DOI：10.19913/j.cnki.2095-8730msyj.2024.02.11

收稿日期：2024-03-01

基金項目：江蘇省市場監(jiān)督管理局科技計劃項目（KJ2024096）;揚州市職業(yè)大學“優(yōu)秀青年骨干教師”培養(yǎng)項目（2021）;揚州市科技計劃項目（YZ2023066）;揚州市職業(yè)大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)培育計劃項目（2023）

作者簡介：

丁娟芳，女，揚州市職業(yè)大學生物與化工工程學院副教授，主要從事食品微生物學研究，E-mail：41116965@qq.com;

楊" 嘉，男，揚州市食品藥品檢驗檢測中心高級工程師，主要從事食品微生物學研究，E-mail：14724463@qq.com。

摘" 要：

以揚州市餐飲環(huán)節(jié)抽取的餐飲自制發(fā)酵乳為研究對象，采用國家標準方法對其衛(wèi)生指標進行檢測，并運用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法、分子生物學方法和傳統(tǒng)形態(tài)學方法對污染微生物指標不合格產(chǎn)品中的污染菌進行分離純化和鑒定。結(jié)果表明：25批次餐飲自制發(fā)酵乳的產(chǎn)品不合格率為36％，不合格項目均為微生物指標，其中大腸菌群不合格率為20％、霉菌計數(shù)不合格率為8％、酵母計數(shù)不合格率為32％。不合格樣品的大腸菌群陽性菌株中包含了肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌等多種條件致病菌;不合格樣品的霉菌和酵母菌以曲霉屬、青霉屬、念珠菌屬等發(fā)酵乳中常見的污染菌為主。調(diào)查表明：餐飲企業(yè)應重視加工制作過程中的微生物污染問題，監(jiān)管部門應制定和實施有針對性的餐飲食品抽檢計劃，同時加強對餐飲自制發(fā)酵乳的食品安全監(jiān)管。

關(guān)鍵詞：

餐飲自制發(fā)酵乳;衛(wèi)生檢測;微生物污染;微生物學鑒定;食品安全監(jiān)管

中圖分類號： TS 972.38""" 文獻標志碼： A""" 文章編號：

2095-8730（2024）02-0077-06

發(fā)酵乳是以生乳或乳粉為原料，經(jīng)殺菌、發(fā)酵后制成的pH值降低的乳制品，其具有一定的營養(yǎng)價值和保健作用，長久以來深受消費者青睞。隨著我國居民生活水平的提高，工業(yè)化預包裝乳制品代表的基本營養(yǎng)需求早已得到了滿足，大眾的乳品消費理念逐漸轉(zhuǎn)向追求個性化、多樣化和氛圍化，各類主打情懷、文藝、小清新等旗號的餐飲自制發(fā)酵乳被年輕人的圈層流量文化和短視頻效應賦予了一定的熱度［1］。在我國餐飲行業(yè)多元化發(fā)展競爭背景下，餐飲企業(yè)為了適應與滿足消費需求的變化和升級也在不斷開發(fā)新的餐品。發(fā)酵乳的制作過程相對簡單，開發(fā)成本低，受眾程度高，且易與不同餐飲風格融合，正逐漸成為一些餐飲單位的招牌或網(wǎng)紅餐品。由于發(fā)酵乳的制作過程和傳統(tǒng)餐飲食品烹飪加工有所差別，部分餐飲加工場所的交叉共用及儲存不當使其微生物污染風險顯著高于工業(yè)化預包裝發(fā)酵乳，從而帶來了相關(guān)的質(zhì)量風險和食品安全問題。

餐飲食品安全問題是導致食物中毒和食源性疾病發(fā)生的主要原因［2］，其中微生物引起的患病人數(shù)占比居首［3］。近五年的食品安全抽檢數(shù)據(jù)顯示，餐飲食品的合格率雖然呈上升趨勢，但仍然普遍低于其他食品類別以及抽檢整體合格水平［4-5］，其中微生物指標不合格在涉及相關(guān)項目的餐飲食品中占據(jù)主流［4-6］。目前，國家及地方各級食品安全抽檢監(jiān)督計劃會結(jié)合最新《食品安全監(jiān)督抽檢實施細則》實施，而細則中的餐飲食品部分一直未對餐飲自制乳品抽檢提出明確要求。餐飲自制發(fā)酵乳作為細則中的“其他餐飲食品”由各地區(qū)根據(jù)實際情況制定具體抽檢內(nèi)容，但各級市場監(jiān)督管理局發(fā)布的抽檢公告中鮮有涉及相關(guān)數(shù)據(jù)。鑒于餐飲自制發(fā)酵乳的潛在食品安全風險，本研究擬對揚州地區(qū)餐飲環(huán)節(jié)隨機抽取的餐飲自制發(fā)酵乳按照國家標準《食品安全國家標準 發(fā)酵乳》（GB 19302—2010）要求進行感官、理化和微生物項目檢驗，并對不合格產(chǎn)品的污染菌進行鑒定和分析，為餐飲自制發(fā)酵乳的食品安全監(jiān)管及制作工序改進提供依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 材料與試劑

通過消費點評類平臺、新媒體社交平臺、短視頻平臺，結(jié)合部分餐飲服務單位數(shù)據(jù)獲取餐飲環(huán)節(jié)自制發(fā)酵乳售賣信息，依據(jù)售賣信息在揚州市范圍內(nèi)的餐飲服務單位隨機抽取餐飲環(huán)節(jié)自制發(fā)酵乳，同一門店僅抽取一款以預包裝滅菌乳為奶源且無添加風味輔料的代表性原味產(chǎn)品作為同批次樣品。抽取的樣品在冷藏條件下運輸至實驗室，并在24小時內(nèi)完成實驗處理。

微生物檢測的計數(shù)、增菌、分離、鑒定等培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;HCCA基質(zhì)溶液購自德國Bruker公司;DNA提取試劑盒：北京百奧萊博科技有限公司;理化檢測用試劑均為國產(chǎn)分析純，其他試劑均為進口色譜純。

1.2" 儀器與設(shè)備

LS1220M電子分析天平：普利賽斯國際貿(mào)易（上海）有限公司;ZDJ-3A電位滴定儀：上海儀電分析儀器有限公司;JHZ-2潔凈工作臺：廣州市康恒儀器有限公司;GR85DA滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司;CYT-A生物安全柜：新加坡藝思高科技有限公司;Microflex LT／SH全自動生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)：德國布魯克分析儀器公司;CX41生物顯微鏡：日本奧林巴斯公司;QX600微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司;電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)：上海譜振生物科技有限公司;生化培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱：揚州恒都電子科技有限公司。

1.3" 實驗方法

1.3.1" 項目指標檢測方法

按照《食品安全國家標準發(fā)酵乳》（GB 19302—2010）中相關(guān)項目指定檢測方法進行感官、脂肪、蛋白質(zhì)、酸度、大腸桿菌、霉菌酵母計數(shù)、乳酸菌計數(shù)、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌檢測。

1.3.2" 大腸菌群、霉菌、酵母的分離和純化

挑取大腸菌群檢測過程中經(jīng)煌綠乳糖膽鹽肉湯管產(chǎn)氣驗證后的大腸菌群陽性菌株，接種營養(yǎng)瓊脂進行純化;選擇霉菌和酵母同稀釋度菌落數(shù)之和分別最接近10 CFU的平皿，選取10～15個不同類型的典型菌落接種馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，菌落數(shù)之和不足10 CFU的全部進行挑取純化。

1.3.3" 菌種鑒定

細菌菌株鑒定采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）法結(jié)合16S rRNA序列分析法;酵母菌菌株鑒定采用MALDI-TOF-MS法結(jié)合ITS序列分析法。霉菌菌株鑒定采用傳統(tǒng)形態(tài)學結(jié)合MALDI-TOF-MS方法。

MALDI-TOF-MS鑒定：參照文獻［7］的方法以甲酸覆蓋法和甲酸乙腈提取法進行MALDI-TOF-MS鑒定，以儀器自動生成的鑒定分值為依據(jù)確認鑒定結(jié)果。鑒定分值≥2.00時確認鑒定至種，1.99≥鑒定分值≥1.70時確認鑒定至屬，鑒定分值lt;1.70時鑒定結(jié)果不可靠。酵母菌和細菌的鑒定首選甲酸覆蓋法，不能鑒定至種時以甲酸乙腈提取法重新鑒定;霉菌則用甲酸乙腈提取法直接進行鑒定。

分子生物學鑒定：未能鑒定至種的細菌和酵母菌分別以16S rRNA序列分析法和ITS序列分析法對MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果進行確認。以通用引物27F、1 492r對細菌的16S rRNA序列進行擴增［8］，以通用引物ITS1、ITS4對酵母菌菌株的ITS序列進行擴增［9］，擴增產(chǎn)物純化后送至南京實踐醫(yī)學檢驗有限公司完成測序。將測序結(jié)果在美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information， NCBI）的數(shù)據(jù)庫中進行比對，分析其同源性確定菌種歸屬。

霉菌的傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定：觀察霉菌菌落的形態(tài)特征，結(jié)合其菌絲特點和產(chǎn)孢器結(jié)構(gòu)，依據(jù)《真菌鑒定手冊》［10］《真菌分類學》［11］和BARNETT等［12］的分類系統(tǒng)將霉菌鑒定至屬。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 樣品采集情況

通過平臺搜索及數(shù)據(jù)采集共獲得售賣餐飲自制發(fā)酵乳的餐飲服務單位信息31條，在抽樣過程中剔除了預包裝發(fā)酵乳分裝產(chǎn)品和后續(xù)添加谷物、果醬等輔料的自制發(fā)酵乳產(chǎn)品，最終在揚州市范圍內(nèi)抽取到25批次餐飲自制發(fā)酵乳（表1），抽樣地點覆蓋了餐館、小吃店、飲品店多種餐飲單位業(yè)態(tài)。

2.2" 衛(wèi)生檢測結(jié)果

餐飲環(huán)節(jié)自制發(fā)酵乳的檢測結(jié)果按照國家標準《食品安全國家標準 發(fā)酵乳》（GB 19302—2010）的指標要求進行判定，其中25份餐飲自制發(fā)酵乳的感官和理化指標均能滿足標準要求。

本次抽樣僅抽取了以預包裝滅菌乳為發(fā)酵奶源的餐飲自制發(fā)酵乳產(chǎn)品，發(fā)酵原料的相對穩(wěn)定為脂肪、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)指標的合格提供了保障。25份餐飲自制發(fā)酵乳中共檢出微生物指標不合格樣品9份，其中大腸菌群不合格樣品5份，霉菌計數(shù)不合格樣品2份，酵母計數(shù)不合格樣品8份，未檢出因乳酸菌數(shù)、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌不合格產(chǎn)品（表2）。檢驗項目統(tǒng)計結(jié)果顯示，25份餐飲自制發(fā)酵乳的產(chǎn)品不合格率為36％，其中大腸菌群不合格率為20％，霉菌計數(shù)不合格率為8％，酵母計數(shù)不合格率為32％。這三類衛(wèi)生指示菌項目的超標同樣是食品抽檢中預包裝低溫發(fā)酵乳的主要不合格原因［13］，但較高的檢出值和不合格率反映出市售餐飲自制發(fā)酵乳的整體衛(wèi)生狀況不佳。以餐飲服務單位業(yè)態(tài)進行統(tǒng)計，餐館、小吃店、飲品店的樣品不合格率分別為41.7％、33.3％、30.0％，不合格情況與餐飲服務業(yè)態(tài)的經(jīng)營范圍復雜程度呈一定的正相關(guān)性。

2.3" 污染菌分離鑒定結(jié)果

2.3.1" 大腸菌群陽性菌株鑒定結(jié)果

從不合格樣品中分離得到73株大腸菌群陽性菌株，通過MALDI-TOF-MS方法對菌株進行鑒定均獲得了鑒定至種的有效鑒定結(jié)果（表3）。隨機抽取20株菌株進行了分子生物學鑒定，結(jié)果和MALDI-TOF-MS法一致。

鑒定結(jié)果顯示，分離得到的73株大腸菌群可歸于7個種，其中大腸埃希氏菌在數(shù)量上占絕對優(yōu)勢，其次為肺炎克雷伯菌。大腸菌群作為食品中腸道致病菌的指示菌可用來評價食品的綜合衛(wèi)生狀況，本次抽檢的樣品中雖然未檢出國家標準中的致病菌指標，但大腸菌群陽性菌株中包含了肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、變棲克雷伯菌等多種條件致病菌，相關(guān)食品安全風險依然存在。

2.3.2" 霉菌菌株鑒定結(jié)果

從兩份不合格樣品中分離得到23株霉菌菌株，通過形態(tài)學方法輔以MALDI-TOF-MS方法對其進行鑒定，鑒定結(jié)果如表4所示。

分離得到的23株霉菌可歸于5個屬，占比最高的為毛霉屬，其次為曲霉屬和青霉屬。曲霉屬、青霉屬菌株均能以MALDI-TOF-MS方法鑒定至屬，毛霉屬、枝孢霉屬和根霉屬菌株以MALDI-TOF-MS方法鑒定未得到有效鑒定結(jié)果，以形態(tài)學方法鑒定至屬。分離得到的霉菌均為發(fā)酵乳中常見的污染菌［14］，毛霉屬和枝孢霉屬菌株分離自樣品YP2，曲霉屬、青霉屬、根霉屬菌株分離自樣品CG12，兩份不合格樣品中分離得到的霉菌從屬級水平上無交叉，污染的影響因素和發(fā)酵乳的獨立制作條件更為相關(guān)。

2.3.3" 酵母菌株鑒定結(jié)果

從不合格樣品中分離得到107株酵母菌株，通過MALDI-TOF-MS方法對菌株進行鑒定，除地霉屬以外的所有菌株均獲得了鑒定至屬的有效鑒定結(jié)果（表5）。隨機抽取20株菌株進行了分子生物學鑒定，結(jié)果和MALDI-TOF-MS法一致。

鑒定結(jié)果顯示，分離得到的107株酵母菌可歸于7個屬，其中念珠菌屬60株，占比達到56.1％。從種級水平的相對分離頻率來看，克柔念珠菌（21.5％）、膠紅酵母（19.6％）、葡萄牙念珠菌（15.9％）占比較高。地霉屬菌株形態(tài)接近霉菌，后經(jīng)MALDI-TOF-MS方法鑒定至屬后歸入酵母菌進行結(jié)果統(tǒng)計。發(fā)酵乳中的常見污染酵母有念珠菌屬、畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、季也蒙酵母屬等［14］，本次從餐飲環(huán)節(jié)自制發(fā)酵乳中分離出了部分常見污染酵母，也分離出了膠紅酵母、地霉屬等鮮有報道的發(fā)酵乳污染菌，餐飲服務單位復雜的制作環(huán)境可能會給發(fā)酵乳帶來更多樣化的污染風險。

2.4" 分析與討論

餐飲自制發(fā)酵乳的制作過程通常較工廠化的生產(chǎn)流程進行了簡化，但相對基礎(chǔ)的加工制作水平使其微生物污染可能來源于原輔料、生產(chǎn)（清洗）用水、人員操作、生產(chǎn)設(shè)備、生產(chǎn)環(huán)境、包裝材料等各環(huán)節(jié)。原料乳和谷物、果醬等輔料的添加是造成發(fā)酵乳微生物污染的主要原因［15］，本研究的抽樣方案選擇了以預包裝滅菌乳為奶源且無添加風味輔料的餐飲自制原味產(chǎn)品，最大程度減少了發(fā)酵乳由原輔料帶入污染的可能，檢測結(jié)果更能反映生產(chǎn)加工過程、生產(chǎn)環(huán)境等非原料因素帶來的微生物污染情況。

發(fā)酵乳較低的pH值一般會抑制細菌的生長繁殖，但不足以殺滅細菌［16］。本研究中同批次不合格樣品的大腸菌群三級采樣檢測結(jié)果接近同數(shù)量級，說明污染在產(chǎn)品中分布相對均勻，污染菌可能在生產(chǎn)（清洗）用水和發(fā)酵前的設(shè)備、工器具清洗等過程中就已帶入，并留存至成品中。發(fā)酵乳的酸性環(huán)境使得霉菌、酵母菌等耐酸微生物更易成為其主要污染菌，并對產(chǎn)品品質(zhì)造成影響。乳品生產(chǎn)企業(yè)通常有能力通過對各生產(chǎn)環(huán)節(jié)的有效管控來降低霉菌和酵母菌的污染風險，而大多數(shù)餐飲服務單位缺少相應的質(zhì)量監(jiān)控意識和手段。另外，餐飲場所的人員、環(huán)境通常比生產(chǎn)企業(yè)更為復雜，加工制作場所的分區(qū)布局不清晰、管理制度缺失或落實不到位等情況更易造成不同類別餐飲食品之間的交叉污染。本研究中餐飲服務業(yè)態(tài)的經(jīng)營范圍復雜程度與樣品不合格率呈一定的正相關(guān)性。餐館以飯菜為主要經(jīng)營項目，加工制作場所會涉及蔬菜、禽畜肉、水產(chǎn)等不同類型的生鮮食品原料，而小吃店和飲品店的經(jīng)營項目較為單一，交叉污染的風險相對較低。實驗中分離自餐館不合格樣品中的膠紅酵母、地霉屬酵母就屬于其他發(fā)酵食品中的常見菌，加工區(qū)域的共用可能是其污染發(fā)酵乳的潛在途徑。

3" 結(jié)論

餐飲是食品行業(yè)消費體系的終端，餐飲食品安全問題更能直接威脅民眾身體健康。本研究對抽取的25份餐飲自制發(fā)酵乳按照國家標準要求進行了感官、理化和微生物項目檢驗，未出現(xiàn)感官和理化項目不合格情況，共檢出微生物不合格樣品9份，不合格率為36％，遠高于預包裝乳制品0.13％的不合格率［17-18］，餐飲自制發(fā)酵乳的微生物污染狀況應引起監(jiān)管部門的關(guān)注。

目前，國內(nèi)尚未發(fā)布過餐飲發(fā)酵食品的加工操作規(guī)范和相關(guān)食品安全標準，考慮到餐飲業(yè)的進入門檻不高，衛(wèi)生環(huán)境條件參差不齊，有必要對乳制品等高風險餐飲發(fā)酵食品的制作流程進行規(guī)范［19］。餐飲服務單位在執(zhí)行行業(yè)通用衛(wèi)生規(guī)范的前提下可針對發(fā)酵乳的制售風險環(huán)節(jié)采取以下防范舉措：（1）以即開即用的合格預包裝滅菌乳和發(fā)酵菌粉為原料進行發(fā)酵，不建議使用生乳、復原乳和自留菌種。原料的可控能有效降低源頭的污染風險、穩(wěn)定成品質(zhì)量;（2）發(fā)酵乳的制作在專用操作間（區(qū)）進行，使用專用工具和器具，有效避免交叉污染;（3）增強制作過程中的清潔消毒意識，以消毒劑、紫外線等有效消殺手段對工器具、包裝材料、操作間（區(qū)）、發(fā)酵設(shè)備、手表面進行消毒，降低微生物污染風險;（4）選擇預包裝飲用水、合格的凈化處理直飲水或煮沸冷卻后的生活飲用水作為生產(chǎn)（清洗）用水;（5）成品在售賣及配送過程中低溫（2～8 ℃）保存，建議當天制作當天售賣，并對成品進行不少于48 h的留樣。作為監(jiān)管部門，現(xiàn)階段可組織相關(guān)餐飲從業(yè)人員進行乳品發(fā)酵及污染預防措施的基礎(chǔ)培訓，同時實施有針對性的餐飲食品抽檢計劃，加大對餐飲單位衛(wèi)生管理等各環(huán)節(jié)的監(jiān)管力度，以降低餐飲自制發(fā)酵乳的食品安全風險，切實保障公眾飲食安全。

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Investigation and analysis of hygiene quality of catering self-made fermented milk

—taking Yangzhou city as an example

DING Juanfang1，2， YANG Jia2，3， LYU Qing4， ZHU Qingli2，3， CHU Guangye2，3， SUN Changhua1，5， JI Shanshan1

（1.College of Biological and Chemical Engineering， Yangzhou Polytechnic College， Yangzhou， Jiangsu 225009， China; 2.Key Laboratory of Catering Food Safety and Systematic Monitoring for Jiangsu Province Market Regulation， Yangzhou， Jiangsu 225002， China; 3.Yangzhou Center for Food and Drug Control， Yangzhou， Jiangsu 225002， China; 4.Sino-Danish College， University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China; 5.Yangzhou Engineering Research Center of Agricultural Products Intelligent Measurement and Control ＆ Cleaner Production， Yangzhou， Jiangsu 225009， China）

Abstract：

Taking self-made fermented milk extracted from the catering link in Yangzhou City as the research object， the hygiene indicators were evaluated using national standard methods， and matrix-assisted laser desorption／ionization time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF-MS）， molecular biology methods， and traditional morphology methods were employed to isolate， purify， and identify the contaminating microorganisms in products that failed to meet the microbial indicator standards. The results showed that the failure rate of 25 batches of catering self-made fermented milk was 36％，and all unqualified items were microbial indicators. Among them， the failure rate for coliform bacteria， mold count and yeast count were 20％， 8％， and 32％， respectively. The coliform-positive strains in the unqualified samples included various opportunist pathogens such as Klebsiella pneumoniae and Enterobacter cloacae. The molds and yeasts in the unqualified samples were mainly common contaminants in fermented milk， such as Aspergillus， Penicillium， and Candida. The investigation suggested that catering enterprises should pay attention to microbial contamination during the processes of processing and production， regulatory authorities should develop and implement targeted food sampling inspection plans， and strengthen the food safety supervision of catering self-made fermented milk.

Key words：

catering self-made fermented milk; hygiene detection; microbial contamination; microbiological identification; food safety supervision

（責任編輯：趙" 勇）