徐微微 陽柳思 徐婧 周有連 王紅

【摘要】目的 明確海藻希瓦菌（S.algae）對小鼠結(jié)直腸腺瘤發(fā)生發(fā)展的影響及探討其對免疫微環(huán)境的調(diào)控作用。方法 將24只小鼠分為3組：對照組、偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸鈉（DSS）組、AOM/DSS+S.algae組。比較各組小鼠的生存狀態(tài)和結(jié)直腸腺瘤情況。取AOM/DSS組、AOM/DSS+S.algae組小鼠結(jié)直腸組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，利用基因集富集分析和免疫浸潤分析其免疫相關(guān)通路、免疫細胞和免疫因子的變化。結(jié)果 與AOM/DSS組相比，AOM/DSS+S.algae組小鼠體質(zhì)量、存活率均下降，血便情況加重，生存狀態(tài)較差、結(jié)直腸長度縮短（P均< 0.05），平均腺瘤數(shù)量及大小增多（P均< 0.05）。與AOM/DSS組相比，AOM/DSS+S.algae組炎癥反應(yīng)增強（P < 0.05），促炎細胞因子白介素（IL）-2、IL-6、IL-12、IL-17、干擾素、腫瘤壞死因子（P均< 0.05）和IL-1β的產(chǎn)生呈上升趨勢，抑炎細胞因子IL-4、IL-10、IL-13（P均< 0.05）和轉(zhuǎn)化生長因子β呈抑制趨勢，初始B細胞和效應(yīng)B細胞（P < 0.05）呈增多趨勢，且激活小鼠體內(nèi)核因子-κB（NF-κB）信號通路。結(jié)論 S.algae可能通過激活免疫信號（如活化B細胞和激活NF-κB通路），形成促腫瘤免疫微環(huán)境，進而促進結(jié)直腸腺瘤發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】海藻希瓦菌；結(jié)直腸腺瘤；免疫微環(huán)境；NF-κB；B細胞

Effect of Shewanella algae on the incidence and progression of colorectal adenoma and immune microenvironment in mice

XU Weiwei1， YANG Liusi1， XU Jing1， ZHOU Youlian2， WANG Hong1， 2

（1.School of Medicine， South China University of Technology， Guangzhou 510006， China； 2.Department of Gastroenterology， the Second Affiliated Hospital， School of Medicine， South China University of Technology， Guangzhou 510180， China）

Corresponding author： WANG Hong， E-mail： eywanghong@scut.edu.cn

【Abstract】Objective To investigate the effect of Shewanella algae （S.algae） on the occurrence and development of colorectal adenoma and its regulatory effect on the immune microenvironment in mice. Methods ? Twenty-four mice were divided into three groups： control group， azoxymethane （AOM）/ dextran sodium sulfate （DSS） group， AOM/DSS+S.algae group. The survival status and colorectal adenoma of mice were compared among three groups. Colorectal tissues in the AOM/DSS group and AOM/DSS+

S.algae group were collected for high-throughput RNA-seq. Gene set enrichment analysis （GSEA）and cell-type identification by estimating relative subsets of RNA transcripts （CIBERSORT） were used to analyze the changes of immune-related pathways， immune cells and immune factors. Results Compared with the AOM/DSS group， the body weight （P < 0.05） and survival rate were decreased， the hematochezia was aggravated， the survival status was worsened，the colorectal length was shortened （all P < 0.05）， and the average number and size of adenomas were significantly increased （both P < 0.05） in the AOM/DSS+S.algae group. Compared with the AOM/DSS group， the inflammatory responses were significantly enhanced in AOM/DSS+S.algae group （P < 0.05）. The production of pro-inflammatory cytokines including interleukin （IL）-2， IL-6， IL-12， IL-17， interferon （IFN）， tumor necrosis factor （TNF） （all P < 0.05） and IL-1β showed an upward trend in the AOM/DSS+S.algae group， while the production of anti-inflammatory cytokines including IL-4， IL-10， IL-13 （all P < 0.05） and transforming growth factor β showed an inhibitory trend. Both naive B cells and plasma cells （both P < 0.05） were increased in AOM/DSS+S.algae group， and the nuclear factor -κB （NF-κB） signaling pathway was activated. Conclusion S.algae may form a tumor-promoting immune microenvironment by activating immune signals， such as activation of B cells and activation of the NF-κB pathway， and then promote the development of colorectal adenoma.

【Key words】 Shewanella algae； Colorectal adenoma； Immune microenvironment； NF-κB； B cell

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因，在最新發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計中，2022年全球估計有2 000萬例新發(fā)病例和970萬例癌癥死亡。其中在2 000萬例新發(fā)病例中CRC占9.6%（僅次于肺癌和女性乳腺癌），在970萬例癌癥死亡病例中CRC占9.3%（僅次于肺癌）［1］。在美國每年約有15萬例CRC新發(fā)病例［2］，近年來，由于飲食及生活方式的改變，我國CRC發(fā)病率和病死率逐年上升，發(fā)病模式也逐漸接近發(fā)達國家［3］。結(jié)直腸腺瘤（colorectal adenoma， CRA）是由正常結(jié)直腸黏膜組織逐漸演變?yōu)楫惓Ｔ錾ㄏ⑷?、腺瘤），被公認為CRC癌前病變［4］?！跋倭?癌”為大多數(shù)CRC的發(fā)生模式［5］。

腸道菌群失衡已被證實是與CRA形成及CRC 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的重要因素［6-7］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，作為CRC的早期事件，CRA患者亦存在腸菌失衡現(xiàn)象，進展期CRA患者腸道菌群結(jié)構(gòu)顯著區(qū)別于正常人和CRC患者［8-9］，其中，海藻希瓦菌（Shewanella algae，S.algae）的過度增殖與CRA形成和CRC發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)［10］，提示S.algae在CRA的發(fā)病機制中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。

S.algae的相關(guān)臨床研究很少，對結(jié)直腸的作用不清楚，其真正臨床意義尚未可知。本研究通過對結(jié)直腸腺瘤小鼠模型灌胃S.algae，明確S.algae在CRA發(fā)生發(fā)展中的作用及對腸道炎癥微環(huán)境的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

24只C57BL/6J小鼠（雄性；8～9周齡；體質(zhì)量

20～24 g）均購買于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司。所有程序均根據(jù)動物護理指導(dǎo)方案進行，并經(jīng)華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院的動物倫理機構(gòu)委員會批準（批件號：K-2021-139）。小鼠飼養(yǎng)在特定的無病原體條件下，并處于穩(wěn)定的溫度（22±2）℃和濕度（40%～70%）屏障系統(tǒng)中，具有12 h的光/暗循環(huán)，并提供食物和水。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設(shè)計

將24只小鼠隨機分為3組（每組n = 8）：對照組（Control）、偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）/

葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）組、AOM/DSS+S.algae組。除Control組外，其余小鼠于實驗開始當日予AOM（10 mg/kg），方式為腹腔注射。休息1周，根據(jù)小鼠此時體質(zhì)量重新分組。之后飲用2.5%的DSS 6 d后，改用正常飲用水（高壓滅菌）2周［11］，AOM/DSS+S.algae組在飲用DSS 日開始每隔1 d灌胃S.algae（1×108 CFU/mL，

0.2 mL）1次，直至實驗終點（28 d），對照組小鼠予等體積生理鹽水灌胃。

1.2.2 細菌培養(yǎng)

S.algae購買于北納生物，并在2216E培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)于37℃培養(yǎng)箱中。將對數(shù)生長期（OD600 nm=0.6～1.0）的細菌以5 000 r/min離心

10 min，PBS洗滌2次后，在細菌沉淀加入適量生理鹽水至OD600 nm=1.0，此時重懸液中菌液的濃度約為1×108 CFU/mL，用于小鼠灌胃。

1.2.3 生存分數(shù)記錄

每周測量小鼠體質(zhì)量1～2次，根據(jù)表1進行生存評分并記錄。

1.2.4 小鼠取材

第28日通過腹膜內(nèi)注射戊巴比妥（50 mg/kg）麻醉實驗小鼠進行腸組織和脾的取樣。用預(yù)冷的1%牛血清白蛋白清洗腸道，測量腸道長度，稱量大腸質(zhì)量及脾質(zhì)量。用剪刀沿長軸方向剖開腸腔，拍照記錄腺瘤的有無、數(shù)量、生長位置和大小等。

1.2.5 RNA抽提和文庫構(gòu)建

采用TRIzol試劑依照說明書提取總RNA。使用 NanoDrop 2000分光光度計（Thermo Scientific， 美國）鑒定RNA純度和定量，使用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，

美國）評估RNA完整性。使用VAHTS Universal V5 RNA-seq Library Prep試劑盒依照說明書構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫。轉(zhuǎn)錄組測序和分析由上海歐易生物技術(shù)有限公司（上海，中國）進行。

1.2.6 RNA測序和差異表達基因分析

采用Illumina Novaseq 6000測序平臺對文庫進行測序，并生成150 bp雙端reads。采用fastp軟件對fastq格式的raw reads進行處理，去除低質(zhì)量reads后獲得clean reads用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。使用HISAT2軟件進行參考基因組比對，并進行基因表達量（fragments per kilobase million，F(xiàn)PKM）［12］計算，并通過HTSeq-count獲得每個基因的reads 計數(shù)（counts）。使用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）［13-14］軟件進行基因集富集分析，使用預(yù)定義的基因集，將基因按照在2類樣本中的差異表達程度排序，然后檢驗預(yù)先設(shè)定的基因集是否在這個排序表的頂端或者底端富集。

1.2.7 免疫浸潤分析

CIBERSORT （cell-type identification by estimating

relative subsets of RNA transcripts）［15］是一種常用的免疫浸潤分析方法，該方法基于已知參考數(shù)據(jù)集，默認提供22種免疫細胞亞型的基因表達特征集：LM22。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 9、Adobe Illustrator 2023進行分析與繪圖。計量資料采用Shapiro-Wilk進行正態(tài)性檢驗，實驗數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 S.algae對結(jié)直腸腺瘤小鼠生存狀態(tài)的影響

在AOM/DSS基礎(chǔ)上對小鼠進行S.algae的灌胃，可以發(fā)現(xiàn)灌胃后，AOM/DSS+S.algae組體質(zhì)量較AOM/DSS組有所下降，其中在第26日和第28日，AOM/DSS+S.algae與AOM/DSS組體質(zhì)量有較大差異（P均< 0.01），在其他天數(shù)時，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1A）。與AOM/DSS組相比，AOM/DSS+S.algae組精神狀態(tài)明顯較差、毛色不光澤，進食和飲水有下降，同時有嚴重的血便現(xiàn)象（圖1B、C），對末次即第26日的生存分數(shù)進行分析，各單項指標的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，但AOM/DSS+S.algae組的生存總分低于AOM/DSS組的總分（P < 0.05，表2）。在實驗終點結(jié)束前，AOM/DSS+S.algae組生存率有下降，而AOM/DSS組和野生對照組生存率都沒有變化，未有小鼠死亡現(xiàn)象的發(fā)生（圖1D）。

2.2 S.algae對小鼠結(jié)直腸腺瘤發(fā)生發(fā)展的影響

對各組小鼠結(jié)直腸段和脾取材測量觀察，AOM/DSS+S.algae組和AOM/DSS組的脾質(zhì)量和腸質(zhì)量均高于Control組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。AOM/DSS組和AOM/DSS+S.algae組的脾和腸質(zhì)量差異雖無統(tǒng)計意義，但與AOM/DSS組相比，AOM/DSS+S.algae組的脾和腸質(zhì)量顯示出更重的趨勢（表3）。而結(jié)直腸長度AOM/DSS+S.algae組和AOM/DSS組較Control組有所下降，其中AOM/DSS+S.algae組下降得更為明顯（表3和圖2A）。把腸道清洗后縱向剖開，肉眼觀察到與AOM/DSS組相比，AOM/DSS+S.algae組腺瘤數(shù)量增多（P < 0.05，圖2B、C），在腸道的上中下段都有分布而且體積也較大。與AOM/DSS組相比，AOM/DSS+

S.algae組直徑大于2 mm的腺瘤數(shù)量較多（P < 0.001，圖2D）。

2.3 S.algae促進小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)

用AOM/DSS+S.algae組和AOM/DSS組的小鼠結(jié)腸部分提取總RNA構(gòu)建cDNA文庫，通過高通量測序檢測差異基因與變化的通路。對測序結(jié)果進行GSEA分析，結(jié)果顯示，與AOM/DSS組相比，AOM/DSS+S.algae組中炎癥反應(yīng)通路活化程度更高（P < 0.001，圖3A），此外還顯示出AOM/DSS+

S.algae組B細胞的增殖較高（P = 0.004，圖3B）。結(jié)果提示與AOM/DSS組相比，加入S.algae后，小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)可能有所增強。

2.4 S.algae干預(yù)后小鼠體內(nèi)免疫微環(huán)境的改變

利用CIBERSORT法評估小鼠結(jié)直腸腺瘤組織免疫浸潤情況。CIBERSORT可通過不同免疫細胞中標志基因的差異表達分析出樣品中各種免疫細胞的種類和分布，提供22種免疫細胞亞型的基因表達特征集。結(jié)果顯示，初始B細胞、M0巨噬細胞、M1巨噬細胞、M2巨噬細胞、肥大細胞、自然殺傷（natural killer，NK）細胞和漿細胞（效應(yīng)B細胞）占比較高（圖4A）。AOM/DSS+S.algae組與AOM/DSS組初始B細胞比較差異雖無統(tǒng)計學(xué)意義，但AOM/DSS+S.algae組有增多的趨勢（圖4B）。與AOM/DSS組相比，AOM/DSS+S.algae組效應(yīng)B細胞增多（P < 0.05，圖4C）。與上述GSEA分析中顯示AOM/DSS+S.algae組B細胞增殖較高的結(jié)果一致（圖3B），推測加入S.algae后可能促進了B細胞的增殖。

進一步對免疫微環(huán)境中細胞因子分析，GSEA結(jié)果顯示，與AOM/DSS組相比，AOM/DSS+S.algae

組中促炎細胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IFN和TNF的產(chǎn)生都呈上升趨勢（圖5A、B），而抑炎細胞因子IL-4、IL-10、IL-13和轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）呈現(xiàn)下降趨勢（圖5C）。同時也發(fā)現(xiàn)AOM/DSS+S.algae組中核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）活性上升和NF-κB 誘導(dǎo)激酶（NF-κB-inducing kinase，NIK）及Kappa B 抑制因子激酶（inhibitor of kappa B kinase，IKK）被激活（圖5D），表明加入S.algae

后可能激活了小鼠體內(nèi)NF-κB信號通路。S.algae可能通過細胞因子活化B細胞和激活NF-κB通路，形成促腫瘤免疫微環(huán)境，進而促進結(jié)直腸腺瘤發(fā)生發(fā)展。

3 討 論

CRC的發(fā)病率和病死率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢［16］，一直威脅著人群健康，給社會經(jīng)濟和患者家庭帶來了沉重的負擔［17］。CRC有多種病理類型，其中最常見的為腺癌［18］。CRA是公認的CRC癌前病變，大約85%的CRC是由CRA演變而來的［19］。

因此，深入了解CRA發(fā)生發(fā)展的過程，是實現(xiàn)CRC早期預(yù)防和早期治療中亟待解決的關(guān)鍵問題，具有重要的臨床意義。

人類結(jié)直腸定植了一種由微生物組成的共生群落，估計有1014個細菌，與哺乳動物細胞的總數(shù)近似［20］。一些細菌可能通過產(chǎn)生微生物基因毒素引入致癌突變［21］，而另一些細菌則產(chǎn)生干擾癌細胞核心代謝過程的代謝物［22］。此外，腸道內(nèi)的細菌種類會改變局部和全身的細胞或代謝特征，從而影響治療效果［23］。微生物群對腫瘤發(fā)生的廣泛影響導(dǎo)致其成為癌癥的標志物［24］。通過前期工作，我們發(fā)現(xiàn)與正常結(jié)直腸組織相比，S.algae在CRA中含量升高，S.algae在CRA發(fā)病中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。S.algae是一種革蘭陰性菌，它的致病性現(xiàn)已確定，主要感染于體弱患者，可能與高病死率有關(guān)［25］。在臨床中，S.algae經(jīng)常與腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens， S.putrefaciens）相混淆，但似乎有越來越多的證據(jù)表明，在S.algae和S.putrefaciens之間，S.algae引起的人類疾病最多，此外對小鼠的致病性研究也表明，S.algae似乎是毒性更強的物種［26］。但S.algae一般是個案報道，相關(guān)研究較少，臨床意義及致病機制不太清楚且與結(jié)直腸疾病的關(guān)系仍未知。本研究為探索S.algae對CRA發(fā)生發(fā)展的作用，我們在AOM/DSS組小鼠的基礎(chǔ)上進行S.algae灌胃，結(jié)果顯示與AOM/DSS組相比，AOM/DSS+S.algae組小鼠生存狀態(tài)更差，血便和體質(zhì)量下降都很嚴重，同時，結(jié)直腸長度縮短且顯示出更多更大的腺瘤，因此S.algae加重了疾病，促進了CRA的發(fā)生、發(fā)展。

19世紀中期，Rudolf Virchow首先根據(jù)癌癥起源于慢性炎癥的部位，提出了炎癥和癌癥之間的相關(guān)性［27］。事實上，慢性、失調(diào)、持續(xù)和未解決的炎癥與惡性腫瘤的風險增加以及大多數(shù)類型癌癥的惡性進展相關(guān)［28-29］。從正常結(jié)腸上皮發(fā)展為結(jié)直腸癌需要一系列遺傳和炎癥免疫學(xué)因素來促成和塑造致瘤環(huán)境。結(jié)直腸癌發(fā)生過程中涉及的炎癥特征包括炎癥小體的激活［29］和 NF-κB 通路的激活［30］，這兩者都可以通過對微生物刺激或細胞因子的反應(yīng)而發(fā)生。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)對小鼠進行S.algae干預(yù)后，小鼠體內(nèi)炎癥與免疫反應(yīng)明顯增強，進一步分析發(fā)現(xiàn)AOM/DSS+S.algae組促炎因子IL-1β、IL-6、IL-17和TNF等的水平都呈現(xiàn)出高表達，抑炎細胞因子IL-4、IL-10和TGF-β水平顯示出低表達。同時AOM/DSS+S.algae組中B細胞表現(xiàn)出更高的增殖和浸潤占比。盡管迄今為止的免疫療法研究主要集中在 T 細胞上，但越來越多的證據(jù)表明，腫瘤浸潤性B細胞和漿細胞在腫瘤控制中具有至關(guān)重要的協(xié)同作用，在疾病的診斷和治療中顯示出很強的預(yù)測和預(yù)后意義［31］。此外我們還發(fā)現(xiàn)S.algae干預(yù)后，小鼠體內(nèi)NF-κB通路明顯被激活。NF-κB是一種多效性轉(zhuǎn)錄因子，在先天性和適應(yīng)性免疫中起關(guān)鍵作用，是各種促炎因子表達所必需的［32］。除了在炎癥中的關(guān)鍵功能外，NF-κB激活還可以通過增加細胞增殖和血管生成、抑制細胞死亡以及促進細胞侵襲和轉(zhuǎn)移來支持癌變［33］。Greten等［34］研究表明，阻斷腸上皮細胞中的NF-κB激活可顯著降低CRC的發(fā)生率。結(jié)腸炎期間IL-6和TNF-α等細胞因子的釋放可以促進腫瘤生長，而TGF-β和IL-10等免疫抑制細胞因子的低表達會加劇這一過程。

在健康的結(jié)腸組織中，即使是輕微的炎癥，在結(jié)腸向發(fā)育不良結(jié)腸的轉(zhuǎn)化中也起著重要作用。隨著隱窩的發(fā)育異常，微生物群與固有層免疫細胞之間的屏障被破壞，進而促進細菌移位，最終使免疫原性微生物暴露于上皮細胞和抗原呈遞細胞［35］。細菌刺激激活免疫信號通路導(dǎo)致體內(nèi)平衡喪失，從而驅(qū)動促腫瘤炎癥環(huán)境［36］。綜上所述，在結(jié)直腸腺瘤發(fā)生發(fā)展過程中，S.algae可能通過激活免疫信號（如活化B細胞和激活NF-κB通路），形成促腫瘤免疫微環(huán)境，進而促進結(jié)直腸腺瘤的發(fā)生發(fā)展。

參 考 文 獻

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（責任編輯：楊江瑜）