［摘要］目的探討冠狀病毒基因芯片的研制方法，建立一種快速定性檢測人咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等呼吸道感染樣本中的7種冠狀病毒和2種流感病毒核酸的方法。方法根據(jù)互聯(lián)網(wǎng)公布的10種呼吸道感染病毒的基因序列，設(shè)計了相應(yīng)的引物和探針序列，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳篩選驗證后，將探針點樣于醛基修飾基片，完成了檢測芯片制作。結(jié)果將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增產(chǎn)物用10倍梯度稀釋法稀釋后進(jìn)行基因芯片檢測，結(jié)果表明可形成雜交斑點的最低檢測濃度為103copies/mL。結(jié)論研制的冠狀病毒基因芯片具有良好的特異度和靈敏度，可同時對SARS-CoV-2及其他呼吸道病毒同時進(jìn)行高通量快速檢測。

［關(guān)鍵詞］冠狀病毒；流感病毒；基因芯片

doi：10.3969/j.issn.1674-7593.2024.02.002

Preparation Method of Gene Chip for Rapid Qualitative Detection of Coronavirus inHuman Respiratory Samples and Its Effect Evaluation

Zheng Haoyu1，Zheng Wenxue1，Gu Yinuo1，An Yiming1，Zhang Jiaqi1，Zhang Yuhan1，Zhang Shanshan1，Meng Xiaoting2**，Wang Fang1**

1Department of Pathogen Biology，School of Basic Medical Sciences，Jilin University，Changchun130021；2Department of Histology amp;Embryology，School of Basic Medical Sciences，Jilin University，Changchun130021

**Corresponding author：Meng Xiaoting，email：mengxt@jlu.edu.cn；Wang fang，email：wf@jlu.edu.cn

［Abstract］ObjectiveTo explore the development method of coronavirus gene chip，and to establish a method for rapid qualitative detection of nucleic acids of 7 coronaviruses and 2 influenza viruses in respiratory infection samples such as human throat swabs，sputum，and alveolar lavage fluid.MethodsAccording to the gene sequences of 10 kinds of respiratory infection viruses published on the Internet，the corresponding primers and probe sequences were designed.After screening and verification by agarose gel electrophoresis，the probes were spotted on the aldehyde base modified substrate，completed the detection chip fabrication.ResultsThe PCR amplification product was diluted by 10-fold serial dilution method and then detected by gene chip.The results showed that the lowest detection concentration that could form hybridization spots was 103copies/mL.ConclusionThe developed coronavirus gene chip has good specificity and sensitivity， and can be used for simultaneous high-throughput and rapid detection of SARS-CoV-2 and other respiratory viruses.

［Key words］Coronavirus；Influenza virus；Gene chip

人冠狀病毒（Human corona viruses，HCoVs）感染是引起人類呼吸道疾病的重要病原之一，在常見呼吸道病原體中冠狀病毒檢出率約為3％～10％，是引發(fā)咳嗽、發(fā)熱、喉炎、支氣管炎以及肺炎等臨床癥狀的重要病原［1-2］。目前冠狀病毒感染檢測主要通過熒光PCR技術(shù)，基因芯片技術(shù)一次性可檢測多種病毒，尤其當(dāng)需要對臨床癥狀相近病原體進(jìn)行鑒別或?qū)νN屬病原體分型時，基因芯片技術(shù)方法可迅速確定病原體，從而避免檢測過程中耗時較長、檢測效率較低、檢測成本較高、檢測時效性不強、靈敏度低，特異度差等缺陷，能真正達(dá)到臨床需要，提高臨床療效［3］。節(jié)省了分析數(shù)據(jù)的時間，在更短的時間內(nèi)得到多種病毒核酸檢測的數(shù)據(jù)信息。在冠狀病毒的鑒別診斷和監(jiān)控方面，尤其是針對新冠疫情病原體快速排查，該技術(shù)將發(fā)揮巨大優(yōu)勢［4］。目前基因芯片技術(shù)在冠狀病毒檢測方面的應(yīng)用甚少，本研究擬通過探討冠狀病毒基因芯片的設(shè)計、研制及初步臨床試驗為新的冠狀病毒檢測方法奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1冠狀病毒基因位點的確定

根據(jù)互聯(lián)網(wǎng)公布的10種呼吸道感染病毒的基

因序列，本研究確定了7種冠狀病毒：2019-nCov，SARS，MERS，HCoV-229E，HCoV-NL63，HCoV-OC43，HCoV-HKU1；3種常見的流感病毒：IFVA-H1N1，IFVA-H3N2和IFVB的特異性基因位點。

1.2試劑和儀器

生產(chǎn)本試劑盒所需的主要原材料分別為：酶、脫氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（Takara公司）、引物（生工生物工程上海股份有限公司）、探針（生工生物工程上海股份有限公司）、芯片（醛基修飾基片）（昆明寰基生物芯片產(chǎn)業(yè)有限公司）。

1.3芯片探針和引物的合成

針對每種病毒的候選保守基因設(shè)計了相應(yīng)的檢測探針和檢測引物，合成了DNA探針和引物。并根據(jù)探針、引物組合進(jìn)行了優(yōu)化，確定了引物序列。引物和探針序列見表1、表2。引物和探針的篩選見圖1。

1.4冠狀病毒芯片的制備

1.4.1探針緩沖液用點樣緩沖液將質(zhì)檢合格后的探針稀釋為100 ng/μL的點樣工作液。

1.4.2芯片點樣將點樣工作液按芯片上樣圖加入384孔樣品板中，將醛基修飾基片裝載于點樣tray上，運行Arrayjet Marathon點樣儀的點樣程序進(jìn)行芯片點樣，芯片探針布局見圖2。

1.4.3點樣后處理芯片點樣后經(jīng)探針固定、封閉、洗脫、干燥后密封真空包裝。

1.4.4試劑配制（100 000級潔凈生產(chǎn)區(qū)）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）擴增引物混合物的配制分裝：將引物凍干粉按裝量要求稀釋并混合為工作液濃度進(jìn)行分裝。RT-PCR擴增試劑混合物的分裝：按照裝量要求，在低溫條件下對PCR擴增試劑混合物進(jìn)行分裝。雜交緩沖液的配制分裝：按照雜交液組分進(jìn)行緩沖液配制及分裝。芯片洗脫液的配制和分裝：按照芯片洗脫液配方配制20×SSC和10%SDS并進(jìn)行分裝。

1.4.5陰性質(zhì)控配制及分裝（10 000級潔凈生產(chǎn)區(qū)）將陰性質(zhì)控克隆質(zhì)粒模板稀釋至工作液濃度并進(jìn)行分裝。

1.4.6試劑盒組裝將PCR擴增試劑混合物、PCR擴增引物混合物、雜交緩沖液、陰性質(zhì)控放入試劑盒Ⅰ，將芯片、檸檬酸鈉緩沖液（20×SSC）、十二烷基硫酸鈉溶液（10%SDS）放入試劑盒Ⅱ，完成試劑盒組裝，按照規(guī)定的儲存條件入庫。

2結(jié)果

2.1基因芯片的靈敏度

將PCR擴增產(chǎn)物用10倍梯度稀釋法稀釋后進(jìn)行基因芯片檢測，結(jié)果表明可形成雜交斑點的最低檢測濃度為103copies/mL。

2.2基因芯片的重復(fù)性

不同批次3個芯片和同批次10個芯片的基因位置、雜交質(zhì)控和有效性控制清晰可見，陰性質(zhì)控?zé)o信號，芯片背景值低，符合率100%。以上結(jié)果均表明該芯片具有良好的重復(fù)性。

2.3基因芯片的穩(wěn)定性

室溫避光保存6個月，芯片穩(wěn)定，基因芯片的檢測仍可正常進(jìn)行。

2.4基因芯片雜交結(jié)果

芯片探針布局中：NC為陰性質(zhì)控探針；IC為提取對照兼內(nèi)對照探針；HC為雜交陽性對照探針；BC為空白點；（2019-nCoV） ORF1ab和E和N靶基因為新型冠狀病毒檢測探針；SARS、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1為冠狀病毒檢測探針；H1N1為甲型流感病毒的檢測探針；H3N2為甲型流感病毒H3N2的檢測探針；IFV-B為乙型流感病毒的檢測探針。對于任意探針位點，其熒光值中值≥1.5倍熒光背景值，判斷該位點為“陽性”，否則該位點判斷為“陰性”。判斷NC：若其2個重復(fù)位點中，滿足“陰性”的位點數(shù)等于2，則繼續(xù)進(jìn)行基因芯片重復(fù)性判讀，否則判讀結(jié)果為“失敗”。判斷IC：若其2個重復(fù)位點中，滿足“陽性”的位點數(shù)等于2，則繼續(xù)進(jìn)行基因芯片穩(wěn)定性判讀，否則判讀結(jié)果為“失敗”。判斷HC：若其2個重復(fù)位點中，滿足“陽性”的位點數(shù)等于2，則繼續(xù)進(jìn)行基因芯片雜交結(jié)果判讀，否則判斷結(jié)果為“失敗”。判斷病原體檢測探針：例如US-2019-nCov-N探針，若其2個重復(fù)位點滿足“陽性”的位點數(shù)等于2，則判為新型冠狀病毒（2019-nCoV）檢測結(jié)果為“陽性”；否則判斷結(jié)果為“陰性”。陰性標(biāo)準(zhǔn)品和正常人標(biāo)本基因芯片檢測結(jié)果見圖3，呼吸道感染病毒陽性標(biāo)準(zhǔn)品的基因芯片檢測結(jié)果見圖4。

3討論

流行病學(xué)研究表明，HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKUI這4種HCoVs在世界各地均有流行，呈全球性分布，臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、鼻炎、喉炎以及支氣管炎、肺炎等，給人類生命健康造成一定的威脅［5］。SARS-CoV和MERS-CoV這2種冠狀病毒感染人后卻能造成急性呼吸道癥狀，嚴(yán)重者引發(fā)呼吸系統(tǒng)和腎功能系統(tǒng)衰竭并造成死亡。

MERS-CoV作為近期出現(xiàn)的HCoVs，目前全球已有26個國家及地區(qū)報道了確診病例2 428例，死亡839例，死亡率高達(dá)34.6％［6］。2019新型冠狀病毒（2019-nCoV）的傳播速度快，傳播速度廣，嚴(yán)重危害人類健康，威脅人類生存環(huán)境［7］。

流行性感冒病毒，簡稱流感病毒，是一種造成人類及動物患流行性感冒的RNA病毒，屬于正黏液病毒科［8］。流感病毒侵襲的目標(biāo)是呼吸道黏膜上皮細(xì)胞，感染后會造成急性上呼吸道感染。由于流感病毒可經(jīng)空氣傳播，且會引起大范圍的流行，尤其是在免疫力低下的人群中會引起嚴(yán)重癥狀，如肺炎，心力衰竭等。臨床以突發(fā)、高熱、咳嗽、呼吸困難、衰竭、高發(fā)病率、低死亡率為主要特征［9］。輕癥流感的癥狀局限于上呼吸道，表現(xiàn)為發(fā)燒、喉痛、流涕、咳嗽、頭痛、肌肉疼痛以及疲勞；重癥流感或下呼吸道繼發(fā)性細(xì)菌感染會導(dǎo)致嚴(yán)重肺炎，甚至危及生命［10］。新病毒株在抗原性上與以往流行株非常不同，人類面對新病毒株缺乏免疫力往往導(dǎo)致嚴(yán)重感染以及死亡率激增。流感的暴發(fā)已有百年的歷史，每次流感疫情均給經(jīng)濟發(fā)展和公共衛(wèi)生帶來巨大的損失，因此建立快速檢測流感病毒的診斷技術(shù)是預(yù)防和控制該疾病流行的一個重要保障。

基因芯片具有以下特點：①靈敏度和高特異度?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢測手段主要有兩類，一類是蛋白質(zhì)，一類是核酸。其中核酸檢測是未來發(fā)展的方向。由于核酸可以用PCR方法擴增，只要檢測反應(yīng)管中有1個分子存在，就可以被檢測到，PCR檢測技術(shù)的檢測靈敏度到達(dá)了當(dāng)前檢測技術(shù)所能達(dá)到的極限，但該技術(shù)的缺陷是不能準(zhǔn)確判斷擴增產(chǎn)物的特異度。基因芯片技術(shù)是將PCR技術(shù)和分子雜交技術(shù)相結(jié)合，由于分子雜交是可以準(zhǔn)確判斷其雜交特異度的。因此，基因芯片技術(shù)是將目前靈敏度最高的技術(shù)與特異度最好的技術(shù)相結(jié)合，特異度和靈敏度都達(dá)到了空前的水平，這是其他任何技術(shù)都不能比擬的［11-13］。②高通量檢測。傳統(tǒng)檢測手段一次取樣，僅能對一個或者少數(shù)幾個指標(biāo)進(jìn)行檢測，無法實現(xiàn)全系統(tǒng)和全景式的檢驗。基因芯片由于將大量生物探針根據(jù)系統(tǒng)化高通量檢測的需求有機組合，實現(xiàn)了一次對一個系統(tǒng)（如泌尿生殖系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等）的全景檢測，有利于對癥狀相似的疾病或復(fù)雜疾病進(jìn)行準(zhǔn)確快速判斷［14-17］。③避免了假陰性。由于病原體的變異較快，因此一旦檢測位點發(fā)生變異，檢測就無法進(jìn)行，在基因芯片設(shè)計上可以針對每個待測項目設(shè)計多個檢測探針，實現(xiàn)了類似于“多次重復(fù)檢測取平均”的檢測過程，多位點的檢測使漏檢的概率大大降低［18-20］。④平行對照。傳統(tǒng)檢測手段由于檢測通量較低，只能將對照體系設(shè)計在檢測體系之外，與檢測流程同時進(jìn)行?；蛐酒邆涞母咄刻匦?，在芯片設(shè)計時能夠在點陣中引入多種質(zhì)控對照點，在檢測過程內(nèi)部對標(biāo)本采集，PCR擴增、雜交操作等環(huán)節(jié)進(jìn)行質(zhì)控，極大地提高了檢測的可靠性［21-25］。⑤成本大幅度降低。由于同時進(jìn)行多項目檢測，平均到每個項目的檢測費用就相應(yīng)降低。⑥快速方便，基因芯片一般是一個工作日可以出結(jié)果。而現(xiàn)有的其他技術(shù)都是逐項的檢測，多個項目進(jìn)行下來，就需要幾天時間，這同時又可能因樣本保存時間過長導(dǎo)致檢測結(jié)果的錯誤。

本試劑盒具有快速、準(zhǔn)確、客觀、定性檢測的優(yōu)點，能同時檢測臨床標(biāo)本中的9種呼吸道感染病毒。包括7種冠狀病毒［2019-nCoV ORF1ab和N基因、E基因，SARS核酸，中東呼吸綜合征冠狀病毒（ORF1a基因）核酸，HCoV-229E核酸，HCoV-NL63核酸，HCoV-OC43核酸，HCoV-HKU1核酸］和2種流感病毒［甲型流感病毒IFV-A（H1N1、H3N2），乙型流感病毒IFV-B］的核酸，綜合檢測靈敏度達(dá)到5×103copies/mL，尤其適用于大樣本量的篩查，是一種非常有發(fā)展前景的檢測方法。

在國內(nèi)，目前沒有類似基因芯片法的檢測產(chǎn)品。根據(jù)實用的重要性及檢測費用的經(jīng)濟性，本產(chǎn)品選擇了9種呼吸道感染病毒進(jìn)行檢測。利用基因芯片技術(shù)，能夠一次性、快速、準(zhǔn)確地檢測病毒。從而真正達(dá)到臨床需要，提高臨床療效。

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（2023-10-26收稿）