結(jié)果見圖3,呼吸道感染病毒陽性標(biāo)準(zhǔn)品的基因芯片檢測(cè)結(jié)果見圖4。
3討論
流行病學(xué)研究表明,HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKUI這4種HCoVs在世界各地均有流行,呈全球性分布,臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、鼻炎、喉炎以及支氣管炎、肺炎等,給人類生命健康造成一定的威脅[5]。SARS-CoV和MERS-CoV這2種冠狀病毒感染人后卻能造成急性呼吸道癥狀,嚴(yán)重者引發(fā)呼吸系統(tǒng)和腎功能系統(tǒng)衰竭并造成死亡。
MERS-CoV作為近期出現(xiàn)的HCoVs,目前全球已有26個(gè)國(guó)家及地區(qū)報(bào)道了確診病例2 428例,死亡839例,死亡率高達(dá)34.6%[6]。2019新型冠狀病毒(2019-nCoV)的傳播速度快,傳播速度廣,嚴(yán)重危害人類健康,威脅人類生存環(huán)境[7]。
流行性感冒病毒,簡(jiǎn)稱流感病毒,是一種造成人類及動(dòng)物患流行性感冒的RNA病毒,屬于正黏液病毒科[8]。流感病毒侵襲的目標(biāo)是呼吸道黏膜上皮細(xì)胞,感染后會(huì)造成急性上呼吸道感染。由于流感病毒可經(jīng)空氣傳播,且會(huì)引起大范圍的流行,尤其是在免疫力低下的人群中會(huì)引起嚴(yán)重癥狀,如肺炎,心力衰竭等。臨床以突發(fā)、高熱、咳嗽、呼吸困難、衰竭、高發(fā)病率、低死亡率為主要特征[9]。輕癥流感的癥狀局限于上呼吸道,表現(xiàn)為發(fā)燒、喉痛、流涕、咳嗽、頭痛、肌肉疼痛以及疲勞;重癥流感或下呼吸道繼發(fā)性細(xì)菌感染會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重肺炎,甚至危及生命[10]。新病毒株在抗原性上與以往流行株非常不同,人類面對(duì)新病毒株缺乏免疫力往往導(dǎo)致嚴(yán)重感染以及死亡率激增。流感的暴發(fā)已有百年的歷史,每次流感疫情均給經(jīng)濟(jì)發(fā)展和公共衛(wèi)生帶來巨大的損失,因此建立快速檢測(cè)流感病毒的診斷技術(shù)是預(yù)防和控制該疾病流行的一個(gè)重要保障。
基因芯片具有以下特點(diǎn):①靈敏度和高特異度?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢測(cè)手段主要有兩類,一類是蛋白質(zhì),一類是核酸。其中核酸檢測(cè)是未來發(fā)展的方向。由于核酸可以用PCR方法擴(kuò)增,只要檢測(cè)反應(yīng)管中有1個(gè)分子存在,就可以被檢測(cè)到,PCR檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)靈敏度到達(dá)了當(dāng)前檢測(cè)技術(shù)所能達(dá)到的極限,但該技術(shù)的缺陷是不能準(zhǔn)確判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的特異度?;蛐酒夹g(shù)是將PCR技術(shù)和分子雜交技術(shù)相結(jié)合,由于分子雜交是可以準(zhǔn)確判斷其雜交特異度的。因此,基因芯片技術(shù)是將目前靈敏度最高的技術(shù)與特異度最好的技術(shù)相結(jié)合,特異度和靈敏度都達(dá)到了空前的水平,這是其他任何技術(shù)都不能比擬的[11-13]。②高通量檢測(cè)。傳統(tǒng)檢測(cè)手段一次取樣,僅能對(duì)一個(gè)或者少數(shù)幾個(gè)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),無法實(shí)現(xiàn)全系統(tǒng)和全景式的檢驗(yàn)?;蛐酒捎趯⒋罅可锾结樃鶕?jù)系統(tǒng)化高通量檢測(cè)的需求有機(jī)組合,實(shí)現(xiàn)了一次對(duì)一個(gè)系統(tǒng)(如泌尿生殖系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等)的全景檢測(cè),有利于對(duì)癥狀相似的疾病或復(fù)雜疾病進(jìn)行準(zhǔn)確快速判斷[14-17]。③避免了假陰性。由于病原體的變異較快,因此一旦檢測(cè)位點(diǎn)發(fā)生變異,檢測(cè)就無法進(jìn)行,在基因芯片設(shè)計(jì)上可以針對(duì)每個(gè)待測(cè)項(xiàng)目設(shè)計(jì)多個(gè)檢測(cè)探針,實(shí)現(xiàn)了類似于“多次重復(fù)檢測(cè)取平均”的檢測(cè)過程,多位點(diǎn)的檢測(cè)使漏檢的概率大大降低[18-20]。④平行對(duì)照。傳統(tǒng)檢測(cè)手段由于檢測(cè)通量較低,只能將對(duì)照體系設(shè)計(jì)在檢測(cè)體系之外,與檢測(cè)流程同時(shí)進(jìn)行?;蛐酒邆涞母咄刻匦?,在芯片設(shè)計(jì)時(shí)能夠在點(diǎn)陣中引入多種質(zhì)控對(duì)照點(diǎn),在檢測(cè)過程內(nèi)部對(duì)標(biāo)本采集,PCR擴(kuò)增、雜交操作等環(huán)節(jié)進(jìn)行質(zhì)控,極大地提高了檢測(cè)的可靠性[21-25]。⑤成本大幅度降低。由于同時(shí)進(jìn)行多項(xiàng)目檢測(cè),平均到每個(gè)項(xiàng)目的檢測(cè)費(fèi)用就相應(yīng)降低。⑥快速方便,基因芯片一般是一個(gè)工作日可以出結(jié)果。而現(xiàn)有的其他技術(shù)都是逐項(xiàng)的檢測(cè),多個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行下來,就需要幾天時(shí)間,這同時(shí)又可能因樣本保存時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的錯(cuò)誤。
本試劑盒具有快速、準(zhǔn)確、客觀、定性檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn),能同時(shí)檢測(cè)臨床標(biāo)本中的9種呼吸道感染病毒。包括7種冠狀病毒[2019-nCoV ORF1ab和N基因、E基因,SARS核酸,中東呼吸綜合征冠狀病毒(ORF1a基因)核酸,HCoV-229E核酸,HCoV-NL63核酸,HCoV-OC43核酸,HCoV-HKU1核酸]和2種流感病毒[甲型流感病毒IFV-A(H1N1、H3N2),乙型流感病毒IFV-B]的核酸,綜合檢測(cè)靈敏度達(dá)到5×103copies/mL,尤其適用于大樣本量的篩查,是一種非常有發(fā)展前景的檢測(cè)方法。
在國(guó)內(nèi),目前沒有類似基因芯片法的檢測(cè)產(chǎn)品。根據(jù)實(shí)用的重要性及檢測(cè)費(fèi)用的經(jīng)濟(jì)性,本產(chǎn)品選擇了9種呼吸道感染病毒進(jìn)行檢測(cè)。利用基因芯片技術(shù),能夠一次性、快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)病毒。從而真正達(dá)到臨床需要,提高臨床療效。
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(2023-10-26收稿)