趙淑麗 李國棟 張麗琴 趙明智 施建蓮 劉家佳

DOI： 10.11931/guihaia.gxzw202304039

趙淑麗， 李國棟， 張麗琴， 等， 2024.

根腫菌侵染下菘藍生物堿合成機制 ［Ｊ］.

廣西植物， 44（5）： 981-997.

ZHAO SL， LI GD， ZHANG LQ， et al.， 2024.

Mechanism of alkaloid synthesis in Isatis indigotica infected by Plasmodiophora brassicae［J］.

Guihaia， 44（5）： 981-997.

摘? 要：? 為探究根腫菌脅迫對菘藍生物堿及其合成關(guān)鍵酶基因表達的影響，該研究對根腫菌侵染后0、7、14、21 d的菘藍進行病情形態(tài)分級、組織學(xué)觀察、生理生化指標測定以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析。結(jié)果表明：（1）接菌后0、7、14、21 d菘藍根部分別發(fā)展為0級、1級、3級、5級的腫根，并且7 d是皮層入侵的關(guān)鍵時間點。（2）接種根腫菌14 d后，菘藍葉內(nèi)可溶性蛋白、丙二醛的含量，超氧化物歧化酶、過氧化物酶、多酚氧化酶、過氧化氫酶的活性與同時間對照組比較顯著提高，并隨著接菌時間的延長呈增加的趨勢。（3）代謝組學(xué)一共檢測到161種生物堿，其中吲哚類生物堿數(shù)量較多；與未接菌相比，菘藍接菌后7、14、21 d分別存在16種、17種、39種差異代謝物且各組差異代謝物多富集在生物堿和氨基酸代謝通路。（4）轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，與未接菌相比，菘藍接菌后7、14、21 d分別存在2 439個、256個、6 437個差異表達基因，這3組共同富集到11個生物堿相關(guān)的代謝通路；與未接菌相比，接菌后7、14、21 d有9個基因（編碼4種酶THS、TAT、YUCCA、ALDH）表達量均上升。該研究結(jié)果揭示了蕓薹根腫菌與菘藍之間的互作機制，探究了蕓薹根腫菌對吲哚生物堿合成及其關(guān)鍵酶基因的影響，為后期菘藍根腫病抗性基因及生物堿次生代謝途徑的研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 板藍根， 根腫菌， 抗氧化酶， 功能基因， 吲哚生物堿， 代謝組

中圖分類號：? Q946

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2024）05-0981-17

收稿日期：? 2023-08-22? 接受日期： 2023-11-24

基金項目：? 云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目（202101AU070121）； 云南省重大科技專項（202102AE090031）。

第一作者： 趙淑麗（1999—），碩士研究生，研究方向為民族藥資源保護與開發(fā)利用，（E-mail）2764522605@qq.com。

*通信作者：? 劉家佳，博士，助理研究員，從事藥用植物代謝通路研究，（E-mail）441603928@qq.com。

Mechanism of alkaloid synthesis in Isatis indigotica

infected by Plasmodiophora brassicae

ZHAO Shuli1， LI Guodong1， ZHANG Liqin2， ZHAO Mingzhi3， SHI Jianlian3， LIU Jiajia1*

（ 1. Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming 650500， China; 2. Institute of Horticultural Research， Yunnan Academy of

Agricultural Sciences， Kunming 650205， China; 3. Haiyuan College， Kunming Medical University， Kunming 650101， China ）

Abstract：? To explore expression level of alkaloid and its key synthetase gene in Isatis indigotica upon Plasmodiophora brassicae exposure. The grades of disease severity according to morphology were verified. Moreover， histological observation， physiological and biochemical parameters have been collected together with transcriptomic and metabolomic analysis in Isatis indigotica after infection for 0， 7， 14， 21 d. The results were as follows： （1） After inoculation for 0， 7， 14， 21 d with Plasmodiophora brassicae， Isatis indigotica showed club root grades in 0， 1， 3， and 5 respectively， notably， cortical invasion occurred on 7 d. （2） When Plasmodiophora? brassicae exposed lasting 14 d later， the contents of soluble protein and malondialdehyde， along with superoxide dismutase， peroxidase， polyphenol oxidase and catalase activities in Isatis indigotica increased significantly compared to control group at time depended manner. （3） A total of 161 alkaloids were detected in metabolomics， among those alkaloids， indoles were noticed as the most abundant form. There were 16， 17 and 39 discriminating metabolites had been spotted after infected with Plasmodiophora? brassicae for 7， 14， 21 d， the most discriminating metabolites enriched at alkaloid and amino acid metabolism pathways. （4） Transcriptome analysis showed that there were 2 439， 256 and 6 437 genes expression alteration for 7， 14， 21 d compared to control， those differentially expressed genes enriched at 11 alkaloids related metabolism pathways. Markedly， expression level of 9 genes （encoding for enzymes thebaine synthase， tyrosine aminotransferase， indole-3-pyruvate monooxygenase and aldehyde dehydrogenase） were increased after infection for 7， 14， 21 d. The results reveal the interaction between Plasmodiophora? brassicae and Isatis indigotica，

explored the effects of Plasmodiophora brassicae on indole alkaloid synthesis and its key enzyme genes， and lay a foundation for later research on resistance genes and alkaloid secondary metabolic pathways in Isatis indigotica.

Key words： Isatidis Radix， Plasmodiophora brassicae， antioxidant enzymes， functional gene， indole alkaloid， metabolome

菘藍（Isatis indigotica），十字花科菘藍屬的二年生植物，全國各地均有栽培，具有很大的經(jīng)濟價值和藥用價值，其干燥根、葉為清熱解毒的代表藥板藍根和大青葉（Wong et al.， 2022）。菘藍中的主要生物活性成分為生物堿，具有抗病毒、抗菌及免疫調(diào)節(jié)的藥理作用，其中吲哚類生物堿的藥理活性報道最多，已經(jīng)證實靛藍、靛玉紅、表告依春、5-羥基吲哚、吲哚-3-甲醛和色胺酮具有抗病毒、抗腫瘤、白細胞抑制及抑菌活性（Sinha et al.， 2008；Chen et al.， 2021；楊立國等，2021）?！吨腥A人民共和國藥典》規(guī)定板藍根和大青葉藥材及其制劑質(zhì)量控制的重要指標分別是表告依春和靛玉紅（國家藥典委員會，2020）。

十字花科根腫病俗稱大根病，其病原為蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae），是一種土傳病害，專門寄生在菘藍等十字花科作物（白菜、油菜、蘿卜、芥菜）的根部，通常先侵入根毛，再產(chǎn)生次級游動孢子并入侵皮層組織，致使皮層細胞增大，擠壓變形，侵染后期細胞內(nèi)會產(chǎn)生休眠孢子，在此過程中植株根部腫大呈瘤狀且生長發(fā)育遲緩、凋萎下垂。根腫菌侵染也會誘導(dǎo)寄主抗性響應(yīng)，如產(chǎn)生大量的氧自由基，促使膜脂過氧化，破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)，而過氧化氫酶（catalase，CAT）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化物酶（peroxidase，POD）等防御酶主要參與活性氧的消除，維持細胞膜穩(wěn)定性（Qi et al.， 2020；Huang et al.， 2022；王公達等，2022）。秦六月（2021）研究表明抗病大白菜DH40R中的CAT、SOD、POD活性和可溶性蛋白含量在根腫菌侵染8 d時明顯升高，強烈抵抗根腫菌侵染；朱紅芳等（2015）研究表明在初期篩選抗根腫病的品種時，將可溶性糖、可溶性蛋白和丙二醛（malondialdehyde， MDA）作為主要指標；郭珍（2018）研究發(fā)現(xiàn)CAT與油菜抗病性相關(guān)，SOD、POD與油菜抗病性呈正相關(guān)。

目前，對十字花科植物感染根腫菌的相關(guān)研究主要還是集中在蕓薹屬植物，對擬南芥的研究較少，菘藍感染根腫菌的防御機制以及體內(nèi)代謝變化的研究幾乎沒有報道。因此，迫切需要探究菘藍與根腫菌之間的互作機制，以及根腫菌對菘藍有效成分積累的影響。本研究以接菌后0、7、14、21 d的菘藍為研究對象，采用Illumina高通量測序技術(shù)和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，通過病情形態(tài)分級、組織學(xué)觀察、生理生化指標測定以及轉(zhuǎn)錄代謝分析，擬探討以下問題：（1）根腫菌侵染菘藍的動態(tài)過程；（2）菘藍抗根腫病的生理防御機制；（3）根腫菌脅迫對菘藍生物堿類化合物合成機制的影響。本研究為深入挖掘菘藍抗根腫病功能基因及次生代謝物合成途徑等分子研究奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1 材料

供試菌株和菘藍品種：菌株采自昆明市盤龍區(qū)阿子營鄉(xiāng)的大白菜發(fā)病根瘤，經(jīng)云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院鑒定為4號生理小種（Williams鑒定系統(tǒng)）。實驗所需小葉菘藍種子由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所的十字花科課題組張麗琴老師提供并鑒定。

試劑及儀器：臺盼藍溶液（SIGMA）、甲醛-醋酸-乙醇固定液（50%）；牛血清蛋白、核黃素、愈創(chuàng)木酚、2-硫代巴比妥酸，北京索萊寶科技有限公司；鄰苯二酚、三氯乙酸溶液、L-甲硫氨酸，上海麥克林生化科技有限公司；氯化硝基四氮唑藍（NBT）、乙二胺四乙酸EDTA，德國Biofroxx生物試劑；過氧化氫（30%），云南景銳科技有限公司。Nikon數(shù)碼顯微鏡，血球計數(shù)板，育苗盤，普析TU-1810紫外可見分光光度計，超低溫冷凍離心機，光照培養(yǎng)箱，臺式鼓風(fēng)干燥箱，電熱恒溫水浴鍋，千分之一電子天平，托盤天平，冷凍冰箱等。

1.2 實驗處理

將冷凍的大白菜發(fā)病根瘤置于室溫解凍，采用楊佩文等（2002）的方法提取根腫菌休眠孢子，血球計數(shù)板測定根腫菌孢子懸浮液的濃度，稀釋成5×107 CFU·mL-1 的病原菌菌液備用。小葉菘藍于72孔育苗盤中栽培，1個穴播種3顆種子，待其長出2～3對真葉后間苗，注射法進行根腫菌（1×107 CFU·mL-1 的休眠孢子）接種，用10 mL 注射器吸取菌液，將菌液緩慢注射到實驗苗根部，每株2 mL菌液。分別在接種根腫菌后0、7、14、21 d采集正常生長（BLG-CK1、BLG-CK2、BLG-CK3、BLG-CK4）和接種根腫菌（BLG-S1、BLG-S2、BLG-S3、BLG-S4）的小葉菘藍根部（根及根莖）和葉子（Lan et al.， 2019），3個生物學(xué)重復(fù)，并液氮冷凍，-80 ℃ 儲存。

1.3 方法

1.3.1 病情形態(tài)分級和組織學(xué)觀察? 病情分級參照農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項（201003029）制定的標準（楊華等，2014）。接種根腫菌后根據(jù)病情形態(tài)分級每24 h觀察根腫情況并取小葉菘藍根部進行組織學(xué)觀察，連續(xù)觀察21 d。將小葉菘藍根部洗干凈，取地下1～2 cm于FAA固定液中至少固定24 h；再將組織從FAA固定液中取出并切成薄片；于臺盼藍染液中染色2 min，染色后用去離子水（ddH2O）洗去殘留的染液，清洗2～3次；染上色的根組織薄片放在載玻片上進行顯微觀察。

1.3.2 生理指標的測定? 小葉菘藍葉片生理指標的測定主要參照高俊鳳（2006）和王文龍（2014）的方法，具體如下：（1）硫代巴比妥酸顯色法檢測MDA；（2）考馬斯亮藍G-250染色法檢測可溶性蛋白；（3）愈創(chuàng)木酚比色法檢測POD；（4）氮藍四唑光還原法檢測SOD；（5）鄰苯二酚法檢測PPO；（6）紫外分光光度法檢測CAT。

1.3.3 UPLC-MS/MS測定

1.3.3.1 樣品制備? 將小葉菘藍的根及根莖放置于凍干機（Scientz-100F）中真空冷凍干燥后研磨；稱取50 mg 的粉末，加入70% 甲醇（1.2 mL），30 min渦旋1次（每次30 s，共6次）；12 000 r·min-1，離心3 min后，0.22 μm微孔濾膜將上清液過濾在進樣瓶中，用于后續(xù)實驗。

1.3.3.2 色譜質(zhì)譜條件? ExionLCTM AD超高效液相色譜（https：//sciex.com.cn/），Applied Biosystems 4500 QTRAP串聯(lián)質(zhì)譜（https：//sciex.com.cn/）。液相色譜條件：色譜柱為SB-C18（1.8 μm，2.1 mm × 100 mm，Agilent）；0.1%甲酸的超純水（A）與0.1%甲酸乙腈（B）為流動相，流速為0.35 mL·min-1；洗脫梯度（B相比例）為0.00 min，5%，9.00 min內(nèi)線性增加至95%，并維持在95% 1 min，10.00～11.10 min，95%～5%，11.10～14.00 min，5%；進樣量4 μL；柱溫為40 ℃。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；電壓為+5 500 / -4 500 V；溫度為550 ℃；離子源氣體 I、氣體Ⅱ及氣簾氣分別設(shè)置為50、60、25 psi；碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。

OPLS-DA模型中的VIP值結(jié)合差異倍數(shù)值fold change來篩選差異代謝物。篩選標準：符合VIP ≥ 1、fold change ≥ 1.5和fold change ≤ 0.67的代謝物具有顯著差異。

1.3.4 RNA提取和文庫構(gòu)建? RNA提取與測序由武漢邁維代謝有限公司完成。采用Illumina的NEBNext UltraTM RNA Library Prep Kit試劑盒提取total RNA。瓊脂糖凝膠電泳和Nano Photometer分光光度計檢測RNA完整性和純度。最終達標的樣品用于構(gòu)建小葉菘藍cDNA文庫。

1.3.5 轉(zhuǎn)錄組測序、分析及注釋? 利用Illumina對小葉菘藍根及根莖轉(zhuǎn)錄組文庫進行高通量測序。通過CASAVA堿基識別將原始的圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為原始數(shù)據(jù)（raw data），經(jīng)數(shù)據(jù)評估、過濾除雜及冗余處理等質(zhì)控獲得高質(zhì)量序列（clean reads），Trinity組裝并層次聚類后得Unigene。使用DIAMOND BLASTX與HMMER軟件將Unigene序列與Gene Ontology（GO）、TrEMBL、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）、Swiss-Prot、euKaryotic Ortholog Groups（KOG）、NR、Protein family（Pfam）數(shù)據(jù)庫進行比對，得到基因功能信息。用DEGSeq R包鑒定差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），規(guī)定同時符合錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）<0.05，|log2差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）|≥1的基因確定為差異表達的基因并對其進行功能富集分析。

1.3.6 qRT-PCR分析? 植物RNA提取同1.3.4節(jié)。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果中的FPKM值篩選13個差異基因，采用Monad試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板、菘藍Actin基因（Qu et al.， 2019）為內(nèi)參進行qRT-PCR實驗。利用Primer-BLAST設(shè)計引物（表 1）以及ABI 7500 熒光定量PCR儀進行qRT-PCR分析。擴增程序：95 ℃，2 min預(yù)變性；95 ℃，5 s變性；60 ℃，30 s退火/延伸（40個循環(huán)）；熔解曲線為從65 ℃ 升至95 ℃，每升溫0.5 ℃ 采集1次熒光信號。每個樣品均設(shè)置3個重復(fù)，使用2-ΔΔCt法進行實時熒光定量PCR結(jié)果的計算。將實驗結(jié)果數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差，并采用Graphpad軟件對各組數(shù)據(jù)進行T檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果與分析

2.1 病情形態(tài)分級和組織學(xué)觀察

由圖1和圖2可知，接菌后0 d根部發(fā)育正常無腫瘤，病情指數(shù)為0級且組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)細胞排列整齊（圖1：E；圖2：A）；接菌后7 d根部開始出現(xiàn)腫大癥狀，病情指數(shù)為1級，組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)皮層細胞明顯增大，擠壓變形（圖1：F；圖2：C）；接菌后14 d主根腫塊直徑小于莖基部直徑的2倍，病情指數(shù)為3級，同時次級游動孢子遍布皮層細胞并開始入侵維管柱（圖1：G；圖2：E）；接菌后21 d根部出現(xiàn)較大腫瘤，其直徑是莖基部直徑的2～3倍，判定病情指數(shù)為5級，同時次級游動孢子遍布皮層和維管柱（圖1：H；圖2：F）。這從表觀到細胞層次展示了根腫菌侵染植株的整個發(fā)病過程，同時也說明了根腫菌人工接種的可行性。

2.2 生理生化指標測定

由圖3可知，接菌處理的可溶性蛋白、MDA含量和防御酶SOD、POD、PPO、CAT的活性隨接菌時間的延長呈不斷上升的趨勢；接菌后7～21 d，實驗組的CAT、SOD活性均顯著高于相應(yīng)對照組（P<0.05）；接菌后14～21 d，實驗組的可溶性蛋白、MDA含量以及POD、PPO活性均顯著高于對照組（P<0.05）。這說明菘藍為抵抗根腫菌侵染自身做出了防御反應(yīng)。

2.3 代謝組分析

2.3.1 樣品檢測及OPLS-DA分析? 本實驗對7組樣本［BLG-CK1（S1）、BLG-CK2、BLG-CK3、BLG-CK4、BLG-S2、BLG-S3、BLG-S4］進行代謝研究?；跈z測平臺和自建數(shù)據(jù)庫共檢測到161種生物堿，其他類生物堿數(shù)量最多，占總生物堿的53%，其次是吲哚類生物堿占總生物堿的32%（圖4）。由圖5可知，正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）結(jié)果顯示各組樣品均能得到明顯分離，并且BLG-CK3和 BLG-S3的分離距離最大，BLG-CK4和 BLG-S4次之，說明接菌14 d時根腫菌對菘藍代謝影響最大。

2.3.2 差異代謝物篩選? 進一步對接菌后7、14、21 d的菘藍差異代謝物進行分析，發(fā)現(xiàn)BLG-CK2 vs BLG-S2有16種差異代謝物，6個上調(diào)，10個下調(diào)；BLG-CK3 vs BLG-S3有17種差異代謝物，9個上調(diào)，8個下調(diào)；BLG-CK4 vs BLG-S4有39種差異代謝物，32個上調(diào)，7個下調(diào)；BLG-S2 vs BLG-S3有19個差異代謝物，3個上調(diào)，16個下調(diào)；BG-S2 vs BLG-S4有45個差異代謝物，19個上調(diào)，26個下調(diào)；BG-S3 vs BLG-S4有34個差異代謝物，14個上調(diào)，20個下調(diào)（表2）。由圖6可知，將BLG-CK2 vs BLG-S2、BLG-CK3 vs BLG-S3、BLG-CK4 vs BLG-S4這3組差異代謝物取交集后發(fā)現(xiàn)共有5個差異代謝物，分別為環(huán)蕓薹寧、isatindosulfonic acid B、5，6-二羥基吲哚-5-O-β-葡萄糖苷、泛酰巰基乙胺和對香豆酰亞精胺，其中前3種為吲哚類生物堿。將BLG-S2 vs BLG-S3、BLG-S2 vs BLG-S4、BLG-S3 vs BLG-S4這3組差異代謝物取交集后發(fā)現(xiàn)共有2個差異代謝物，分別是吲哚類生物堿isatisindigoticanine B和喹啉類生物堿2-氧-3，4-二氫-1H-喹啉-3-羧酸。

2.3.3 差異代謝物KEGG富集分析? 由圖7可知，各組別富集在代謝通路（ko01100）上的差異代謝物最多且生物堿和氨基酸相關(guān)的代謝通路變化明顯；BLG-CK2 vs BLG-S2、BLG-CK3 vs BLG-S3、BLG-CK4 vs BLG-S4這3組都富集在托烷、哌啶和吡啶生物堿生物合成途徑（ko00960）；除了BLG-CK3 vs BLG-S3，其他組都在色氨酸代謝途徑（ko00380）上富集，色氨酸合成途徑是吲哚類生物堿合成的前體途徑。

2.4 RNA-seq 分析

2.4.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝和質(zhì)量分析? 為進一步挖掘根腫菌脅迫下菘藍生物堿積累機制，對菘藍21個樣本進行轉(zhuǎn)錄組測序和分析得到1 200 974 786條原始序列和1 171 808 210個高質(zhì)量序列，共獲得175.77 Gb的有效數(shù)據(jù)；各樣本有效數(shù)據(jù)均達到7 Gb，Q20（Qphred值不低于20的堿基數(shù)占總堿基數(shù)的百分比）堿基百分比均在97%以上，Q30（Qphred值不低于30的堿基數(shù)占總堿基數(shù)的百分比）堿基百分比均在92%以上；GC含量（G和C占總堿基數(shù)量的百分比）為47.0%～47.69%。Trinity拼接得到83 775個Unigene，平均長度為1 708 bp，最長達到16 523 bp，最短為201 bp，N50為2 367 bp。Unigene長度分布圖（圖8）顯示，51 799條（61.83%）Unigene長度超過1 000 bp，25 874條（30.89%）Unigene長度超過2 000 bp。這說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可進行后續(xù)分析。

2.4.2 Unigene的功能注釋 ?用NR、TrEMBL、GO、Swiss-Prot、KOG、KEGG、Pfam共7個數(shù)據(jù)庫進行Unigene注釋，分別成功注釋69 350（82.78%）、70 281（83.89%）、60 538（72.26%）、54 696（65.29%）、44 620（53.26%）、55 271（65.98%）、55 387（66.11%）個基因，至少在一個數(shù)據(jù)庫注釋成功的Unigene有72 965條（87.1%）。樣本間基因表達水平的相關(guān)性分析表明樣本在一組中具有較高的一致性，確保了后面分析結(jié)果的可靠性。

在本研究中，共有60 538條Unigene 得到了GO注釋。總體分為3大類：一是分子功能，主要富集條目有催化活性（30 758條）和結(jié)合（36 084條）；二是細胞組分，細胞解剖實體Unigene數(shù)量最多（51 807條）；三是生物過程，Unigene富集較多的類別有細胞過程（40 504條）、刺激響應(yīng)（18 474條）、代謝過程（32 229條）、生物調(diào)控（16 606條）（圖9）。

由圖10可知，本次共有25個不同功能且種類齊全的類群，包含大多數(shù)的生命活動。其中，10 102條被富集到一般功能預(yù)測，是KOG類群中Unigene數(shù)量最多的；其次是翻譯后修飾、蛋白反轉(zhuǎn)和伴侶，4 932條；注釋到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的較少，也有4 461個基因，其他功能類群的基因豐度也不盡相同。

2.4.3 差異表達基因的篩選與功能分析? 菘藍接菌后7、14、21 d與同時間對照組比較分別有2 439個、256個、6 437個差異表達基因，結(jié)果表明菘藍在根腫菌侵染后基因表達發(fā)生顯著變化。其中，21 d的DEGs最多，說明根腫菌侵染后期菘藍基因表達發(fā)生劇烈變化；這3組共有17個差異表達基因，其中9個上調(diào)，8個下調(diào)。接菌后7、14、21 d的實驗組隨著接菌時間的延長，差異基因數(shù)目在不斷增加，其對根腫菌的響應(yīng)更加劇烈（表3）。

對DEGs進行GO富集分析，根據(jù)細胞組成、分子功能和生物代謝對基因進行分類，共有9 805個DEGs被富集到這3個GO類別中。細胞組成過程中細胞解剖實體的DEGs位居第一； 細胞過程、刺激響應(yīng)和代謝過程是DEGs在生物過程中富集較多的3個功能；結(jié)合和催化活性是DEGs在分子功能中的主要功能（表4）。

由于菘藍中的主要活性成分為生物堿，而氨基酸是生物堿合成的基礎(chǔ)，因此主要分析氨基酸和生物堿相關(guān)的代謝通路。為更清楚地了解所關(guān)注的生物堿類化合物與差異基因在通路上是否存在相關(guān)性，對BLG-CK2 vs BLG-S2、BLG-CK3 vs BLG-S3、BLG-CK4 vs BLG-S4這3組差異表達基因進行KEGG富集分析（表5）。由表5可知，3組共同富集在11個生物堿相關(guān)的代謝通路上，其中色氨酸代謝途徑富集的差異表達基因數(shù)量較多。

2.5 生物堿合成途徑相關(guān)基因挖掘

本研究重點對吲哚類生物堿合成途徑及相關(guān)基因進行挖掘。由圖11可知，分支酸可在鄰氨基苯甲酸合酶（anthranilate synthase，AS）、色氨酸合成酶（trytophan synthase asubunit，TSA）等酶的反應(yīng)下合成吲哚，最后經(jīng)過一系列反應(yīng)合成色氨酸。色氨酸脫羧酶（L-tryptophan decarboxylase，TDC）是至關(guān)重要的酶，色氨酸可在其催化下生成色胺，并在黃素單加氧酶（indole-3-pyruvate monooxygenase，YUCCA）的催化作用下生成吲哚-3-乙酸；色胺也可在細胞色素P450單加氧酶（tryptamine 5-hydroxylase， CYP71P1）、醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）和5-羥色胺-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（acetylserotonin-O-methyltransferase， ASMT）的催化下合成5-甲氧基吲哚-3-乙酸。

本研究從所有的DEGs中篩選到18個基因，分別編碼吲哚生物堿合成途徑的5種關(guān)鍵酶（AS、TSA、TDC、YUCCA、ALDH）（圖12：A），另外18個基因編碼異喹啉類生物堿合成途徑的2種關(guān)鍵酶，即蒂巴因合成酶（thebaine synthase，THS）和酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（tyrosine aminotransferase，TAT）（圖12：B）。與未接菌相比，接菌后7、14、21 d基因表達量均上調(diào)的一共有9個DEGs：3個編碼THS的基因（Cluster-24362.0、Cluster-36994.3、Cluster-36129.3），2個編碼TAT的基因（Cluster-31730.0、Cluster-28040.6），2個編碼YUCCA的基因（Cluster-36192.0、Cluster-36192.1），2個編碼ALDH的基因（Cluster-32381.0、Cluster-28395.0）。

2.6 差異表達基因的qRT-PCR驗證

為驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準確性，選擇THS（Cluster-24362.0、Cluster-36994.3、Cluster-36129.3），AUX/IAA（Cluster-34981.0），GH3（Cluster-16885.9）， SAUR（Cluster-27535.0）， PYR/PYL（Cluster-37780.0），PP2C（Cluster-35278.2、Cluster-37953.0），ABF（Cluster-37916.2），B-ARR（Cluster-22704.8），TGA（Cluster-22719.0），AHK（Cluster-28287.0）進行qRT-PCR驗證（圖13：A）。結(jié)果表明，上述酶基因在BLG-CK2 vs BLG-S2、BLG-CK3 vs BLG-S3、BLG-CK4 vs BLG-S4中的表達趨勢與RNA-seq結(jié)果一致（P<0.05）（圖13：B），證明測序結(jié)果真實可靠。

3? 討論與結(jié)論

3.1 根腫菌侵染對菘藍根部的影響

Wei等（2021）研究表明，感染根腫菌的植株其根部會不斷膨大，直至變成大小形狀不一的腫瘤， 并且根部細胞會因為次級游動孢子的入侵而擠壓變形、體積增大。通常植株根部的腫大程度能反映其病情指數(shù)，根部細胞的變化情況能反映根腫菌的整個侵染過程。本研究連續(xù)21 d對根腫菌侵染菘藍的過程進行實時動態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)接菌后0、7、14、21 d菘藍病情指數(shù)不斷增加，分別為0級、1級、3級、5級；組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)在接種后7～14 d根腫菌能快速侵染菘藍根部細胞，為侵染高峰期，這與謝琪等（2022）的研究結(jié)果一致。而Wei等（2021）的研究在根腫菌侵染時間上與本研究結(jié)果有所出入，考慮到這可能與所研究的寄主和侵染條件不同有關(guān)。此外，本研究采取病情形態(tài)分級結(jié)合組織學(xué)觀察的方法，有利于從整體上觀察根腫菌侵染狀況，不僅為深入研究其他專性寄生病原菌作參照，也為后期生化指標、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)取樣時間提供了理論依據(jù)。

3.2 菘藍響應(yīng)根腫菌侵染生理生化指標的變化

根腫菌侵染下，菘藍植株自身會做出一系列的應(yīng)激反應(yīng)，這與Wang等（2020）的研究結(jié)果一致。本研究通過對接菌后0、7、14、21 d菘藍的生理生化指標進行測定，發(fā)現(xiàn)可溶性蛋白和丙二醛含量在根腫菌處理后14 d和21 d與未接菌相比含量均顯著增加，說明根腫菌侵染后期，植物受到的傷害程度更嚴重；根腫菌處理下菘藍抗氧化酶SOD、POD、CAT、PPO活性變化趨勢均不斷上升，說明菘藍通過增加抗氧化酶活性來抵御根腫菌對植物的傷害；CAT、SOD活性在接菌后7 d開始存在明顯差異，但POD、PPO活性于14 d出現(xiàn)顯著的差異，說明POD和PPO發(fā)揮作用相比較于前兩種防御酶SOD、CAT來說存在滯后性。這與鄭翠明等（1999）的相關(guān)報道一致。

3.3 根腫菌侵染對菘藍生物堿合成的影響

菘藍作為我國的大宗藥材，其吲哚類生物堿表告依春具有豐富的藥理活性。長春花（Catharanthus roseus）（林穎等，2020）、羅芙木（Rauvolfi serpentina）（Dey et al.， 2022）、鉤藤（Uncaria rhynchophylla）（劉揚等，2021）等植物已成為吲哚類生物堿合成研究的模式植物，菘藍中吲哚生物堿代謝途徑復(fù)雜多樣，其中色氨酸代謝是吲哚類生物堿合成的前體途徑（Huang et al.， 2016）。目前，關(guān)于菘藍中吲哚生物堿的合成機制、關(guān)鍵酶、多種基因功能的研究鮮見報道，并且有研究表明逆境脅迫能影響活性成分生物堿的積累（唐曉清等，2016；Jazayeri et al.， 2022）。因此，有必要深入研究根腫菌脅迫下菘藍吲哚類生物堿合成的分子機制。

代謝組學(xué)通過對接菌前后7、14、21 d菘藍根次級代謝產(chǎn)物生物堿進行OPLS-DA分析，發(fā)現(xiàn)不管是接菌處理（接菌和不接菌），還是取樣時間不同，代謝物都存在差異且次級代謝物以吲哚類生物堿居多。差異代謝物KEGG富集分析表明各組多富集在氨基酸代謝途徑尤其是色氨酸代謝，說明根腫菌侵染影響生物堿類化合物合成。進一步對BLG-CK2 vs BLG-S2、BLG-CK3 vs BLG-S3、BLG-CK4 vs BLG-S4這3個組別的差異表達基因進行KEGG代謝通路富集分析，篩選出了11條與生物堿合成相關(guān)的代謝通路， 其中色氨酸合成相關(guān)的差異表達基因數(shù)量較多。在此基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)錄加代謝聯(lián)合分析共挖掘到18個差異表達基因參與吲哚生物堿合成途徑上游的5種關(guān)鍵酶AS、TSA、TDC、YUCCA、ALDH，其中YUCCA和ALDH這2個關(guān)鍵酶的位置上存在差異表達基因上調(diào)的情況且上調(diào)顯著。本研究發(fā)現(xiàn)，與未接菌相比，接菌后YUCCA基因（Cluster-36192.0、Cluster-36192.1）表達量均升高，這與Cao等（2019）的研究結(jié)果一致，都呈現(xiàn)出對生物脅迫的耐受性；但隨著根腫菌侵染時間的不斷延長，YUCCA基因的表達量先升高再降低，這可能是植物自身對逆境脅迫做出的應(yīng)激反應(yīng)；ALDH（Cluster-32381.0、Cluster-28395.0）基因在接菌后相對比于未接菌，其表達量上調(diào)，這是因為醛脫氫酶基因家族可以氧化有毒醛類物質(zhì)，降低脂質(zhì)過氧化，提高植物對逆境的耐受性（Du et al.， 2022；Zhang et al.， 2023）。由于缺乏根腫菌脅迫下菘藍的全基因組，無法對吲哚類生物堿合成通路中的全部基因進行注釋分析，因此對下游完整的吲哚類生物堿合成通路研究造成困難。為此，后期可通過全基因測序和質(zhì)譜分析進一步探索完整的吲哚生物堿合成通路。

另外， 我們還發(fā)現(xiàn)了編碼2種關(guān)鍵酶的18個差異表達基因均在異喹啉生物堿合成通路中被注釋。目前THS酶的相關(guān)報道較少，但已經(jīng)確定是病程相關(guān)蛋白PR-10超家族成員之一（Ozber et al.， 2023）。本研究結(jié)果顯示編碼THS的3個差異表達基因（Cluster-24362.0、Cluster-36994.3、Cluster-36129.3 ）在根腫菌侵染后其表達量都會升高，并且在qRT-PCR驗證中也具有相同的表達趨勢，說明THS酶與抗根腫病密切相關(guān)，后期可著重分析THS酶的功能。酪氨酸是異喹啉生物堿合成的前體，其中酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（TAT）能催化酪氨酸合成4-羥基苯丙酮酸，現(xiàn)已在擬南芥（Lopukhina et al.， 2001）、丹參（Huang et al.， 2008）、紫蘇（呂曉玲等，2012）等植物成功分離克隆了TAT基因，并發(fā)現(xiàn)植物激素水楊酸和脫落酸處理后可在轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)該基因的表達。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)編碼TAT的基因Cluster-31730.0和Cluster-28040.6在根腫菌脅迫后表達量上升，說明TAT酶在脅迫中發(fā)揮重要作用。

qRT-PCR實驗結(jié)果表明，在根腫菌脅迫下，3個時間點菘藍實驗組與對照組相比，THS（薛京，2020）、AUX/IAA（Luo et al.， 2018）、GH3（Lu et al.， 2022）、SAUR（Li et al.， 2022）、PYR/PYL（Kim et al.， 2020）、PP2C（Yu et al.， 2019）、ABF（陳乃鈺等，2021）、B-ARR（Falconieri et al.， 2022）、TGA（Qi et al.， 2022）、AHK（Cerbantez-Bueno et al.， 2020）這些基因表達量都上調(diào)且隨著根腫菌侵入時間的延長，同一基因其表達量不斷降低，準確反映了根腫菌脅迫下大多數(shù)基因在菘藍中的表達模式。

綜上所述，對根腫菌侵染的菘藍進行轉(zhuǎn)錄組測序和代謝組分析，極大地豐富了根腫菌脅迫下菘藍的生物學(xué)信息，挖掘了參與吲哚類生物堿和

異喹啉類生物堿合成的關(guān)鍵基因，探討了這些關(guān)鍵基因在應(yīng)對逆境脅迫下的表達規(guī)律，為后續(xù)深入研究這些基因的功能、解析根腫菌脅迫下菘藍生物堿的積累機制奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯? 鄧斯麗）