董梓慧 馬青

摘 要 為了研究海藻酸寡糖對黃瓜灰霉病的防治效果及誘導抗病機理，以黃瓜感病品種3葉期植株為試材，通過盆栽試驗、酶活測定法和實時熒光定量，測定接菌后0～48 h內，黃瓜葉片的防御相關酶活性[超氧化物歧化酶（SOD）活性、氧化氫酶（CAT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性、氧化物酶（POD）活性]和信號轉導途徑關鍵基因表達量（茉莉酸途徑關鍵基因? JAR1和? EIN2；水楊酸途徑關鍵基因? NPR1和? PR1）。結果表明：①海藻酸寡糖的最佳誘導濃度為50 mg/L，誘導時間為3 d，防效可達66.75%；②防御相關酶的活性均顯著提高；③水楊酸途徑關鍵基因? NPR1和? PR1相對表達量均上調。可見海藻酸寡糖通過激發(fā)水楊酸信號轉導，提高植株體內防御相關酶活，增加植株抗病性。

關鍵詞 海藻酸寡糖；誘導抗病性；信號轉導途徑；防御相關酶活

灰霉病是設施黃瓜的重要病害，也是世界性重要病害。黃瓜灰霉病具有流行性強，再侵染頻率高等特點。全國各地受到不同程度的危害，一般年份可減產10%～20%，嚴重時損失可達50%[1]，可危害黃瓜的莖、葉、花和果實，嚴重影響黃瓜的產量和品質，造成巨大的經濟損失。黃瓜灰霉病是典型低溫高濕性病害，病害發(fā)生的最適條件為外界環(huán)境溫度為20 ℃，濕度大于90%[2]。

目前，黃瓜灰霉病的防治主要依靠化學藥劑，雖然能快速有效地達到防治病害目的，但是隨著化學農藥長期大量使用，易使病原菌產生耐藥性，造成病害再猖獗，污染農產品及環(huán)境殘毒超標等一系列問題。而生物制劑具有保護生態(tài)平衡、不易產生抗性、安全天然和易分解等優(yōu)點，是理想的化學藥劑替代品[3-4]。

因此，篩選出具有良好誘導防效的生物制劑是目前替代化學農藥，防治病害大發(fā)生，保證可持續(xù)發(fā)展的有效措施。海藻酸寡糖具有較好的水溶性、吸收性和激發(fā)子活性和較強的應用潛力，能夠克服化學防治帶來的副作用，如劉同梅[5]在研究中發(fā)現用50 mg/L海藻酸寡糖處理煙草感病品種，處理組防御相關酶活顯著提升，水楊酸途徑關鍵基因過表達，水楊酸含量增加，煙草的誘導抗病性顯著提升[5]；在干旱脅迫下，用海藻酸寡糖處理青菜，發(fā)現其體內的脯氨酸和丙二醛含量顯著增加，抗氧化酶活性顯著增強[6]；但其在誘導黃瓜抗灰霉病方面罕見報道。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病原菌：黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）由西北農林科技大學植物病害綜合治理實驗室? 提供。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、羧甲基纖維素培養(yǎng)基（CMC）供試品種：選用‘中農6號，種子在無菌水中? 3～4 d，選取發(fā)芽一致的種子播種于大小一致的花盆中，待長出3片真葉時進行試驗。

供試藥劑：海藻酸寡糖由大連化工研究所提供，用無菌水配制成母液，稀釋成不同濃度目標? 試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 海藻酸寡糖盆栽試驗 確定最適誘導濃度試驗：選取生長良好、長勢一致3葉期的黃瓜植株，稱取供試誘導劑用無菌水配成25 mg/L母液，再將母液按比例配制成目標濃度，將藥液噴施于植株第2片真葉葉部表面，直至葉片完全濕潤，自然晾干。以清水為空白對照。待處理1 d后，接種位置如圖1所示，在黃瓜植株第1片真葉、第2片真葉和第3片真葉上，分別接種2～3個灰霉菌菌餅，23 ℃、95%濕度條件下培養(yǎng)3 d后測量病斑直徑，計算病斑面積和誘導防效。每個處理10個植株，3次生物學重復[7-8]。

確定最佳誘導時間：選取生長良好、長勢一致的3葉期的黃瓜植株，用最適誘導濃度的供試誘導劑噴施于植株第2片真葉葉部表面，直至葉片完全濕潤，自然晾干。以無菌水為空白對照。待處理不同時間后，在黃瓜植株第1片真葉、第2片真葉和第3片真葉上，分別接種2～3個灰霉菌菌餅，23 ℃、90%濕度條件下培養(yǎng)，3 d后測量第1片真葉、第2片真葉和第3片真葉的病斑直徑，計算病斑面積和防治效果。每個處理10個植株，? 3次生物學重復。

1.2.2 測定防御酶活性 植株的處理：選取長勢一致的3葉期黃瓜植株，將海藻酸寡糖（50?? mg/L）噴施于黃瓜第2片真葉，直至葉片完全濕潤，自然晾干。以無菌水為空白對照。待處理3 d后，在黃瓜植株第1片真葉、第2片真葉和第3片真葉上，分別接種2～3個灰霉菌菌餅，23 ℃、95%濕度條件下培養(yǎng)，采集接菌后0 h、6 h、12 h、24 h和48 h的植株葉片，葉片采集后立即用錫箔紙包被，置于液氮中迅速冷凍，保存于-80 ℃冰箱。采用鄰苯三酚法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性、紫外線吸收法測定氧化氫酶（CAT）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性、比色法測定氧化物酶（POD）活性。

1.2.3 抗病相關基因的實時定量分析 試驗參照“1.2.2”中采樣方法，采用Trizol法提取黃瓜葉片總RNA，使用TaKaRa的Prime Script TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit，對RNA進行反轉錄，將待測cDNA置于-20 ℃保存。從葫蘆科作物基因組數據庫里獲得病程相關蛋白（Pathogenesis related protein，PR蛋白）基因和信號轉導途徑相關基因的完整mRNA序列，利用軟件Primer premier 5.0設計用于qRT-PCR的引物。引物長度為15～30 bp，獲得產物長度為80～200 bp，由上海生工合成。以待測cDNA為模板，采用20? μL體系，三步法，以黃瓜actin為內參基因進行實時熒光定量PCR。加樣過程需在冰上進行。每個樣品設置3個生物學重復。

1.3 數據分析

用Excel 2019處理數據，利用2-ΔΔt的計算方法，IBM SPSS Statistics軟件進行差異性分析，Graph Pad Prism 8作圖。

2 結果與分析

2.1 海藻酸寡糖的最適誘導濃度

經不同濃度海藻酸寡糖處理植株第2片真葉24 h后，接種病原菌。結果如表1所示，處理組的病斑面積與對照組具有顯著差異。說明海藻酸寡糖能夠誘導黃瓜激活抗病系統。但海藻酸寡糖是否能夠激活黃瓜系統誘導抗病性，還需進一步證明。如表2所示，在同一植株上，未經海藻酸寡糖處理的第1片真葉和第2片真葉，接種病原菌后，處理組的病斑面積與對照組亦具有顯著差異，說明海藻酸寡糖能夠激活黃瓜系統誘導抗病性。且表1和表2結果表明，濃度為50 mg/L時的防治效果好，說明海藻酸寡糖的最適誘導濃度為50 mg/L。

2.2 海藻酸寡糖最佳誘導時間

誘導劑作用方式與化學農藥不同，具有遲滯性，即植物經誘導劑刺激后產生免疫應答需要一定的時間，不同植物面對不同誘導物所產生免疫應答所需時間不同。因此，在確定誘導劑最適誘導濃度的基礎上，設置時間梯度，確定最佳誘導時間。經50 mg/L海藻酸寡糖處理1～5 d后，接種病原菌，結果如表3和表4所示：植株的第2片真葉經海藻酸寡糖處理3 d后，其誘導防效最高，可達66.75%。同時與其同一植株上未經處理的第1、第3片真葉的誘導防效也在同一誘導時間內最高，分別達21.67%和44.48%。說明在該誘導時間下，海藻酸寡糖的系統抗病作用最好。

2.3 海藻酸寡糖誘導抗病性機理的研究

對PAL活性的影響：在接菌后，經誘導劑處理的第2片真葉的PAL活性如圖2-A所示，其葉內的PAL活性在接菌6 h時達到峰值，為240.51 U/（g·h），與對照組有顯著差異。與其同一植株上未經誘導劑處理的第1、3片真葉中PAL活性如圖2-B和2-C所示，PAL活性均在接菌6 h達到峰值，分別為172.35 U/（g·h）、225.68?? U/（g·h），說明植株體內的PAL經海藻酸寡糖誘導后活性增強。

對CAT活性的影響：同一植株上處理葉與未處理葉中的CAT活性如圖3-A所示，在接菌后6 h，處理組第2片真葉的CAT活性達到峰值，為12.50 U/（g·h），與對照組之間有顯著差異。同時，未處理葉中CAT活性如圖3-B和3-C所示，第1、第3片真葉的CAT活性分別在接菌后12 h、6 h時，達到峰值，分別為7.64 U/（g·h）和10.29 U/（g·h），與對照組之間有顯著差異。說明植株體內的CAT經海藻酸寡糖誘導后活性增強。

對SOD活性的影響：接種后植株內SOD活性隨時間變化如圖4-A、4-B、4-C所示，其中處理葉第2片真葉SOD活性在接菌后12 h達到峰值，為100.34 U/（g·h）。而未處理葉第1、第3片真葉SOD活性分別在12 h、24 h達到峰值，分別為89.95 U/（g·h）和92.24 U/（g·h）。說明植株體內的SOD經海藻酸寡糖誘導后活性增強。

對POD活性的影響：根據標準曲線y=? 0.031 4x-0.029 1，R2=0.999 3，測得POD酶活性如圖5所示，植株處理葉第2片真葉與未處理葉第1、第3片真葉，同時在接種24 h后POD活性達到峰值，分別為17.94 U/（g·min）、14.04 U/（g·min）和17 U/（g·min）。其中未處理葉第1片真葉POD活性與對照組沒有顯著差異，這與植物級性運輸有關，說明海藻酸寡糖是能夠通過局部誘導，激發(fā)黃瓜整體的POD活性，但位于處理葉下部葉片的系統誘導抗病性低于上部葉片。

2.4 對相關防衛(wèi)基因表達量的影響

測定海藻酸寡糖處理組處理葉（第2片真葉）和未處理葉（第1片和第3片真葉）的PR1、NPR1在接菌后不同時間點的相對表達量，結果如圖6、圖7所示，處理組3片真葉的PR1、NPR1相對表達量均上調，分別在接菌后12 h、24 h達到峰值，說明植株體內的水楊酸途徑被? 激活。

JAR1和? EIN2在不同時間點的相對表達量結果如圖8、圖9所示，處理組3片真葉的? JAR1和? EIN2相對表達量均下調，說明茉莉酸途徑未被激活。

3 討? 論

牛紅艷等[9]研究發(fā)現，海藻酸鈉的降解產物海藻酸寡糖具有較高的水溶性高，強吸收性和較高的激發(fā)子活性；江琳琳等[10]研究表明，海藻酸寡糖可以能夠激發(fā)大豆子葉產生植保素，對水稻植物細胞同樣具有激發(fā)子活性；張運紅等[11]已證明，噴施海藻寡糖可以緩解干旱脅迫對小麥發(fā)育的抑制作用，苗長、根長、生物量等增加，并且丙二醛、脯氨酸含量下降，葉綠素、部分抗氧化酶活力升高。但其在防治黃瓜灰霉病方面存在罕見? 報道。

本次試驗旨在為海藻酸寡糖在黃瓜灰霉病防治方面提供理論支持，通過盆栽試驗、抑菌試驗、防御相關酶活測定和相關防衛(wèi)基因表達量測定，探究海藻酸寡糖的誘導抗病效果和系統誘導抗病機理。

有研究表明：誘導劑作用方式與化學農藥不同，具有遲滯性，即植物經誘導劑刺激后產生免疫應答需要一定的時間，不同植物面對不同誘導物所產生免疫應答所需時間不同，如水楊酸和茉莉酸甲酯處理甜瓜2～5 d后，其對枯萎病的防治效果最好[12]。本試驗結果表明，海藻酸寡糖也具有遲滯性，在處理黃瓜3 d后藥效最好。

防御酶與植物抗性有著很大關系，它們參與活性氧清除、酚類、木質素和植保素等抗病相關物質的合成，能抵御活性氧及氧自由基對細胞膜系統的傷害，使植物抵抗病害的能力增強。當防御酶活性顯著提高，說明黃瓜抗病性增強[13-16]。測定酶活性試驗表明，植株部分葉片經誘導劑處理后，整株葉片的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性均顯著提升，說明海藻酸寡糖可以通過局部誘導激發(fā)黃瓜整體的防御酶活性，增強抗病性。

植物在識別植物誘導劑后，會啟動不同的信號轉導途徑。在整個植物抗病信號轉導過程中，主要由兩條不同的信號轉導途徑發(fā)揮作用，一條是水楊酸途徑；另一條是茉莉酸/乙烯途徑[17]。根據研究，這兩條信號轉導途徑既存在拮抗關系，激活其中一個信號通路的同時，必然會影響另外一個途徑介導的對病原菌的抗性[18]，如劉同梅[5]在研究中發(fā)現，經海藻酸寡糖處理的煙草，在接種TMV后，其體內的水楊酸途徑關鍵基因和水楊酸含量顯著上升，但茉莉酸含量無明顯變化；也存在同時發(fā)揮作用的情況[19]，如Feys等[20]研究報道，擬南芥根際細菌可以同時激發(fā)植物的水楊酸途徑和茉莉酸/乙烯途徑，從而提高番茄對丁香假單胞菌的抗性。本試驗利用qRT-PCR技術，測定信號轉導途徑關鍵基因表達量。結果表明，海藻酸寡糖處理組葉內的茉莉酸途徑關鍵基因? JAR1和? EIN2表達量均下調；水楊酸途徑關鍵基因? NPR1和 PR1表達量均上調，說明海藻酸寡糖通過激活水楊酸途徑，提高黃瓜抗性。

為更加接近實際農藥噴灑活動，整體試驗更具有說服力和可操作性，在本試驗中采用3片真葉期的黃瓜做為供試植株，僅用誘導劑處理中部葉片，測定整株葉片的防治效果、抗病相關酶活和基因表達量，探究海藻酸寡糖的生產實踐價值。試驗結果表明，海藻酸寡糖比市面上應用較為廣泛的殼寡糖的誘導抗病效果更好，并且其抗病機理是通過激活水楊酸信號轉導途徑，進而激發(fā)植株體內相關防御酶活性，來抑制病原菌在植株細胞中的增殖。

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Effciency? of Alginate Oligosaccharides on Induced Resistance against

Botrytis cinerea? in Cucumber and Their Mechanisms

DONG Zihui1，2 and MA Qing1

（1.College of Plant Protection，Northwest A&F University ，Yangling Shaanxi 712100，China;

2.Agricultural Technology Extension Center，Pingluo? Ningxia 753400，China）

Abstract In order to investigate effect of alginate oligosaccharides on induced resistance against? Botrytis cinerea in cucumber and understand their mechanisms，the trefoil stage of a susceptible variety of cucumber was used as the experimental materials. During 0-48 h after inoculation in pot experiment，enzyme activity determination method and real-time fluorescence quantification were used to determine the activities of defense related enzymes [（superoxide dismutase （SOD），hydrogen oxide （CAT），phenylalanine ammonia lyase （PAL）]，and peroxidase （POD） activity in cucumber leaves. The expression of key genes in the signal transduction pathway，including?? JAR1 and EIN2 （ key gene of plant in Jasmonic Acid Pathway），as well as? ?NPR1 and? PR1（key gene of plant in Salicylic Acid Pathway），were analyzed. The results showed that? the optimal induction concentration of ADO was 50 mg/L，with the induction period of 3 days，and the control efficiency? of 66.75%; the activities of defense related enzymes significantly increased; the relative expression of?? NPR1 and?? PR1，key genes of salicylic acid pathway，were up-regulated. Thre results suggest that alginate oligosaccharides have the potential to enhance the activity of defense related enzymes in plants，thereby increasing plant disease resistance through the stimulation of salicylic acid signal transduction.

Key words ADO; Induced disease resistance; Signal transduction pathway; Defense related enzyme activity

Received? 2022-11-06??? Returned 2023-03-23

Foundation item Key R&D Program of Shaanxi Province（No.2019ZDLNY03-07）.

First author DONG? Zihui，female，master student. Research area：plant pathology，comprehensive control of plant diseases.E-mail：zhibaodongzihui@163.com

Corresponding?? author MA Qing，female，doctoral supervisor，professor.Research area：plant pathology，comprehensive control of plant diseases. E-mail： maqing@nwafu.edu.cn

（責任編輯：郭柏壽 Responsible editor：GUO Baishou）