DOI： 10.13718/j.cnki.xdzk.2024.06.005

張興莉，焦曉丹，于云龍，等．MB-SF/cRGD的合成及其化學(xué)動(dòng)力學(xué)抗腫瘤研究 ［J］．西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2024，46（6）： 51-62．

收稿日期：20240325

基金項(xiàng)目：

重慶市魯渝科技協(xié)作項(xiàng)目（CSTB2023TIAD-LDX0015）； 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32071375）； 重慶市高等教育教學(xué)改革研究項(xiàng)目（223079）； 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2023YFF0713900）； 宜賓市雙城協(xié)議保障科研經(jīng)費(fèi)科技項(xiàng)目（XNDX2022020013）．

作者簡(jiǎn)介：

張興莉，碩士研究生，主要從事納米藥物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究．

通信作者： 薛鵬，博士，副教授．

摘要：

化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療（CDT）具有一定的抗腫瘤效果，但由于腫瘤微環(huán)境（TME）的復(fù)雜性，導(dǎo)致藥物無(wú)法高效積聚到腫瘤部位，從而無(wú)法達(dá)到滿(mǎn)意的治療效果．先通過(guò)水解與提純得到絲素蛋白，再通過(guò)酰胺化反應(yīng)在絲素蛋白表面連接cRGD，最后加入Bi（NO3）·5H2O和MnCl2·4H2O，攪拌過(guò)夜獲得MB-SF/cRGD．設(shè)計(jì)了一種具有主動(dòng)靶向能力的CDT治療體系，旨在通過(guò)提高癌癥細(xì)胞藥物攝取率，加強(qiáng)化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療效果．絲素蛋白作為一種具有良好生物相容性和降解性的藥物載體，可以有效改善藥物遞送系統(tǒng)引起的生物相容性差等問(wèn)題； MnO2利用內(nèi)源性H2O2實(shí)現(xiàn)化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療、消耗GSH以及產(chǎn)生O2，發(fā)揮抗腫瘤療效．此外，在藥物表面修飾cRGD不但可以減少對(duì)正常細(xì)胞的毒性，還可以提高化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療的價(jià)值．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明： 利用MB-SF本身的活性能達(dá)到一定的抗腫瘤療效，在此基礎(chǔ)上，修飾有主動(dòng)靶向癌細(xì)胞的cRGD所獲得的MB-SF/cRGD能達(dá)到更好的腫瘤治療效果．

關(guān)" 鍵" 詞：

化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療； 腫瘤微環(huán)境； 靶向治療； 活性氧

中圖分類(lèi)號(hào)：

R737.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：16739868（2024）06005112

Synthesis of MB-SF/cRGD for Antitumor Chemodynamic Therapy

ZHANG Xingli1， JIAO Xiaodan1， YU Yunlong2，

ZHONG Li3， KANG Yuejun1， XUE Peng1

1. School of Materials and Energy，Southwest University，Chongqing 400715，China；

2. Burns Research Institute，The First Affiliated Hospital of the Army Medical University，Chongqing 400038，China；

3. School of Bioengineering，Chongqing University，Chongqing 400044，China

Abstract：

Chemodynamic therapy （CDT） has shown some therapeutic effects toward tumors，but due to the complexity of the tumor microenvironment （TME），the drugs do not accumulate efficiently at the tumor site，thus failing to achieve a satisfactory therapeutic effect．In this study，silk fibroin was obtained by hydrolysis and purification．Then，cRGD was attached to the surface of the fibroin protein by amidation reaction．Finally，Bi（NO3）·5H2O and MnCl2·4H2O were added and stirred overnight to obtain MB-SF/cRGD．A hybrid system with active targeting ability was designed to enhance the therapeutic effect of CDT by increasing the cellular uptake rate of nanodrug．As drug carriers with good biocompatibility and degradability，silk fibroin can effectively improve the biocompatibility and other safety issues caused by drug delivery system．MnO2 utilizes endogenous H2O2 for triggering CDT，GSH depletion and O2 production to promote antitumor efficacy．In addition，the modified cRGD on the drug surface reduces toxicity to normal cells and increases the efficacy of CDT．Experimental results show that MB-SF alone can achieve a certain level of antitumor effect，but an improved tumor treatment effect can be achieved by MB-SF/cRGD，due to the modified cRGD can actively target the cancer cells．

Key words：

chemodynamic therapy； tumor microenvironment； targeted therapy； reactive oxygen species

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年全球新增1810萬(wàn)癌癥病例，但只有亞洲和非洲的癌癥死亡率（分別為57.3%和7.3%）高于癌癥發(fā)病率（分別為48.4%和5.8%），其中乳腺癌是全球第二大致死癌癥類(lèi)型［1］．納米技術(shù)的快速發(fā)展帶動(dòng)著納米生物技術(shù)的進(jìn)步，其中納米材料的研究領(lǐng)域已擴(kuò)展到農(nóng)業(yè)、能源、醫(yī)療等行業(yè)［2-5］．化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療（Chemodynamic Therapy，CDT）作為近年來(lái)新興的一種“特洛伊木馬”抗腫瘤策略，即鐵、銅、錳和鈷基利用Fenton或類(lèi)Fenton效應(yīng)產(chǎn)生高效率活性氧，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡．MnO2納米粒子本身可以利用類(lèi)Fenton效應(yīng)產(chǎn)生最具毒性的羥基自由基（·OH），但由于腫瘤內(nèi)部H2O2不足等原因，導(dǎo)致CDT對(duì)腫瘤治療效果有限．由于MnO2還能消耗腫瘤細(xì)胞中重要的還原性物質(zhì)谷胱甘肽（GSH），因此大大提高了CDT療效［6-10］，并同時(shí)產(chǎn)生O2緩解腫瘤乏氧微環(huán)境［4］．此外，體系中加入的絲素蛋白作為腫瘤治療的天然藥物遞送載體，具有良好的生物相容性、副作用小以及易于降解等優(yōu)點(diǎn)［11］．

由于納米材料本身能對(duì)腫瘤起到增強(qiáng)的滲透性和滯留性（EPR）效應(yīng)以及易于功能化、高生物相容性等原因，納米藥物成為腫瘤治療的熱議話(huà)題．但是由于單一的納米材料無(wú)法主動(dòng)靶向腫瘤，因此藥物無(wú)法高效積累到腫瘤部位并發(fā)生作用［12-14］．近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)在納米材料表面修飾各種特異性抗體、整合素配體以及肽等，能夠?qū)崿F(xiàn)特異性靶向癌細(xì)胞［15-16］．據(jù)報(bào)道，cRGD能與癌細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)的整合素αVβ3特異性結(jié)合［17］．因此，在MB-SF上修飾cRGD可以有效提高藥物利用率［15］．基于此，本研究構(gòu)建的MB-SF/cRGD化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療體系，在腫瘤治療領(lǐng)域具有一定應(yīng)用潛力．

1" 實(shí)驗(yàn)部分

1.1" 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

儀器： 動(dòng)態(tài)光散射粒度儀（Nano ZS90），透射電子顯微鏡（JEM-2100），紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-2550），多功能酶標(biāo)儀（Tecan Infini Spark-10M），共聚焦激光顯微鏡（Zeiss LSM 800），流式細(xì)胞儀（NovoCyte 2060R），倒置熒光顯微鏡（IX73），X射線(xiàn)光電子能譜儀（ESCALAB 250Xi），傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR Nicolet 6700）．

試劑： Bi（NO3）·5H2O（AR），MnCl2·4H2O（AR），CaCl2（AR），HNO3（AR），NaOH（AR），NHS（AR），EDC（AR）以及乙醇、DMSO等，直接用于實(shí)驗(yàn)．

1.2" MB-SF、MB-SF/cRGD的合成

1.2.1" 絲素蛋白的制備

將蠶繭剪成小塊，在0.5%的Na2CO3溶液中煮沸60 min，之后用大量的去離子水沖洗除去絲膠，并將脫下的脫膠絲素在常溫下干燥．在三元體系中（氯化鈣/乙醇/水）溶解脫膠絲素（0.8%），各組分的摩爾比為1∶2∶8，并將其放在90 ℃恒溫水浴鍋中溶解2 h．趁熱將絲素混合溶液進(jìn)行抽濾除雜，用分子量為3.5 kDa的纖維素半透膜透析3天，獲得絲素蛋白溶液，取部分凍干定量，放入4 ℃冰箱儲(chǔ)存［18］．

1.2.2" SF/cRGD的合成

取50 mg的絲素蛋白溶液，加入NHS和EDC（比例為1∶6∶6）活化1 h，再加入0.2 mg cRGD溶液（1 mg/mL），室溫避光攪拌12 h，即獲得SF/cRGD．

1.2.3" MB-SF和MB-SF/cRGD的合成

先提前將19.4 mg的Bi（NO3）·5H2O溶于2 mL的HNO3溶液中，并將15.76 mg的MnCl2·4H2O溶于2 mL的去離子水中．隨后，將Bi（NO3）·5H2O加入到50 mg的絲素蛋白溶液或SF/cRGD溶液中，并用NaOH調(diào)節(jié)pH值到12，再加入MnCl2·4H2O，置于37 ℃下攪拌12 h，轉(zhuǎn)移至透析袋中透析24 h，得到產(chǎn)物MnO2/Bi2S3-SF以及MnO2/Bi2S3-SF/cRGD（分別簡(jiǎn)寫(xiě)為MB-SF、MB-SF/cRGD），置于4 ℃儲(chǔ)存［19］．

1.3" 材料的表征

用透射電子顯微鏡觀(guān)察MB-SF/cRGD納米材料的形貌．通過(guò)傅里葉變換紅外光譜儀檢測(cè)各樣品的特征峰．通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射粒度儀測(cè)量納米粒子的流體動(dòng)力學(xué)尺寸以及表面電勢(shì)．MB-SF/cRGD的化學(xué)元素以及元素價(jià)態(tài)由X射線(xiàn)光電子能譜儀表征．

1.4" 體外性能分析

亞甲基藍(lán)（MB）被·OH氧化后在655 nm波長(zhǎng)處有特征吸收峰，可用于測(cè)試過(guò)氧化物酶活性．在25 mmol/L NaHCO3緩沖體系中，使用MB（10 μg/mL）探究MB-SF/cRGD在不同體系中產(chǎn)·OH的性能．檢測(cè)MB-SF/cRGD分解H2O2產(chǎn)生O2性能的具體步驟如下： 將MB-SF/cRGD溶解于磷酸鹽緩沖溶液，設(shè)置一系列濃度梯度后，加入10 mmol/L H2O2，使用溶解氧測(cè)定儀檢測(cè)溶液中的氧濃度，利用GSH能與2-硝基苯甲酸（DTNB）反應(yīng)生成黃色GSSG，檢測(cè)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性； 將DTNB溶解在磷酸緩沖溶液（pH=8，EDTA 1 mmol/L）中，終濃度為4 mg/mL； 將MB-SF/cRGD分散在0.2 mg/mL GSH中，隨后加入200 μL DTNB，室溫孵育0～4 h，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量．

1.5" 生物相容性

使用鼠源成纖維細(xì)胞（L929）評(píng)估MB-SF/cRGD對(duì)小鼠正常細(xì)胞的生物相容性．實(shí)驗(yàn)步驟為： 將L929細(xì)胞以1×104每孔接種到96孔板中（37 ℃，12 h）； 隨后使用不同濃度MB-SF/cRGD與細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3遍； 接著每孔加入200 μL MTT（0.5 mg/mL）培養(yǎng)4 h，棄去上清液，加入200 μL DMSO，震蕩15 min使紫色甲臜完全溶解； 最后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔在490和630 nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD值）．按照式（1）計(jì)算每孔細(xì)胞存活率：

細(xì)胞存活率（%）=（OD490-OD630）加藥處理組細(xì)胞/（OD490-OD630）未加藥處理組細(xì)胞 （1）

溶血率實(shí)驗(yàn)是先取BALB/c雌鼠眼眶血，使用PBS離心洗滌3遍（3 000 rpm，5 min）．然后，將紅細(xì)胞按4%（v/v）的比例與一系列濃度梯度的MB-SF/cRGD（PBS體系）混合．同時(shí)，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組，將去離子水與紅細(xì)胞混合．在37 ℃條件下反應(yīng)6 h后，10 000 rpm離心10 min，取上清液在酶標(biāo)儀上檢測(cè)570 nm處的吸光度．然后根據(jù)式（2）計(jì)算小鼠細(xì)胞溶血率：

溶血率（%）=［（OD樣品-OD陰性）/（OD陽(yáng)性-OD陰性）］×100%（2）

1.6" 體外細(xì)胞毒性

使用小鼠乳腺癌腫瘤細(xì)胞（4T1）評(píng)估MB-SF/cRGD對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性．將4T1癌細(xì)胞以1×104個(gè)細(xì)胞每孔接種到96孔板中（37 ℃，12 h），然后用不同濃度MB-SF/cRGD與細(xì)胞分別共培養(yǎng)24，48，72 h，后續(xù)按照MTT法測(cè)量細(xì)胞活力．

1.7" 細(xì)胞攝取

為了分析cRGD對(duì)腫瘤細(xì)胞攝取的影響，使用二氫卟吩e6（Ce6）作為熒光標(biāo)志物修飾納米粒子．具體操作如下： 先將30 mg EDC和20 mg NHS溶解于MB-SF或MB-SF/cRGD的水溶液體系中（1 mg/mL），并在攪拌狀態(tài)下進(jìn)行30 min的羧基自由基活化； 使用去離子水離心洗滌3遍后，將沉淀物與Ce6（1 mg/mL）混合，室溫避光攪拌24 h； 最后通過(guò)離心洗滌獲得與Ce6共價(jià)連接的MB-SF和MB-SF/cRGD，并使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)癌細(xì)胞對(duì)其的吞噬效果．

將4T1細(xì)胞接種到12孔板（5×104個(gè)細(xì)胞/孔）中，在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h．使用濃度為100 μg/mL的MB-SF、MB-SF/cRGD的培養(yǎng)液與不同孔細(xì)胞分別共培養(yǎng)0～6 h．然后使用含0.25% EDTA的胰蛋白酶消化，PBS清洗后，重懸于含有Ca2+、Mg2+的PBS中，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度分析．

1.8" 產(chǎn)活性氧能力和GSH消耗能力

為了檢測(cè)MB-SF/cRGD在癌細(xì)胞中產(chǎn)活性氧性能，將4T1癌細(xì)胞接種到12孔板（1×105個(gè)細(xì)胞/孔）中培養(yǎng)過(guò)夜，加入濃度均為100 μg/mL的MB-SF、MB-SF/cRGD材料，共培養(yǎng)8 h，空白對(duì)照組加入等體積PBS．共培養(yǎng)結(jié)束后使用PBS洗滌3遍，與DCFH-DA（10 μM）處理30 min，再用PBS洗滌3遍，用DAPI染色10 min，進(jìn)行共聚焦拍照．

為檢測(cè)細(xì)胞水平MB-SF/cRGD對(duì)谷胱甘肽的消耗能力，將4T1細(xì)胞與MB-SF、MB/cRGD在96孔板（1×104細(xì)胞/孔）中共培養(yǎng)8 h，然后加入50 μL提前預(yù)冷的6.5% TCA，在4 ℃條件下裂解細(xì)胞30 min，隨后加入250 μL的DTNB（4 mg/mL），避光震蕩5 min，最后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)412 nm波長(zhǎng)處的吸光度．

1.9" ICD生物標(biāo)志物檢測(cè)

為進(jìn)一步研究MB-SF/cRGD的抗腫瘤效果，通過(guò)免疫熒光評(píng)估ICD生物標(biāo)志物CRT和HMGB1．具體步驟如下： 將12孔板（3×105個(gè)細(xì)胞/孔）中的4T1細(xì)胞在37 ℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜，后續(xù)步驟與檢測(cè)活性氧的處理步驟相似； 然后使用多聚甲醛（4%）固定細(xì)胞15 min，再加入Triton X-100（0.1%）孵育15 min，使用BSA（1%）進(jìn)行封閉1 h； 隨后使用CRT（2 μg/mL）或HMGB1（2 μg/mL）一抗與處理過(guò)的細(xì)胞孵育過(guò)夜（4 ℃），然后繼續(xù)在4 ℃條件下用攜帶有Cy3或FITC（2 μg/mL）的二抗孵育4 h； 經(jīng)DAPI染色10 min后，使用共聚焦顯微鏡分析不同組間熒光差異．

另一方面，通過(guò)ATP試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP釋放情況，將處理后的懸浮細(xì)胞（與GSH消耗能力實(shí)驗(yàn)處理相似）使用ATP裂解液在冰上裂解1 h，然后在4 ℃條件下12 000 rpm離心10 min，取上清，并按照說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)ATP含量．

1.10" 活/死細(xì)胞染色

為了直觀(guān)觀(guān)察MB-SF/cRGD對(duì)癌細(xì)胞的殺傷效果，將4T1細(xì)胞接種到12孔板（2×105個(gè)細(xì)胞/孔）中培養(yǎng)12 h后，分別加入等體積PBS、MB-SF、MB-SF/cRGD共培養(yǎng)．隨時(shí)觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞變?yōu)閳A形且大小均一時(shí)，按照Calcein AM/PI試劑盒步驟對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色．清洗過(guò)后使用倒置熒光顯微鏡拍照．

1.11" 建立4T1皮下瘤模型

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程均通過(guò)西南大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)，并遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通用要求》（GB/T 35823-2018）．購(gòu)買(mǎi)4周齡小鼠，飼養(yǎng)1周后，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期的4T1細(xì)胞注射進(jìn)入雌性BALB/c小鼠右側(cè)后背皮下，等待1周左右，腫瘤體積達(dá)到200 mm3左右，成功構(gòu)建實(shí)體瘤模型．根據(jù)下式計(jì)算腫瘤體積：

V=0.5×l×w2（3）

式中： V為腫瘤體積； l為腫瘤最長(zhǎng)直徑； w為腫瘤最短直徑．

1.12" 體內(nèi)抗腫瘤

在動(dòng)物水平上研究MB-SF/cRGD對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用．將小鼠分為生理鹽水、MB-SF、MB-SF/cRGD 3組，在第0、5 d分別靜脈注射生理鹽水100 μL，MB-SF、MB-SF/cRGD組按照濃度為5 mg/kg注射100 μL到小鼠體內(nèi)，每?jī)商鞙y(cè)量一次腫瘤體積．到第14 d時(shí)，將所有老鼠進(jìn)行安樂(lè)死處理．取小鼠實(shí)體腫瘤稱(chēng)重，并將腫瘤用于Hamp;E染色，Ki67、CRT、HMGB1免疫組化染色以及TUNEL、CD8+免疫熒光染色等組織學(xué)病理分析．根據(jù)腫瘤生長(zhǎng)抑制率（TGI）計(jì)算腫瘤抑制生長(zhǎng)程度：

RTGI=（VC-VT）/VC×100%（4）

式中： RTGI為腫瘤抑制生長(zhǎng)程度； VC為注射生理鹽水組小鼠的腫瘤體積； VT為不同藥物處理組的腫瘤體積．

2" 結(jié)果與討論

2.1" 形貌、物相和元素分析

圖1a是合成MB-SF/cRGD納米粒子透射電子顯微鏡（TEM）圖片，由此可以看出由三步合成的MB-SF/cRGD呈現(xiàn)出不規(guī)則形狀且粒徑小于200 nm．圖1b是各樣品的傅里葉變換紅外光譜圖，MB-SF/cRGD具有酰胺V帶（N-H，665 cm-1）、酰胺III帶（C-H，1 228 cm-1）以及酰胺Ⅰ帶（C=O，1 640 cm-1），與絲素蛋白（SF）的特征峰完全符合，證實(shí)了MB-SF/cRGD中包含有絲素蛋白［20-21］．

圖2a、2b分別是MB-SF與MB-SF/cRGD納米粒子在純水中的流體動(dòng)力學(xué)粒徑圖以及電位圖，MB-SF修飾cRGD后，MB-SF/cRGD的流體動(dòng)力學(xué)直徑比MB-SF增大約20 nm．由圖2b可以看出，MB-SF修飾cRGD后電位從-13.4 mV變?yōu)?5.6 mV．以上結(jié)果均說(shuō)明了cRGD成功共價(jià)連接在MB-SF表面從而改變納米材料粒徑大小以及電位．

圖3是MB-SF/cRGD的X射線(xiàn)光電子能譜圖（XPS）．圖3a是Bi 4f的核心級(jí)XPS能譜圖，164.8 eV和159.4 eV結(jié)合能分別對(duì)應(yīng)Bi 4f5/2和Bi 4f7/2，與其相對(duì)應(yīng)的是Bi3+［22］．圖3b是Mn 2P的核心級(jí)XPS能譜圖，641.8 eV和653.3 eV結(jié)合能分別對(duì)應(yīng)Mn 2p3/2與Mn 2p1/2，與其相對(duì)應(yīng)的是Mn2+/Mn3+［23-24］．全范圍的XPS能譜圖證實(shí)了MB-SF/cRGD由Mn、Bi、C、S、O、N和O元素組成（圖3c）．上述數(shù)據(jù)證明了Bi2S3/MnO2-SF/cRGD納米材料成功合成．

2.2" 性能分析

根據(jù)上述數(shù)據(jù)表明MB-SF/cRGD納米藥物中MnO2具有+2和+3價(jià)，因此MB-SF/cRGD具有多種酶活性，包括CAT、POD．這對(duì)O2和·OH的產(chǎn)生、GSH的消耗至關(guān)重要．在富含HCO-3的情況下，Mn2+能夠發(fā)揮類(lèi)Fenton效應(yīng)，發(fā)生MnO2+HCO-3+H2O2→·OH+H2O反應(yīng)，從而分解內(nèi)源性H2O2產(chǎn)生·OH［23］．因此，在探究MB-SF/cRGD產(chǎn)ROS的性能實(shí)驗(yàn)中采用25 mmol/L NaHCO3緩沖液體系．首先，為探究MB-SF/cRGD在不同環(huán)境中產(chǎn)活性氧的效率，按Control、H2O2、MB-SF/cRGD、MB-SF/cRGD+GSH、MB-SF/cRGD+GSH+H2O2、MB-SF/cRGD+H2O2分組，其中MB-SF/cRGD質(zhì)量濃度為200 μg/mL，使用MB試劑檢測(cè)·OH產(chǎn)生情況，可以明顯看到MB-SF/cRGD+H2O2組活性氧產(chǎn)率最高，Control、H2O2、MB-SF/cRGD、MB-SF/cRGD+GSH組幾乎沒(méi)有產(chǎn)生活性氧，MB-SF/cRGD+GSH+H2O2組由于GSH的存在產(chǎn)活性氧效率大大降低（圖4a）．然后為探究不同質(zhì)量濃度MB-SF/cRGD產(chǎn)O2的效率，配置了0、50、100、150、200 μg/mL的MB-SF/cRGD溶液，并在室溫條件下檢測(cè)溶解氧產(chǎn)率與時(shí)間的關(guān)系．由圖4b可以看出，溶解氧產(chǎn)率隨著MB-SF/cRGD濃度增大而升高．此外，MB-SF/cRGD在腫瘤微環(huán)境中還會(huì)發(fā)生2GSH+MnO2+2H+→GSSG+Mn2++2H2O反應(yīng)．因此，使用DTNB試劑檢測(cè)MB-SF/cRGD與還原性谷胱甘肽分別孵育0，0.5，1，2，4 h后，在412 nm波長(zhǎng)處的吸光度．由圖4c可以看出，MB-SF/cRGD隨時(shí)間增加消耗越來(lái)越多的GSH，證明了MB-SF/cRGD具有類(lèi)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性，可以消耗內(nèi)源性GSH．

2.3" 細(xì)胞水平抗腫瘤性能分析

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本研究所構(gòu)建的MB-SF/cRGD體系具有良好的活性氧生成能力、產(chǎn)生氧氣的能力以及消耗GSH能力．于是進(jìn)一步對(duì)MB-SF/cRGD的生物應(yīng)用展開(kāi)研究．首先，為了確保MB-SF/cRGD在生物應(yīng)用時(shí)的安全性，進(jìn)行了生物相容性實(shí)驗(yàn)．分別將0，12.5，25，50，100，200 μg/mL質(zhì)量濃度的MB-SF/cRGD與L929細(xì)胞共培養(yǎng)24 h．當(dāng)藥物濃度達(dá)到200 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率仍然高達(dá)70%以上，根據(jù)此數(shù)據(jù)可以推出MB-SF/cRGD具備良好的生物相容性（圖5a）．相比之下，在相同藥物劑量以及時(shí)間處理下，小鼠乳腺癌細(xì)胞（4T1）活力大大降低．當(dāng)濃度為200 μg/mL，處理時(shí)間為72 h時(shí)，大量腫瘤細(xì)胞被殺死，存活率僅24.3%（圖5b）．這種特異性抗腫瘤特性可能是由于cRGD介導(dǎo)的主動(dòng)靶向腫瘤以及Mn2+/Mn3+對(duì)腫瘤內(nèi)部高H2O2水平引發(fā)的CDT效應(yīng)等原因［25-26］．

緊接著分別將連接有Ce6的MB-SF和MB-SF/cRGD與4T1細(xì)胞按0，0.5，1，2，4，6 h共培養(yǎng)后，再使用流式細(xì)胞儀取樣分析．從圖6a、6b可以看出，MB-SF/cRGD-Ce6在與細(xì)胞共培養(yǎng)0.5 h時(shí)，幾乎所有細(xì)胞都已成功吞噬納米材料，而MB-SF-Ce6還有一部分細(xì)胞未吞噬材料．由此成功證明了cRGD主動(dòng)靶向腫瘤細(xì)胞的特性增強(qiáng)了4T1細(xì)胞對(duì)MB-SF/cRGD納米材料的吞噬效果，并由此推斷較強(qiáng)的吞噬效果有利于提高藥物對(duì)腫瘤的治療效果［27］．

為驗(yàn)證這個(gè)推論，實(shí)驗(yàn)分為Control、MB-SF、MB-SF/cRGD 3組進(jìn)行研究．從圖7a、7b可以看出，修飾了cRGD的MB-SF/cRGD比MB-SF產(chǎn)生更多的ROS，消耗了細(xì)胞內(nèi)更多GSH．證明了cRGD增強(qiáng)了4T1細(xì)胞對(duì)納米材料的吞噬，從而提高了產(chǎn)活性氧效率以及消耗谷胱甘肽的能力．因此，在這一研究基礎(chǔ)上，推斷MB-SF/cRGD與MB-SF相比，MB-SF/cRGD對(duì)腫瘤治療效果有著顯著的提升（*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）．

據(jù)報(bào)道，腫瘤細(xì)胞在受到藥物刺激時(shí)，會(huì)引發(fā)免疫原性細(xì)胞死亡（ICD）．在免疫原性細(xì)胞死亡過(guò)程中，會(huì)有一系列損傷相關(guān)分子（DAMPs）發(fā)生變化．鈣網(wǎng)蛋白（CRT）從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)遷移到細(xì)胞表面，釋放“eat”信號(hào)，被免疫細(xì)胞識(shí)別進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞．高遷移率族蛋白B1（HMGB1）從細(xì)胞核易位到細(xì)胞質(zhì)，起到促進(jìn)免疫細(xì)胞成熟的功效．三磷酸腺苷（ATP）從細(xì)胞中釋放出來(lái)．圖8a可以明顯看到MB-SF/cRGD導(dǎo)致4T1細(xì)胞中大量CRT釋放出來(lái)．MB-SF/cRGD組比MB-SF組也發(fā)生了更顯著的HMGB1易位（圖8b）．圖8c表明經(jīng)過(guò)MB-SF/cRGD藥物處理后，細(xì)胞內(nèi)ATP含量較少，表明細(xì)胞中更多的ATP釋放出去．上述數(shù)據(jù)均表明4T1細(xì)胞在MB-SF/cRGD藥物刺激下，激發(fā)了比MB-SF組更強(qiáng)的免疫原性細(xì)胞死亡（*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）［28］．

為了更直觀(guān)地觀(guān)察細(xì)胞水平抗腫瘤效果，使用鈣黃綠素乙酰甲酯對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色（綠色），使用碘化丙啶對(duì)死細(xì)胞進(jìn)行染色（紅色），用熒光顯微鏡記錄并觀(guān)察樣品，結(jié)果如圖9所示．

圖9可以直觀(guān)地看到，MB-SF/cRGD藥物處理組的紅色熒光數(shù)量最多，同時(shí)綠色熒光也是最少的．表明MB-SF/cRGD殺死癌細(xì)胞數(shù)量最多，MB-SF效果次之．該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述活性氧、胞內(nèi)谷胱甘肽以及ICD生物標(biāo)志物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致．以上數(shù)據(jù)表明所構(gòu)建的MB-SF/cRGD體系因?yàn)閏RGD的存在，在細(xì)胞水平高效發(fā)揮化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療療效，提高了細(xì)胞水平腫瘤治療效果．

2.4" 動(dòng)物水平抗癌性能分析

在動(dòng)物水平探究了MB-SF/cRGD對(duì)小鼠血液的生物相容性．將0、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL濃度梯度的MB-SF/cRGD與紅細(xì)胞共培養(yǎng)．根據(jù)比濁法測(cè)定的結(jié)果顯示，MB-SF/cRGD濃度為200 μg/mL時(shí)，溶血率為1.45%，遠(yuǎn)小于5%，這表明MB-SF/cRGD對(duì)小鼠血液也具有良好的生物相容性（圖10）．

為進(jìn)一步驗(yàn)證MB-SF/cRGD藥物的抗腫瘤性能，在動(dòng)物水平上作進(jìn)一步的研究．在2周的治療時(shí)間里記錄小鼠腫瘤體積變化以及治療結(jié)束后離體腫瘤重量．圖11a可以看出MB-SF/cRGD組腫瘤不僅與生理鹽水組形成鮮明對(duì)比，與MB-SF治療組也形成顯著差異．此外，與生理鹽水組和MB-SF組相比，在腫瘤體積方面MB-SF/cRGD起到了較強(qiáng)的腫瘤治療效果．根據(jù)式（4）計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率（TGI），到第14 d時(shí)MB-SF/cRGD藥物處理組TGI指數(shù)高達(dá)90.9%（圖11b）（*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）．

將小鼠實(shí)體瘤用于Hamp;E、TUNEL、Ki67、CRT、HMGB1、CD8+染色并進(jìn)行組織學(xué)分析（圖12）．在Hamp;E切片中，MB-SF/cRGD藥物處理組切片表現(xiàn)出最嚴(yán)重的組織損傷，表現(xiàn)為嚴(yán)重的核破裂、核溶解．在TUNEL以及Ki67切片中，MB-SF/cRGD藥物處理組分別表現(xiàn)出高水平的綠色熒光凋亡信號(hào)和陽(yáng)性細(xì)胞的顯著減少，證明了MB-SF/cRGD抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的能力顯著提升．此外，在動(dòng)物水平上也激發(fā)了強(qiáng)烈的免疫原性細(xì)胞死亡（ICD），CRT和HMGB1切片數(shù)據(jù)分別表明MB-SF/cRGD藥物處理組可以引發(fā)顯著的CRT暴露、HMGB1易位［29］．CD8+細(xì)胞作為免疫的主力軍，發(fā)揮了重要作用．從CD8+免疫熒光切片可以看出，MB-SF/cRGD藥物處理組CD8+免疫細(xì)胞表達(dá)更多，說(shuō)明修飾了cRGD能有效激發(fā)免疫應(yīng)答，進(jìn)行高效腫瘤治療［30］．

3" 結(jié)論

本研究構(gòu)建的MB-SF/cRGD納米材料分別在細(xì)胞以及動(dòng)物水平上進(jìn)行腫瘤治療性能研究，并且從多角度證明MB-SF/cRGD與MB-SF相比抗腫瘤效果更加顯著．由于MB-SF/cRGD修飾有cRGD，因此賦予了該材料主動(dòng)靶向癌細(xì)胞的功能，實(shí)現(xiàn)了高效的ROS產(chǎn)率以及GSH消耗能力，從而擊潰腫瘤細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)．同時(shí)消耗內(nèi)源性H2O2產(chǎn)生O2，緩解了內(nèi)部乏氧．當(dāng)材料濃度僅為200 μg/mL時(shí)，腫瘤細(xì)胞死亡率高達(dá)75.7%．在動(dòng)物水平，MB-SF/cRGD濃度僅為5 mg/kg時(shí)，腫瘤抑制率達(dá)到90.9%．此外，MB-SF/cRGD復(fù)合體系中還含有Bi2S3，Bi2S3由于具有1.33 eV帶隙寬度，成為一種優(yōu)良的光熱劑，可用于抗腫瘤光熱治療．但在本文中并未對(duì)Bi2S3功能開(kāi)展進(jìn)一步的探究，在未來(lái)的研究中會(huì)深入探索．總之，本文報(bào)道的MB-SF/cRGD體系能夠通過(guò)主動(dòng)靶向癌細(xì)胞實(shí)現(xiàn)高效的化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療，在腫瘤治療領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛力．

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責(zé)任編輯" 湯振金"

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