[摘" "要]" "目的：探討miR-29c-3p在肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）發(fā)生發(fā)展中的作用。方法：利用公共數(shù)據(jù)庫分析miR-29c-3p和ERLIN2在肺腺癌中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。采用qRT-PCR檢測miR-29c-3p在LUAD細(xì)胞系和正常支氣管上皮細(xì)胞系中的表達(dá)，CCK8、細(xì)胞克隆形成、Transwell和傷口愈合實(shí)驗(yàn)評(píng)估m(xù)iR-29c-3p在細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用，利用生物信息學(xué)工具預(yù)測miR-29c-3p下游靶基因，并通過雙熒光素酶報(bào)告基因分析驗(yàn)證靶向關(guān)系。結(jié)果：miR-29c-3p在肺腺癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)。miR-29c-3p低表達(dá)患者的預(yù)后較差，miR-29c-3p是肺腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)和臨床分期密切相關(guān)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，抑制miR-29c-3p可促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。生物信息學(xué)分析表明，ERLIN2是miR-29c-3p的靶基因，二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。通過雙熒光素酶報(bào)告基因測定驗(yàn)證了上述靶向關(guān)系。在UALCAN數(shù)據(jù)庫中，ERLIN2在肺腺癌組織中高表達(dá)，并與患者年齡、性別、吸煙、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TP53突變狀態(tài)密切相關(guān)，ERLIN2高表達(dá)患者總生存率低于低表達(dá)患者。結(jié)論：miR-29c-3p通過靶向ERLIN2抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，是肺腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。

[關(guān)鍵詞]" "肺腺癌;miR-29c-3p;ERLIN2;增殖;侵襲;遷移

[中圖分類號(hào)]" "R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]" "A [DOI]" "10.19767/j.cnki.32-1412.2024.02.002

[文章編號(hào)]1006-2440（2024）02-0116-06

Role of miR-29c-3p in regulating ERLIN2 to suppress the development of lung adenocarcinoma

BIAN Tingting1， JIANG Daishan2， ZHANG Yali1， WANG Sichu1， LIU Yifei1

（1Department of Pathology， 2Department of Emergency Medicine， Affiliated Hospital of Nantong University， Jiangsu 226001）

[Abstract]" "Objective：To explore the impact of miR-29c-3p in the development of lung adenocarcinoma. Methods：Public database was used to analyze the expression of miR-29c-3p and ERLIN2 in lung adenocarcinoma and its correlation with clinicopathological parameters. qRT-PCR was used to detect the expression of miR-29c-3p in LUAD cell line and normal bronchial epithelial cell line. The function of miR-29c-3p in cell proliferation， migration， and invasion was evaluated by CCK8， colony formation， Transwell assay and wound healing essay. Bioinformatics predicted the downstream target genes of miR-29c-3p， and verified the targeting relationship by Dual luciferase reporter assay. Results： miR-29c-3p was low expressed in lung adenocarcinoma tissues and cells. miR-29c-3p was an independent prognostic factor for lung adenocarcinoma and was closely related to lymph node metastasis status and clinical staging. Celluar experiments demonstrated that miR-29c-3p inhibitor promoted the proliferation， migration， and invasion of A549 cells. Bioinformatics analysis showed that ERLIN2 was a target gene for miR-29c-3p， and there was a negative correlation between their expression. The above targeting relationship was verified through dual luciferase reporter assay. In the UALCAN database， ERLIN2 is highly expressed in tumor tissue and is closely related to patient age， gender， smoking habits， tumor staging， lymph node metastasis status， and TP53 mutation status.Meanwhile， the higher the expression of ERLIN2， the shorter the overall survival time of patients. Conclusions：miR-29c-3p inhibits the proliferation， migration， and invasion of lung adenocarcinoma by targeting ERLIN2， it is an independent prognosis factor.

[Key words]" "lung adenocarcinoma; miR-29c-3p; endoplasmic reticulum lipid raft-associated protein 2; proliferation; migration; invasion

肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的主要類型，約占NSCLC的40%[1]，大多數(shù)患者確診時(shí)已為晚期，導(dǎo)致預(yù)后不佳，5年生存率約為15%[2]，探索新的治療靶點(diǎn)迫在眉睫。大量證據(jù)表明，異常miRNA表達(dá)通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵因子，與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)[3-5]。某些miR-29家族成員包含可以調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄后行為的額外序列元素[6]。miR-29c-3p過表達(dá)顯著抑制肝細(xì)胞癌惡性細(xì)胞行為和腫瘤生長[7]，抑制卵巢癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[8]。本研究結(jié)合生物信息學(xué)和體外實(shí)驗(yàn)探究miR-29c-3p調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脂質(zhì)筏相關(guān)蛋白2（endoplasmic reticulum lipid raft-associated protein 2，ERLIN2）在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1" "資料與方法

1.1" "生信數(shù)據(jù)收集及分析" "CancerMiRNome數(shù)據(jù)庫（http：//bioinfo.jialab-ucr.org/CancerMIRNome/#tab-1929-4）用以分析miR-29c-3p在不同腫瘤中的表達(dá)。從TCGA數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）獲得513例LUAD組織和46例正常肺組織中miR-29c-3p的表達(dá)數(shù)據(jù)，用于分析miR-29c-3p在肺腺癌中的表達(dá)和預(yù)后。UALCAN數(shù)據(jù)庫（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）用以分析ERLIN2在LUAD中的表達(dá)及其與臨床特征的相關(guān)性。Starbase V3.0數(shù)據(jù)庫（http：//starbase.sysu.edu.cn/）用以分析肺腺癌組織中miR-29c-3p與ERLIN2表達(dá)的相關(guān)性。

1.2" "細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染" "正常支氣管上皮細(xì)胞（BEAS-2b）、肺腺癌細(xì)胞（H1299，A549，PC9，H1975）和人胚腎細(xì)胞（HEK-293T）均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫（中國上海），置于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。使用Lipofectamine[R] 3000試劑（Invitrogen;Thermo Fisher Scientific）將miR-29c-3p抑制劑或NC轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中。

1.3" "實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)" "使用Trizol試劑（Invitrogen）提取細(xì)胞中RNA，采用PrimeScriptTM

RT試劑盒（TaKaRa，Shiga，日本）通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq II進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）。引物序列：miR-29c-3p，F(xiàn)orward：5′-GAAAGCCACCACGATGCAACAGACA-

AATTCTGA-3′，Reverse：5′-TCTGTTGCATCGTGG-TGGCTTTCATACTATATC-3′;sncU6，F(xiàn)orward：5′-AACGCTTCACGAAATTGCGT-3′，Reverse：5′-CTC-GCTTCGGCACA -3′。

1.4" "細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.4.1" "CCK-8實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力：將轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞按5×103/孔密度接種到96孔板中，在37 ℃、5% CO2條件下孵育24 h、48 h和72 h，采用CCK-8試劑盒（Beyotime，中國）在每孔中加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h。使用微板讀取器（Tecan Infinite M200，Switzerland）檢測450 nm處吸光度（OD）值。將轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞接種在6孔板中，在37 °C下培養(yǎng)6～9天后，丟棄培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液洗板后，甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色。超過50個(gè)細(xì)胞組成的集落計(jì)為克隆，用相機(jī)拍攝并計(jì)數(shù)。

1.4.2" "細(xì)胞傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力：將轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)至完全融合，使用微量移液管槍頭在單層培養(yǎng)細(xì)胞間劃痕產(chǎn)生創(chuàng)傷區(qū)域。磷酸鹽緩沖液洗滌，去除脫落細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞，3.7%多聚甲醛固定，1%結(jié)晶紫染色。顯微鏡下拍攝劃痕，通過測量間隙大小比較細(xì)胞遷移能力。

1.4.3" "Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力：采用Transwell系統(tǒng)（Corning，Tewksbury，MA），轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，將無血清培養(yǎng)基中的4×103個(gè)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移到上室，將含10%FBS培養(yǎng)基放入下室。培養(yǎng)48 h后，擦拭未移動(dòng)的細(xì)胞，用甲醇固定侵入的細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.5" "雙熒光素酶報(bào)告基因測定" "Target Scan數(shù)據(jù)庫（http：//www.targetscan.org/vert_72/）顯示miR-29c-3p結(jié)合位點(diǎn)位于ERLIN2 mRNA的3′UTR區(qū)。將熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（野生型或突變體）與miR-29c-3p mimics或NC共轉(zhuǎn)染到HEK-293T人胚腎細(xì)胞中，以雙熒光素酶報(bào)告載體為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h后，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告物測定系統(tǒng)（Beyotime，Shanghai，China）提供的說明，使用光度計(jì)分析熒光素酶活性。

1.6" "統(tǒng)計(jì)學(xué)處理" "應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn);采用Kaplan-Meier生存曲線分析生存率;Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型多變量分析用于評(píng)估m(xù)iR-29c-3p表達(dá)和臨床病理特征對(duì)總生存率的意義。Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2" "結(jié)" " " 果

2.1" "miR-29c-3p在肺腺癌中低表達(dá)" "利用CancerMiRNome數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)miR-29c-3p在不同腫瘤組織中異常表達(dá)（圖1A）?；赥CGA-LUAD數(shù)據(jù)的差異分析發(fā)現(xiàn)，與鄰近的正常肺組織相比，肺腺癌組織中miR-29c-3p表達(dá)顯著減少（圖1B）。生存分析表明，與表達(dá)水平較高患者相比，miR-29c-3p表達(dá)較低患者的預(yù)后較差（圖1C），多因素Cox回歸分析證實(shí)miR-29c-3p是LUAD的獨(dú)立預(yù)后因素（P=0.022;圖1D）。

2.2" "抑制miR-29c-3p促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力" "與正常人肺支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B相比，肺腺癌細(xì)胞（A549、H1299、PC-9、H1975）中miR-29c-3p表達(dá)顯著減少（圖2A）。A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29c-3p抑制劑后，qRT-PCR證實(shí)細(xì)胞miR-29c-3p表達(dá)受到明顯抑制（圖2B）。抑制miR-29c-3p后，CCK-8及細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示A549細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)（圖2C-D），Transwell實(shí)驗(yàn)和傷口愈合實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞侵襲、遷移能力增強(qiáng)（圖2E-F）。

2.3" "肺腺癌中miR-29c-3p直接靶向ERLIN2" "為了鑒定肺腺癌中miR-29c-3p的下游調(diào)控因子，我們使用生物信息學(xué)工具（miRTarBase、miRDB和TargetScan）預(yù)測miR-29c-3p的潛在靶點(diǎn)（圖3A）。隨后，采用FunRich軟件對(duì)在交叉點(diǎn)鑒定的130個(gè)靶基因進(jìn)行功能注釋，發(fā)現(xiàn)下游靶基因中存在ERLIN2（圖3B-C）。miR-29c-3p下游靶基因中信號(hào)通路的富集主要集中在癌癥miRNA調(diào)控上（圖3D）。根據(jù)TargetScan數(shù)據(jù)庫分析確定了ERLIN2的3′-UTR內(nèi)miR-29c-3p的結(jié)合位點(diǎn)（圖3E）。雙熒光酶報(bào)告基因測定表明，與miR-29c-3pmimics共轉(zhuǎn)染抑制了野生型ERLIN2報(bào)告基因的熒光酶活性。然而，與miR-29c-3pmimics共轉(zhuǎn)染并未誘導(dǎo)突變體ERLIN2報(bào)告基因熒光素酶活性的變化（圖3F）。此外，相關(guān)性分析表明，miR-29c-3p與ERLIN2之間存在負(fù)相關(guān)（圖3G）。

2.4" "ERLIN2在肺腺癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系" "利用UALCAN網(wǎng)站和Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站，繪制ERLIN2表達(dá)水平，構(gòu)建箱式圖、臨床病理參數(shù)圖和生存曲線。結(jié)果顯示，ERLIN2在肺腺癌組織中高表達(dá)，并與患者年齡、性別、吸煙、癌癥分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TP53突變狀態(tài)有關(guān)（Plt;0.05），ERLIN2高表達(dá)患者總生存率低于低表達(dá)患者（P=0.006）（圖4）。

3" "討" " " 論

研究顯示，在多種癌癥中miRNA異常表達(dá)對(duì)腫瘤發(fā)生和進(jìn)展起重要作用，miR-29c-3p是人類多種惡性腫瘤的抑癌基因，如卵巢癌、胃癌、食管鱗狀細(xì)胞癌和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等[9-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-29c-3p在肺腺癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，miR-29c-3p低表達(dá)與患者總體生存率較差有關(guān)，表明miR-29c-3p可能是肺腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明miR-29c-3p在肺腺癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌基因的作用，抑制miR-29c-3p后A549細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力明顯增強(qiáng)。

miRNA通過與靶mRNA的3′-UTR結(jié)合，直接降解靶mRNA或抑制靶mRNA翻譯作用，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移、分化、凋亡和轉(zhuǎn)化等生物學(xué)過程。大量研究表明，miR-29c-3p可以通過調(diào)控下游靶基因來影響癌癥的進(jìn)展。在卵巢癌中miR-29c-3p靶向抑制KIF4A的表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞的增殖和遷移[8]。MiR-29c-3p通過調(diào)節(jié)KIAA1199的表達(dá)，在體內(nèi)外抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移[13]。我們運(yùn)用生物信息學(xué)方法確定miR-29c-3p的潛在靶點(diǎn)為ERLIN2，并通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)作了驗(yàn)證，提示miR-29c-3p可能通過調(diào)控ERLIN2對(duì)肺腺癌發(fā)展發(fā)揮抑制作用。

本研究利用UALCAN網(wǎng)站和Kaplan-Meier Plotter，發(fā)現(xiàn)ERLIN2在肺腺癌組織中高表達(dá)，并與患者年齡、性別、吸煙、癌癥分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TP53突變狀態(tài)有關(guān)（Plt;0.05），ERLIN2高表達(dá)患者總生存率低于低表達(dá)患者（P=0.006）。ERLIN2屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脂質(zhì)筏相關(guān)蛋白，營養(yǎng)物質(zhì)和生長信號(hào)的缺失可以導(dǎo)致乳腺上皮細(xì)胞中ERLIN2表達(dá)增加[14]，同時(shí)在乳腺癌細(xì)胞周期G2/M期ERLIN2通過促進(jìn)Cyclin B1蛋白的K63位點(diǎn)泛素化，穩(wěn)定CyclinB1/Cdk1蛋白復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂[15]。此外，ERLIN2也可作為靶基因參與腫瘤的進(jìn)程，有研究表明，miR-410通過ERS途徑直接靶向ERLIN2，在雌激素受體陽性的乳腺癌細(xì)胞中發(fā)揮腫瘤抑制作用[16]。

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（本文編輯" "王曉蘊(yùn)）

* [基金項(xiàng)目] 南通市科技項(xiàng)目（MSZ19164，JCZ20001，JC12022016）;新銳腫瘤支持科研專項(xiàng)（cphcf-2022-206）。

** [作者簡介] 卞婷婷，女，漢族，江蘇南通人，生于1987年3月，碩士，副主任醫(yī)師。研究方向：肺癌發(fā)病機(jī)制。" "通信作者：劉益飛，E-mail：ntdxliuyifei@sina.com

[引文格式]卞婷婷，姜岱山，張雅莉，等. miR-29c-3p調(diào)控ERLIN2抑制肺腺癌發(fā)展的作用[J]. 交通醫(yī)學(xué)，2024，38（2）：116-120，125.