[摘" "要]" "目的：初步篩查蘇州地區(qū)孕婦群體血小板CD36抗原和抗體表達(dá)，為預(yù)防CD36抗體介導(dǎo)的胎兒/新生兒同種免疫性血小板減少癥（fetal/neonatal alloimmune thrombocytopenia，F(xiàn)NAIT）奠定基礎(chǔ)。方法：收集102例孕婦EDTA抗凝全血標(biāo)本，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD36抗原表型，PCR擴(kuò)增及基因測(cè)序檢測(cè)CD36缺失標(biāo)本基因突變位點(diǎn)，結(jié)合Luminex技術(shù)檢測(cè)CD36抗體表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果：102例標(biāo)本中CD36缺失頻率為2.94%（3/102），其中2例I型CD36缺失標(biāo)本檢出較強(qiáng)效價(jià)的CD36抗體，基因測(cè)序顯示存在c.1228_1239delATTGTGCCTATT純合突變和c.1006+2 Tgt;G+c.1156 Cgt;T復(fù)合雜合突變;1例II型CD36缺失標(biāo)本未檢測(cè)到CD36基因突變。3例CD36缺失孕婦尚未發(fā)現(xiàn)FNAIT癥狀。結(jié)論：蘇州地區(qū)孕婦群體CD36抗原缺失頻率略高，臨床需加深對(duì)CD36抗體介導(dǎo)FNAIT的認(rèn)識(shí)，加強(qiáng)對(duì)I型缺失孕婦臨床追蹤評(píng)估，做好FNAIT的預(yù)防和治療。

[關(guān)鍵詞]" "CD36缺失;胎兒/新生兒同種免疫性血小板減少癥;基因突變

[中圖分類號(hào)]" "R722.1 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]" "B [DOI]" "10.19767/j.cnki.32-1412.2024.02.020

[文章編號(hào)]1006-2440（2024）02-0181-05

CD36又稱血小板糖蛋白IV（glycoprotein IV，GP IV），為血小板非特異性抗原，廣泛表達(dá)于血小板、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等細(xì)胞表面，已被國(guó)際輸血協(xié)會(huì)（International Society of Blood Transfusion，ISBT）命名為新的紅細(xì)胞血型系統(tǒng)（ISBT 045），該系統(tǒng)目前僅發(fā)現(xiàn)1個(gè)抗原CD36.1（045001）。近年來CD36抗體導(dǎo)致的胎兒/新生兒同種免疫性血小板減少癥（fetal/neonatal alloimmune thrombocytopenia，F(xiàn)NAIT）屢見不鮮，嚴(yán)重者可導(dǎo)致胎兒死亡[1-5]。據(jù)報(bào)道，I型CD36抗原缺失易產(chǎn)生CD36抗體而發(fā)生同種免疫性反應(yīng)，而II型CD36缺失發(fā)生同種免疫性反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)較低[6-7]。由于CD36抗體介導(dǎo)的FNAIT或?qū)⒊蔀橐鹞覈?guó)胎兒/新生兒死亡的主要原因之一，對(duì)孕婦血液標(biāo)本進(jìn)行CD36抗原篩查具有重要意義。本研究對(duì)蘇州地區(qū)102例孕婦血液標(biāo)本進(jìn)行血小板CD36抗原和抗體篩查，報(bào)告如下。

1" "材料與方法

1.1" "標(biāo)本來源" "隨機(jī)收集南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院/蘇州市立醫(yī)院2023年8月28—29日102例孕婦EDTA抗凝全血標(biāo)本1 mL，立即檢測(cè)或在4 ℃保存12 h后檢測(cè)。。

1.2" "試劑與儀器" "PE anti-human CD36（批號(hào)：336206）、FITC anti-human CD14（批號(hào)：325604）（BioLegend，上海達(dá)科為生物技術(shù)有限公司）;10×紅細(xì)胞溶血?jiǎng)ㄅ?hào)：A11895，Beckman Coulter）;DNA提取純化試劑盒（批號(hào)：0000481104;Promega）;PCR擴(kuò)增反應(yīng)混合液（批號(hào)：00000211042，Promega）;PAK LxTM Assay試劑盒（批號(hào)：3012631，Immucor）;流式細(xì)胞儀（型號(hào)：DxFLEX;Beckman Coulter）;Luminex檢測(cè)設(shè)備（型號(hào)：FLEXMAP-3D，Luminex）;全自動(dòng)核酸提取純化儀（型號(hào)：MX3031，Promega）;PCR擴(kuò)增儀（型號(hào)：GenAmp9700，Applied-Biosystems）。

1.3" "血小板表面CD36抗原檢測(cè)" "將EDTA抗凝全血標(biāo)本200 g離心5 min，取上層富血小板血漿移入干凈試管中，1 200 g離心5 min，分離血小板（血漿留存?zhèn)溆茫?.2% EDTA-PBS洗滌離心（1 200 g，5 min），并重懸血小板。取100 μL血小板懸液與PE anti-human CD36抗體室溫孵育20 min，以800～1 000 μL 0.2% EDTA-PBS洗滌離心（1 200 g，5 min），棄上清后用300 μL 0.2% EDTA-PBS重懸血小板，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板表面CD36平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI）。

1.4" "單核細(xì)胞表面CD36抗原檢測(cè)" "對(duì)血小板CD36抗原表達(dá)陰性標(biāo)本檢測(cè)單核細(xì)胞CD36表達(dá)水平。取100 μL EDTA抗凝全血標(biāo)本于流式細(xì)胞管中，加入1×紅細(xì)胞溶血?jiǎng)? mL，室溫避光10～15 min（期間震蕩數(shù)次），而后加入2 mL PBS洗滌離心2遍（350 g，5 min），棄上清后用100 μL PBS重懸細(xì)胞。分別加入PE anti-human CD36、FITC anti-human CD14，4 ℃避光孵育 20 min。加入800～1 000 μL PBS 洗滌離心（350 g，5 min），300 μL PBS重懸細(xì)胞，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD14+單核細(xì)胞表面CD36抗原的MFI值。

1.5" "CD36抗體檢測(cè)" "按照PAK LxTM Assay試劑盒說明書對(duì)3例CD36缺失標(biāo)本的血漿進(jìn)行人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）、人類血小板抗原（human platelet antigen，HPA）、CD36抗體檢測(cè)，通過Luminex檢測(cè)設(shè)備捕獲特異性熒光結(jié)合微珠，并使用配套分析軟件解讀數(shù)據(jù)，判斷是否存在血小板抗體及其種類。按照熒光微球MFI值判定抗體結(jié)果，MFIlt;500為陰性，MFI≥500則為陽(yáng)性。

1.6" "CD36基因突變位點(diǎn)檢測(cè)" "首先采用DNA提取試劑盒提取3例CD36缺失標(biāo)本的DNA，然后參照先前已報(bào)道的擴(kuò)增及測(cè)序流程進(jìn)行PCR-SBT測(cè)序分析[8]，并采用Chromas軟件和DNAMAN軟件對(duì)基因突變位點(diǎn)進(jìn)行分析。

2" "結(jié)" " " 果

2.1" "CD36表型分型" "經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)102例孕婦血小板及CD14+單核細(xì)胞CD36抗原表達(dá)水平檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有3例標(biāo)本（No.286、287、353）血小板CD36抗原表達(dá)缺失（圖1A），占比2.94%（3/102）;3例標(biāo)本中有2例（No.286、353）CD14+單核細(xì)胞CD36抗原表達(dá)陰性，為I型CD36缺失，另1例（No.287）CD14+單核細(xì)胞CD36抗原表達(dá)陽(yáng)性，為II型CD36抗原缺失（圖1B）。

2.2" "CD36缺失標(biāo)本血小板抗體檢測(cè)" "采用Luminex技術(shù)檢測(cè)CD36缺失標(biāo)本中是否存在血小板抗體。2例I型CD36缺失標(biāo)本血漿中CD36抗體呈陽(yáng)性，其中No.286標(biāo)本CD36抗體MFI為2 793，No.353標(biāo)本CD36抗體MFI為1 749，這2例標(biāo)本也檢測(cè)到可疑HPA抗體（抗體MFI位于cut-off值附近，MFI=500～1000），見表1。

2.3" "CD36缺失標(biāo)本基因突變分析" "對(duì)3例CD36缺失標(biāo)本基因外顯子（exon1-15）進(jìn)行擴(kuò)增和PCR-SBT測(cè)序。II型CD36缺失標(biāo)本（No.287）未見基因突變，而2例I型CD36缺失標(biāo)本（No.286和No.353）均檢測(cè)到基因突變，如表2所示。

2.4" "CD36表達(dá)陰性孕婦臨床資料回顧性調(diào)查" "3例CD36表達(dá)陰性孕婦均無(wú)輸血史和生產(chǎn)史，No.353孕婦有2次懷孕史，其中1次不明原因流產(chǎn)。見表3。

3" "討" " " 論

我們?cè)谇捌趯?duì)蘇州地區(qū)無(wú)償獻(xiàn)血者CD36抗原進(jìn)行初步篩查，發(fā)現(xiàn)CD36抗原缺失頻率為2.13%，在此基礎(chǔ)上建立蘇州地區(qū)CD36陰性表型資料庫(kù)，以應(yīng)對(duì)臨床因CD36抗體導(dǎo)致的血小板輸注無(wú)效和FNAIT現(xiàn)象[6]。本研究對(duì)孕婦群體CD36抗原展開篩查，發(fā)現(xiàn)孕婦CD36抗原缺失頻率為2.94%，略高于無(wú)償獻(xiàn)血者CD36缺失率，但兩者差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.4837，F(xiàn)isher′s test）。在2例I型CD36缺失者體內(nèi)不僅檢出較強(qiáng)的CD36抗體，還檢出可疑的HPA抗體，這大大增加FNAIT發(fā)生幾率。

我國(guó)針對(duì)FNAIT的預(yù)防一般建議所有孕婦進(jìn)行HPA抗體篩查，出現(xiàn)抗篩陽(yáng)性則進(jìn)行抗體鑒定及抗體效價(jià)監(jiān)測(cè)，特別對(duì)存在HPA抗體免疫風(fēng)險(xiǎn)的孕婦每2周監(jiān)測(cè)抗體效價(jià)，評(píng)估抗體效價(jià)的增長(zhǎng)，直至妊娠結(jié)束，以判斷HPA抗體介導(dǎo)的FNAIT嚴(yán)重程度及采取的干預(yù)措施。本文中2例孕婦體內(nèi)存在可疑HPA抗體，建議臨床在后續(xù)產(chǎn)檢中追蹤HPA抗體的效價(jià)，警惕發(fā)生FNAIT。

此前多篇文章已報(bào)道CD36抗體是繼HLA抗體和HPA抗體后最常見的血小板抗體，與亞洲人群FNAIT疾病密切相關(guān)，而在中國(guó)由CD36抗體引起的FNAIT甚至比HPA同種抗體更為常見[1，3-4，9]。與其他類型抗體介導(dǎo)的FNAIT不同，CD36抗體病例通常與貧血及胎兒水腫有關(guān)。CD36抗體與紅細(xì)胞前體細(xì)胞反應(yīng)可導(dǎo)致CD34+紅細(xì)胞/髓前體細(xì)胞凋亡，引起胎兒宮內(nèi)貧血;CD36抗體還通過與單核細(xì)胞相互作用，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，使血管內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)生障礙，導(dǎo)致胎兒/新生兒水腫和腦積水[10-11]。FNAIT是以血小板減少為主要特征的妊娠疾病，可引發(fā)胎兒/新生兒出血，主要風(fēng)險(xiǎn)為顱內(nèi)出血，嚴(yán)重影響胎兒/新生兒生存質(zhì)量[12]。本文2例I型CD36抗原缺失者都為年輕孕婦，此前均無(wú)生產(chǎn)史，未接受過任何形式的輸血，其中1例孕婦不明原因流產(chǎn)1次。這2例I型CD36抗原缺失孕婦體內(nèi)高強(qiáng)度的CD36抗體或許是由于胎兒血小板上來自父親CD36基因的刺激，從而引發(fā)同種免疫性反應(yīng)導(dǎo)致CD36抗體的產(chǎn)生。CD36抗體又可借助胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，破壞胎兒血小板，從而引起血小板減少癥。目前No.353孕婦已生產(chǎn)，未發(fā)生FNAIT現(xiàn)象，而No.286孕婦目前各項(xiàng)指征平穩(wěn)，隨著孕周延長(zhǎng)，CD36抗體借助胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)引起同種免疫性反應(yīng)強(qiáng)度可能增加，尚需加強(qiáng)檢測(cè)警惕發(fā)生FNAIT的可能。一旦發(fā)生FNAIT，臍血檢測(cè)后可行宮內(nèi)輸注CD36陰性紅細(xì)胞和血小板，以糾正胎兒貧血和血小板低下[3，11]。

I型CD36缺失主要由于純合突變和復(fù)合雜合突變導(dǎo)致血小板和單核細(xì)胞均不表達(dá)CD36抗原，而II型CD36缺失是血小板不表達(dá)CD36抗原，但其原因較復(fù)雜，部分II型缺失標(biāo)本并未檢測(cè)到基因突變。目前對(duì)CD36缺失機(jī)制解釋除了編碼區(qū)突變外，非編碼區(qū)的剪接突變也越來越被重視。本研究中No.353 I型CD36缺失者分別在第10外顯子和第12外顯子發(fā)生c.1006+2 Tgt;G和c.1156 Cgt;T復(fù)合雜合突變。c.1006+2 Tgt;G突變是位于第10外顯子后內(nèi)含子的第2個(gè)堿基的剪切突變，導(dǎo)致CD36從274號(hào)氨基酸開始出現(xiàn)移碼突變，且于289號(hào)氨基酸變?yōu)榻K止子，使得CD36氨基酸序列發(fā)生改變并提前終止[13];而c.1156 Cgt;T為錯(cuò)義突變，導(dǎo)致第386位精氨酸變?yōu)樯彼?，從而CD36蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，表現(xiàn)為CD36抗原表達(dá)缺失[14-15]。No.286 I型CD36缺失者第13外顯子存在1228_1239delATTGTGCCTATT純合突變，導(dǎo)致410_413位Ile-Val-Pro-Ile氨基酸缺失，使CD36前體蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能受損，進(jìn)而導(dǎo)致CD36蛋白表達(dá)缺失[16-17]。

CD36作為血小板同種抗原在血小板同種免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。CD36抗原缺失者經(jīng)輸血、移植或妊娠等途徑被CD36抗體免疫，除了介導(dǎo)FNAIT外，還易導(dǎo)致血小板輸注無(wú)效、輸血后紫癜以及引發(fā)輸血相關(guān)急性肺損傷[15，18]。因此，本研究檢測(cè)到的3例CD36抗原缺失者，尤其是2例I型缺失孕婦，除了需警惕在孕期發(fā)生FNAIT現(xiàn)象外，還要避免輸血以防同種免疫性反應(yīng)的發(fā)生。此外，鑒于前期無(wú)償獻(xiàn)血者CD36抗原的篩查及本研究對(duì)孕婦群體的篩查，蘇州地區(qū)CD36缺失問題不容忽視，建立CD36陰性供者資料庫(kù)十分必要。

近年來我國(guó)陸續(xù)報(bào)道CD36抗體引發(fā)的FNAIT，尤以廣東地區(qū)居多，部分研究已闡明CD36抗體引發(fā)FNAIT的機(jī)制，這對(duì)臨床預(yù)防和治療這類疾病具有重要意義。建議臨床科室增加CD36相關(guān)檢測(cè)項(xiàng)目，供孕婦在產(chǎn)檢時(shí)有選擇性的篩查CD36抗原和抗體，以進(jìn)一步預(yù)防FNAIT。臨床各科室應(yīng)與血液中心或血站緊密聯(lián)系，確保CD36陰性孕婦或臨床血小板輸注患者在需要時(shí)能及時(shí)輸注CD36抗原陰性的紅細(xì)胞和血小板。

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（本文編輯" "王曉蘊(yùn)）

* [基金項(xiàng)目] 蘇州市衛(wèi)生青年骨干人才“全國(guó)導(dǎo)師制”培訓(xùn)項(xiàng)目（Qngg2022033）;蘇州市姑蘇衛(wèi)生人才計(jì)劃（GSWS2022096;2022-160）;蘇州市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目（SZXK202118）。

** [通信作者] 張祥云，E-mail：szbc@live.com

[引文格式]何紅紅，俞錢，張祥云. 蘇州地區(qū)孕婦群體CD36抗原篩查結(jié)果分析[J]. 交通醫(yī)學(xué)，2024，38（2）：181-185.