閆海鋒 呂金鳳 熊發(fā)前 丘立杭 周慧文 陳興隆 馬國(guó)華

DOI： 10.11931/guihaia.gxzw202303054

閆海鋒， 呂金鳳， 熊發(fā)前， 等， 2024.

檀香NDH脫氫酶基因的克隆、定位與啟動(dòng)子分析 ［Ｊ］.

廣西植物， 44（5）： 951-960.

YAN HF， L JF， XIONG FQ， et al.， 2024.

Molecular cloning， location and promoter analysis of NDH dehydrogenase gene from Santalum album ［J］.

Guihaia， 44（5）： 951-960.

摘? 要：? 為研究檀香NDH脫氫酶基因的功能和調(diào)控機(jī)制，該文以檀香心材為材料，利用RACE技術(shù)克隆SaNDH6基因的全長(zhǎng)序列，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)分析其組織和激素處理后的表達(dá)模式，在擬南芥原生質(zhì)體觀測(cè)其亞細(xì)胞定位，利用PlantCARE分析SaNDH6起始密碼子ATG上游2 kb的啟動(dòng)子序列，同時(shí)運(yùn)用PlantRegMap預(yù)測(cè)可能與其結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果表明：（1）SaNDH6編碼303個(gè)氨基酸，為疏水蛋白，亞細(xì)胞定位于葉綠體。（2）進(jìn)化樹(shù)分析表明，檀香SaNDH6與木本植物NDH6進(jìn)化關(guān)系較近。（3）PlantCARE分析發(fā)現(xiàn)，SaNDH6啟動(dòng)子中除含有ACE、AE-box、Box 4、G-Box和GT1-motif等大量光響應(yīng)元件外，同時(shí)還有茉莉酸甲酯（MeJA）反應(yīng)元件CGTCA-motif和TGACG-motif，赤霉素（GA3）響應(yīng)元件P-box，以及防御和脅迫響應(yīng)元件TC-rich repeats等。（4）PlantRegMap分析發(fā)現(xiàn)，有76個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能與SaNDH6啟動(dòng)子結(jié)合，其中ERF家族最多，達(dá)40個(gè)。（5）SaNDH6在檀香的根、心材、葉片和愈傷組織中均有表達(dá)，其中在葉片中的表達(dá)量較高；用1×10-4 mol·L-1的MeJA和GA3分別處理檀香愈傷組織后，與處理前（0 h）相比，SaNDH6的表達(dá)均在3 h后顯著升高。綜上結(jié)果表明，檀香SaNDH6為核基因編碼的蛋白，受光和激素等誘導(dǎo)表達(dá)，SaNDH6可能參與檀香逆境脅迫反應(yīng)的過(guò)程。

關(guān)鍵詞： 檀香， 葉綠體， NDH脫氫酶， 亞細(xì)胞定位， 表達(dá)調(diào)控

中圖分類(lèi)號(hào)：? Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A

文章編號(hào)：? 1000-3142（2024）05-0951-10

收稿日期：? 2023-07-27? 接受日期： 2023-08-25

基金項(xiàng)目：? 國(guó)家自然科學(xué)基金（32060358）； 廣東省重點(diǎn)科技項(xiàng)目（2015B020231008）； 廣西自然科學(xué)基金（2019GXNSFAA185005）。

第一作者： 閆海鋒（1980—），博士，副研究員，主要從事林木分子生物學(xué)研究，（E-mail）gstsyhf@163.com。

*通信作者：? 馬國(guó)華，博士，研究員，主要從事植物生物技術(shù)研究，（E-mail）magh@scib.ac.cn。

Molecular cloning， location and promoter analysis of

NDH dehydrogenase gene from Santalum album

YAN Haifeng1，2，3， L Jinfeng4， XIONG Faqian1，2，3， QIU Lihang1，2，3，

ZHOU Huiwen1，2，3， CHEN Xinglong5， MA Guohua6*

（ 1. Sugarcane Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， China; 2. Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology

and Genetic Improvement， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Nanning 530007， China; 3. Key Laboratory of Guangxi

Sugarcane Genetic Improvement， Nanning 530007， China； 4. Guangxi Forestry Group Guiqinlin Pulp Paper Co. Ltd.，

Nanning 530012， China; 5. Agriculture College of Guangxi University， Nanning 530004， China; 6. South

China Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Guangzhou 510650， China ）

Abstract：? In order to investigate the function and regulation mechanism of NDH dehydrogenase gene in Santalum album， the technique of RACE was used to amplify the full-length sequence of SaNDH6 with heartwood as material. The technique of quantitative real-time fluorescence PCR （RT-qPCR） was employed to analyze its expression in different tissues and after hormone induction. The subcellular location was determined by Arabidopsis thaliana protoplast transient expression. 2 kb cis-acting element upstream of start codon ATG was analyzed by PlantCARE online service， and the transcription factors which could bind the cis-acting elements was predicted by PlantRegMap software. The results were as follows： （1） SaNDH6 encoded 303 amino acids. It was a hydrophobin and located in chloroplast. （2） The phylogenetic tree analysis indicated that SaNDH6 had a more closely evolutionary relationship with NDH6 from woody plants. （3） Plant care analysis showed that the promoter sequence of SaNDH6 contained a large number of light responsive cis-acting elements such as ACE， AE-box， Box 4， G-Box and GT1-motif. It also contained abscisic acid （ABA） responsive element ABRE， jasmonic acid methyl ester （MeJA） responsive elements CGTCA-motif and TGACG-motif， gibberellin （GA3） responsive elements P-box， ARE cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction， and TC-rich repeats element involved in defense and stress responsiveness. （4） The results of plantRegMap analysis showed that there were 76 transcription factors that could bind to the SaNDH6 promoter， and among which， ERF transcription factor was the most （up to 40 TFs）. （5） SaNDH6 can be expressed in the tissues of roots， heartwoods， calluses and leaves， but had a higher expression level in the tissue of leaves; under 1×10-4 mol·L-1 MeJA and GA3 treatments， the expression level of SaNDH6 were significantly elevated after 3 h when compared with 0 h， respectively. In conclusion， SaNDH6 was a nucleus gene encoding protein， its expression was induced by light and some hormones， and it? might be involved in against some defense and stress processes in S. album.

Key words： Santalum album， chloroplast， NDH dehydrogenase， subcellular location， expression regulation

光合作用中，從H2O到NADP+的線性電子傳遞可以同時(shí)產(chǎn)生ATP和NADPH，但產(chǎn)生的ATP/NADPH不足1.5，不能滿足卡爾文循的需要，這些不足的ATP由圍繞PSI的循環(huán)電子傳遞途徑進(jìn)行補(bǔ)償（Yamori & Shikanai， 2016）。被子植物中，依賴(lài)于NDH復(fù)合體的電子傳遞是圍繞PSI循環(huán)電子傳遞的途徑之一，其在植物的光合、呼吸、生長(zhǎng)以及在保護(hù)植物免受強(qiáng)光傷害和抵御低溫等逆境脅迫中均發(fā)揮作用（Endo et al.， 1999; Yamori et al.， 2011; Yamori & Shikanai， 2016）。因此，NDH復(fù)合體的研究越來(lái)越受關(guān)注。Shinozaki等（1986）和Ohyama（1996）分別通過(guò)煙草（Nicotiana tabacum）和地錢(qián)（Marchantia polymorpha）的葉綠體基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)了11個(gè)葉綠體編碼的NDH基因，雖然這些基因與線粒體NDH基因同源，但葉綠體NDH主要從鐵氧化還原蛋白（Fd）接受電子（Ifuku et al.， 2011; Yamamoto et al.， 2011; Shikanai， 2016）。進(jìn)一步研究表明，除以上11個(gè)基因外，許多葉綠體NDH復(fù)合體基因是由其核基因組編碼的（Sirpio et al.， 2009; Yamori et al.， 2011; Shikanai， 2016）。目前，在擬南芥中共鑒定了30多個(gè)NDH復(fù)合體基因，總體可以分為5類(lèi)（Armbruster et al.， 2013; Fan et al.， 2015; Peltier et al.， 2016）。SubA由7個(gè)基因組成，其中4個(gè)由葉綠體基因組編碼（NdhH-NdhK），另外3個(gè)由核基因組編碼（NdhM-NdhO），均與電子傳遞到輔酶Q有關(guān)（He et al.， 2015）；SubM的6個(gè)成員（NdhA-NdhG）均由葉綠體基因組編碼，它們?cè)谀ぶ袠?gòu)成了復(fù)合體臂并參與電子在膜中的傳遞；SubB（PnsB1-PnsB5）和SubL（PnsL1-PnsL5）的成員均由核基因組編碼且都是葉綠體NDH復(fù)合體所特有的組分，SubB可能與維持NDH復(fù)合體的穩(wěn)定有關(guān)（Peng et al.， 2009; Takabayashi et al.， 2009），SubL可以維持NDH-PSI復(fù)合體的穩(wěn)定性（Peltier et al.， 2016）；SubED（NdhS、 NdhV、 NdhT和 NdhU）也由核基因組編碼，其均能與SubA相互作用形成Fd結(jié)合位點(diǎn)（Yamamoto et al.， 2011; Peltier et al.， 2016）。高等植物在進(jìn)化過(guò)程中NDH與PSI形成了復(fù)合體，從而提高了電子傳遞效率并在逆境條件下有利于NDH復(fù)合體的結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定，擬南芥Lhca5和Lhca6在此復(fù)合體的形成中起連接作用，并且Lhca6還能夠穩(wěn)定NDH復(fù)合體的結(jié)構(gòu)（Peng et al.， 2009）。最近Otani等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，有更多捕光復(fù)合體I蛋白分子參與了NDH-PSI復(fù)合體的形成，這些蛋白分子包括Lhca1、2、3、4，它們通過(guò)不同組合形成2個(gè)復(fù)合體，從而連接NDH和PSI。目前對(duì)NDH復(fù)合體的結(jié)構(gòu)已有較為深入的研究，但一些組成亞基，特別是與NDH-PSI復(fù)合體結(jié)合并不緊密的組分仍然知之甚少，同時(shí)對(duì)其功能和調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步探究（Fan et al.， 2015）。

檀香（Santalum album）是分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)的半寄生性珍貴林木，其木材不僅質(zhì)地堅(jiān)韌優(yōu)良，還含有芳香精油，被廣泛應(yīng)用于香料、香薰、雕刻和醫(yī)藥等方面，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值（Baldovini et al.， 2011）。當(dāng)前，關(guān)于檀香的研究主要集中在其精油的合成和調(diào)控等方面，對(duì)其光合特性的研究十分缺乏。NDH復(fù)合體是檀香光合作用時(shí)進(jìn)行電子傳遞的重要組分，由哪些基因組成，這些基因的功能和調(diào)控如何，關(guān)于這些科學(xué)問(wèn)題目前并不明確。本文以檀香木質(zhì)部為材料，采用分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)方法，通過(guò)檀香SaNDH6基因的克隆、進(jìn)化樹(shù)、亞細(xì)胞定位、組織表達(dá)模式、啟動(dòng)子順式作用元件和可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子分析，探討SaNDH6在檀香NDH復(fù)合體中的具體定位和可能的作用，分析其表達(dá)調(diào)控模式和其在逆境脅迫中可能發(fā)揮的作用，為檀香NDH復(fù)合體在光合作用以及逆境脅迫中的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1 植物材料和處理

檀香葉片、根和心材均取自中國(guó)科學(xué)院華南植物園檀香種植基地的7齡檀香樹(shù)（至少選擇3棵正常生長(zhǎng)樹(shù)木進(jìn)行取材），液氮速凍后帶回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存。取檀香嫩枝為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，誘導(dǎo)參照Singh等（2015）和Yan等（2018）的方法。在超凈臺(tái)稱(chēng)取等量檀香愈傷組織置于MS液體培養(yǎng)基中，在25 ℃、100 r·min-1條件下黑暗培養(yǎng)24 h，之后分別加入終濃度為1×10-4 mol·L-1的茉莉酸甲酯溶液（MeJA）和赤霉素溶液（GA3），分別在0、3、6 h取樣，液氮速凍后置于-80 ℃保存以提取RNA。每處理均設(shè)置3次重復(fù)。

1.2 SaNDH6的克隆

采用提取木本植物RNA方法（Kolosova et al.， 2004）提取檀香心材總RNA，用NanoDrop ND-1000 分光光度計(jì)（Nanodrop Technologies， Wilmington， NC， USA）和1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取RNA的質(zhì)量和完整性。

采用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit（Clontech Laboratories Inc.， CA， USA）擴(kuò)增SaNDH6的全長(zhǎng)序列，用巢式PCR進(jìn)行RACE擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行回收，連接PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α，挑取陽(yáng)性克隆到北京華大基因公司（深圳）測(cè)序?；蛉L(zhǎng)擴(kuò)增（3′ RACE、5′ RACE和ORF）引物見(jiàn)表1。

1.3 SaNDH6的生物信息學(xué)分析

SaNDH6的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)用Expy Protparat （https：//web.expasy.org/cgibin/ Protparam.htmL），亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)利用 plant-mPlo（http：//www.csbio. sjtu.edu. cn/bioinf/plant-multi/）。不同植物NDH亞基的氨基酸序列比對(duì)用DNAMAN軟件，通過(guò)MEGA 6.0的鄰位相連法（N-J法）建立不同植物NDH基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.4 SaNDH6的亞細(xì)胞定位

檀香基因組序列從NCBI下載，下載序列號(hào)為GCA_002925775.1（Mahesh et al.， 2018），參照玉米、水稻和擬南芥基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行相應(yīng)注釋?zhuān)缓筇崛aNDH6基因的啟動(dòng)子序列，并用PlantCARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be /webtools /plantcare/html/）進(jìn)行分析。啟動(dòng)子TF結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)利用PlantRegMap： Plant Regulation Data and Analysis Platform @ CBI， PKU （ http：//plantregmap.cbi.pku.edu.cn/binding_site_prediction.php）進(jìn)行分析。

擴(kuò)增SaNDH6的ORF序列（去除終止密碼子），利用In-fusion技術(shù)構(gòu)建35S： SaNDH6： pSAT6-EYFP-N1亞細(xì)胞定位載體， 測(cè)序確認(rèn)后按照Yoo 等（2007）的方法進(jìn)行擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，在22 ℃、弱光下培養(yǎng)12 h 后利用激光共聚焦掃描電鏡（Zeiss， Jena， Germany）觀察并拍照。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

用1.1所述的方法分別提取檀香葉片、心材、根和愈傷組織總RNA，用RNase free DNase I（TaKaRa， Japan）進(jìn)行處理，以確保無(wú)DNA污染。用A260/A280在1.9 到2.1、A260/A230大于 2.0且電泳后條帶完整的1 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。獲得的cDNA用無(wú)核酸酶的水稀釋10倍后置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

RT-qPCR用ABI 7500 Real-time system （ABI， Alameda， CA， USA）進(jìn)行測(cè)定。反應(yīng)試劑采用 SoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix detection system （Bio-Rad， Hercules， CA， USA）。反應(yīng)體系：SYBR Green Supermix 5 μL，引物 （1×10-5 mol·L-1）各0.5 μL， cDNA 1 μL，加入ddH2O至總體系達(dá)到10 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2 min， 95 ℃變性15 s，60 ℃退火 1 min，40 個(gè)循環(huán)。按照Yan等（2018）的方法選取相應(yīng)內(nèi)參基因，不同組織中利用SaFAB1A+SaPP2C，MeJA處理利用SaCSA+SaFbp3，GA3處理利用SaPP2C+ SaFbp2作為內(nèi)參基因，以?xún)蓚€(gè)相應(yīng)內(nèi)參基因表達(dá)量的算術(shù)平均值作為內(nèi)參基因的最終表達(dá)量值分別進(jìn)行校正。每個(gè)樣品均設(shè)置3次重復(fù)，最后用2-ΔΔCt方法分析定量數(shù)據(jù)。RT-qPCR所用引物見(jiàn)表1。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 19.0（IBM Corp.， Armonk， NY， USA）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。多重比較采用鄧肯式新復(fù)極差法（P<0.05）。

2? 結(jié)果與分析

2.1 SaNDH6的克隆

根據(jù)檀香轉(zhuǎn)錄組注釋的NDH脫氫酶Unigene設(shè)計(jì)引物，3′ RACE擴(kuò)增后得到一條528 bp的特異條帶（圖1：A），5′ RACE擴(kuò)增后得到一條317 bp的特異條帶（圖1：B），經(jīng)測(cè)序后均能與已有序列正確拼接，并且在3′端有Poly A序列，說(shuō)明正確地得到了其3′和5′端序列。經(jīng)NCBI ORF Finder分析并拼接后，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增后得到了一條912 bp的目標(biāo)條帶（圖1：C），測(cè)序后得到了目標(biāo)序列，并命名為SaNDH6。

2.2 SaNDH6的生物信息學(xué)分析

SaNDH6編碼303個(gè)氨基酸（圖2），蛋白分子量為33.75 kDa，理論等電點(diǎn)為9.31，含有28個(gè)酸性氨基酸和45個(gè)堿性氨基酸，帶電氨基酸共有76個(gè)，極性不帶電氨基酸共有79個(gè)，并且含有160個(gè)疏水氨基酸，說(shuō)明其為疏水蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明其可能定位于葉綠體。

從NCBI下載不同植物NDH亞基的氨基酸序列，利用DNAMAN進(jìn)行多重序列比對(duì)。由圖3可知，檀香SaNDH6與桃（Prunus persica）PpNdh6的序列相似度為53.46%，與芝麻（Sesamum indicum）SiNdh6的相似度為52.60%，與木薯（Manihot esculenta）MeNdh6和白牧豆樹(shù)（Prosopis alba）PaNdh6的相似度均為51.84%，與葡萄（Vitis vinifera）VvNdh6的序列相似性為51.30%，說(shuō)明我們正確地克隆到了檀香NDH復(fù)合體6的基因。

利用MEGA 6.0對(duì)不同植物NDH亞基的氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，由圖4可知，檀香SaNDH6與SiNdh6和VvNdh6聚為一類(lèi)，這與多重序列比對(duì)結(jié)果較為一致；同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)SaNDH6與葡萄、甜櫻桃（Prunus avium）、川桑（Morus notabilis）、毛果楊（Populus trichocarpa）、麻風(fēng)樹(shù)（Jatropha curcas）和橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis）等木本植物NDH6的進(jìn)化關(guān)系均較近。

2.3 SaNDH6的亞細(xì)胞定位

將檀香SaNDH6亞細(xì)胞定位載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化到擬南芥原生質(zhì)體，同時(shí)以轉(zhuǎn)化YFP空載體為對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化的35S： SaNDH6： pSAT6-EYFP-N1和YFP空載體均出現(xiàn)黃色熒光蛋白，說(shuō)明轉(zhuǎn)化過(guò)程可靠。35S： SaNDH6： pSAT6-EYFP-N1融合蛋白的黃色熒光主要分布在葉綠體上，說(shuō)明SaNDH6蛋白定位于葉綠體（圖5），與亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

2.4? SaNDH6的組織表達(dá)

由圖6可知，SaNDH6在檀香的根、 心材、葉片和愈傷組織中均有表達(dá)，其中在葉片中的表達(dá)量較高，其次為愈傷組織，在其余兩種組織中的表達(dá)量均相對(duì)較低。

2.5 SaNDH6的啟動(dòng)子分析

檀香基因組數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)注釋后，我們提取了SaNDH6基因起始密碼子ATG上游2 000 bp的啟動(dòng)子序列。經(jīng)過(guò)PlantCARE分析發(fā)現(xiàn)，其含有大量的光響應(yīng)元件，如ACE、AE-box、Box 4、G-Box、GT1-motif、LAMP-element、MRE、TCT-motif和chs-CMA1a，說(shuō)明SaNDH6的表達(dá)主要受光的誘導(dǎo)。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)一些激素響應(yīng)元件，如脫落酸（ABA）響應(yīng)元件ABRE、MeJA響應(yīng)元件CGTCA-motif和TGACG-motif、赤霉素響應(yīng)元件P-box，說(shuō)明SaNDH6的表達(dá)可能也受這些激素的調(diào)控。此外，還發(fā)現(xiàn)一些逆境響應(yīng)元件，如厭氧誘導(dǎo)元件ARE、防御和脅迫響應(yīng)元件TC-rich repeats等，說(shuō)明SaNDH6可能參與檀香的一些逆境脅迫反應(yīng)過(guò)程（圖7）。

2.6 可能結(jié)合SaNDH6的轉(zhuǎn)錄因子分析

通過(guò)PlantRegMap分析（圖8）發(fā)現(xiàn)，有76個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能與SaNDH6啟動(dòng)子結(jié)合，其中ERF家族轉(zhuǎn)錄因子最多，共有40個(gè)；其次為B3類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，共有13個(gè)；MIKC_MADS和AP2類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子分別有5個(gè)和4個(gè)；而FAR1和MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子最少，分別只有1個(gè)。這說(shuō)明SaNDH6基因的表達(dá)主要受到ERF和B3類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的直接調(diào)控。

2.7 不同激素處理后SaNDH6的表達(dá)分析

SaNDH6啟動(dòng)子中分別含有激素MeJA和GA3的響應(yīng)元件，預(yù)示著這兩種激素可能對(duì)SaNDH6的表達(dá)有誘導(dǎo)作用。為證明這一猜想，我們用1×10-4 mol·L-1的MeJA和GA3分別處理檀香愈傷組織，SaNDH6表達(dá)結(jié)果（圖9）顯示，與0 h相比，MeJA和GA3處理3 h后SaNDH6的表達(dá)均顯著升高，說(shuō)明MeJA和GA3均可正向誘導(dǎo)SaNDH6的表達(dá)。

3? 討論與結(jié)論

3.1 SaNDH6在檀香NDH復(fù)合體中的定位

葉綠體NDH脫氫酶是多個(gè)亞基組成的內(nèi)囊體膜蛋白復(fù)合物，其包括11個(gè)葉綠體基因組編碼的亞基和至少19個(gè)核基因組編碼的亞基，至少有16個(gè)基因參與其合成過(guò)程（Ifuku et al.， 2011; Yamori & Shikanai， 2016）。本研究檀香中克隆了SaNDH6，通過(guò)BLAST搜索發(fā)現(xiàn)其與多種植物的NDH6亞基具有很高的序列相似性，并且其與木本植物的NDH6進(jìn)化關(guān)系較近。序列分析表明SaNDH6

為疏水蛋白，亞細(xì)胞定位顯示其定位于葉綠體，說(shuō)明SaNDH6通過(guò)定位在葉綠體的內(nèi)囊體膜上行駛功能。SaNDH6在檀香葉片中的表達(dá)量較高，但除葉片之外，其在不含有葉綠體的心材、根和愈傷組織中均有表達(dá)，據(jù)此我們推測(cè)SaNDH6是核基因編碼的蛋白。

3.2 SaNDH6表達(dá)的調(diào)控

轉(zhuǎn)錄調(diào)控在促進(jìn)或者抑制基因表達(dá)中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，其主要由基因的啟動(dòng)子和位于啟動(dòng)子中的順式作用元件所控制（Zou et al.， 2011; Hernandez-Garcia & Finer， 2014）。目前，關(guān)于葉綠體NDH復(fù)合體表達(dá)調(diào)控的研究鮮有報(bào)道。我們通過(guò)分析SaNDH6起始密碼子ATG上游2 kb的啟動(dòng)子序列后發(fā)現(xiàn)，SaNDH6啟動(dòng)子中含有大量的光響應(yīng)元件，說(shuō)明光對(duì)其表達(dá)起到主要的調(diào)控作用，與其主要參與光合作用的功能相一致。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，

不同字母表示顯著性差異（P<0.05）。下同。

Different letters indicate significant differences （P<0.05）. The same below.

SaNDH6的表達(dá)也受到GA3和JA等激素的正向調(diào)控。Romanowska等（1984）、Tsai和Arteca等（1985）研究表明，外施GA3可以提高一些植物的生長(zhǎng)速率和光合效率，說(shuō)明GA3可能通過(guò)調(diào)控SaNDH6的表達(dá)參與檀香的光合作用過(guò)程。JA除了特異性地調(diào)控植物在昆蟲(chóng)取食和死體營(yíng)養(yǎng)性病原菌侵染的反應(yīng)過(guò)程外（Wasternack， 2015），還參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抵御非生物脅迫等逆境反應(yīng)過(guò)程（Qiu et al.， 2014; Per et al.， 2018）。目前，NDH復(fù)合體參與病原菌侵染等生物脅迫反應(yīng)方面的研究很少，但其在抵御非生物脅迫方面已有大量報(bào)道（Yamori & Shikanai， 2016）。因此，我們推測(cè)JA可能主要通過(guò)調(diào)控SaNDH6的表達(dá)參與檀香對(duì)一些非生物脅迫的反應(yīng)過(guò)程，但具體的作用和機(jī)制還需探究和驗(yàn)證。

3.3 SaNDH6在逆境脅迫中發(fā)揮作用

通過(guò)NDH的電子傳遞和依賴(lài)于PGR5/PGRL1的電子傳遞之間存在部分功能冗余，在正常生長(zhǎng)環(huán)境下，NDH復(fù)合體的突變并不能產(chǎn)生明顯的表型變化（Munekage et al.， 2004; Yamori & Shikanai， 2016）。但是深入研究表明，NDH復(fù)合體在植物抵御多種逆境脅迫中發(fā)揮作用。Hibino等（1996）發(fā)現(xiàn)，高鹽可以特異地誘導(dǎo)耐鹽藍(lán)細(xì)菌（Aphanothece halophytica）循環(huán)電子傳遞蛋白的表達(dá)，增加依賴(lài)于NDH的電子傳遞， 從而使其能夠適應(yīng)高鹽環(huán)境；Zhao等（2017）研究證明，在多種環(huán)境脅迫下，集胞藻NDH-1能夠維持PSI結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定；Li等（2004）等將煙草置于低溫（4 ℃）和低光照強(qiáng)度（100 mol·m-2·s-1）環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)ndhB突變體的最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）和PS Ⅱ驅(qū)動(dòng)的電子傳遞效率都顯著低于野生型植株，推測(cè)低溫和弱光環(huán)境中依賴(lài)于NDH的電子傳遞對(duì)光合器官有保護(hù)作用； Wang等（2006）研究了不同溫度處理后野生型和NDH突變體ndhC-ndhK-ndhJ （DndhCKJ） 煙草植株活性氧積累的差異，發(fā)現(xiàn)NDH通過(guò)電子傳遞提高了CO2的同化作用，從而減少了高溫脅迫引起活性氧的產(chǎn)生。綜上研究表明，植物在強(qiáng)/弱光、高/低溫、高鹽和低濕等逆境下，依賴(lài)于NDH的電子傳遞在維持光合系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、促進(jìn)CO2的同化、避免內(nèi)囊體基質(zhì)的過(guò)度還原、減少H2O2的產(chǎn)生以及維持正常的光合速率等方面發(fā)揮作用。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)檀香SaNDH6啟動(dòng)子中也含有一些參與逆境響應(yīng)的元件，如JA和ABA的響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)元件、防御和脅迫響應(yīng)元件等。其中，MeJA的響應(yīng)原件最多，共有4個(gè)（TGACG-motif和 CGTCA-motif分別各有2個(gè)），其次為與干旱脅迫密切相關(guān)的反應(yīng)原件，共有3個(gè)（ABRE 2個(gè)，MBS 1個(gè)）。結(jié)合前人研究結(jié)果我們推測(cè)SaNDH6除了主要進(jìn)行光合作用外，還參與檀香的干旱脅迫等逆境反應(yīng)過(guò)程。

綜上所述，本研究克隆了檀香葉綠體NDH脫氫酶亞基基因SaNDH6，其編碼303個(gè)氨基酸，定位于葉綠體，與擬南芥葉綠體NDH脫氫酶的核基因編碼亞基具有較近的進(jìn)化關(guān)系。SaNDH6啟動(dòng)子中含有大量光響應(yīng)元件、一些激素響應(yīng)元件和參與逆境脅迫反應(yīng)的元件，ERF和B3類(lèi)等轉(zhuǎn)錄因子可能直接結(jié)合該基因的啟動(dòng)子從而調(diào)控其表達(dá)，組織表達(dá)結(jié)果顯示該基因在檀香的葉片中表達(dá)量較高，同時(shí)其表達(dá)可以被MeJA 和GA3顯著誘導(dǎo)。

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（責(zé)任編輯? 李? 莉? 王登惠）