車 琦， 王繼華， 崔 紅， 黃 涵

哈爾濱師范大學(xué)， 黑龍江 哈爾濱 150025

抗生素的不合理與大量使用，在全球范圍內(nèi)引起廣泛關(guān)注，已被視為對生物體和人類健康的新威脅[1]. 磺胺類藥物(sulfonamides, SAs)價廉、廣譜，廣泛用于畜牧、醫(yī)藥臨床等領(lǐng)域，且可以通過甲氧芐啶(trimethoprim, TMP)提高其抗菌活性，增強普遍適用性，擴(kuò)大抗菌治療范圍[2-4]. SAs因在體內(nèi)不能完全代謝，30%～90%的母體大分子會隨代謝廢物進(jìn)入環(huán)境[5-6]，且難以被自然降解[7]，已在各類水環(huán)境中檢測出其殘留濃度在ng/L～mg/L級別[8-9]. 磺胺二甲嘧啶(sulfadimidine, SMZ)作為典型的SAs，廣泛用于動物疾病的防御與治療[10]. 在自然水體中的殘存濃度最高可達(dá)104ng/L，風(fēng)險較高[11-14]，且極易誘發(fā)和傳播抗性菌(antibiotics resistance bacteria, ARB)及抗性基因(antibiotics resistance genes, ARGs)[15-17]. 同時，ARB消亡后，其攜帶ARGs的裸露DNA可在微生物之間再次傳播[18-20].

抗生素抗性數(shù)據(jù)庫(comprehensive antibiotic resistance database, CARD)已列示的19個磺胺類ARB屬中，不動桿菌屬(Acinetobacter)和假單胞菌屬(Pseudomonas)具備多重抗性[21-23]. 研究[24-25]發(fā)現(xiàn)，ARB攜帶的磺胺類ARGs主要有sul1、sul2和sul3，sul1基因組成Int1基因的3′保守區(qū)段，sul2、sul3基因在菌株質(zhì)粒中被發(fā)現(xiàn)[26]. TMP的ARGs主要包括dfrA與dfrB兩大類，載體為整盒子，與磺胺類ARGs共存[27]. Wang等[21]在不動桿菌屬、芽孢桿菌屬和無色桿菌屬中均檢測到磺胺類ARGssul1、sul2、sul3以及甲氧芐啶ARGsdfrA. Smiline等[22]對鮑曼不動桿菌編碼ARGs質(zhì)粒的研究發(fā)現(xiàn)，編碼dfrA1基因的ARB有17.8%同時編碼sul1、sul2基因，均可由質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等可移動元件介導(dǎo)傳播，且SAs的抗性機制與dfrA1、sul1和sul2基因的遺傳有關(guān)[28]. 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ARB可通過改變藥物作用靶位、主動外排藥物、改變孔蛋白阻止抗生素滲透等機制對抗生素產(chǎn)生抗性[29]. 而SAs導(dǎo)致細(xì)菌抗性的機制主要是ARGs編碼蛋白改變藥物“旁路”代謝途徑[30-31].

目前，地下水中SAs污染的研究主要集中在SAs的檢測、ARGs檢出水平及生態(tài)風(fēng)險評價等方面[32-33]. 該研究基于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)從地下水中篩得一株SMZ抗性菌，在形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗、16S rRNA 基因測序的基礎(chǔ)上，通過熒光定量PCR與普通PCR定量對磺胺類ARGs、甲氧芐啶ARGs以及Int1基因進(jìn)行檢測，結(jié)合NCBI同源性比對、KEGG功能注釋，分析其抗性特性及抗性機制，以期為研究地下水中SAs抗性菌的環(huán)境行為、抗性機制以及抗生素風(fēng)險評估提供數(shù)據(jù)支持.

1 材料與方法

1.1 水樣的采集與處理

地下水樣取自北京市東南發(fā)展區(qū)地下水監(jiān)測井(60～80 m)，取樣容器經(jīng)甲醇(Thermo Fisher Scientific, AR)和乙醇(>95%，AR)多次潤洗，樣品采集后保存在冰盒中運回實驗室. 一部分樣品經(jīng)過濾、調(diào)節(jié)pH、加內(nèi)標(biāo)后，在24 h之內(nèi)完成固相萃取，萃取后的樣品采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測SAs殘留；另一部分樣品經(jīng)4 ℃保存，用于微生物篩選.

由圖1(a)可知，地下水樣品中除TMP外共檢測到7種SAs，分別為磺胺地索辛(SDM)、磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺芐胺(SML)、磺胺二甲嘧啶(SMZ)、磺胺甲基嘧啶(SMR)、磺胺甲惡唑(SMX)和磺胺噻唑(STZ)，其中SMZ檢出濃度最高，為 11 112 ng/L. 根據(jù)Verlicchi等[34-35]提出的風(fēng)險熵(risk quotiet，RQ)評估模型，將RQ值劃分為生態(tài)風(fēng)險的3個級別(RQ>1 表示高風(fēng)險，0.11，為潛在高風(fēng)險優(yōu)先管控物質(zhì)〔見圖1(b)〕.

1.2 SMZ抗性菌的富集、分離、純化

SMZ儲備液：以甲醇做溶劑，經(jīng)0.22 μm濾膜(津騰)過濾后避光保存在4 ℃冰箱，保存時間不超過7 d.

培養(yǎng)基：液體LB肉湯培養(yǎng)基和固體LB肉湯培養(yǎng)基中添加SMZ儲備液用于菌株的富集與篩選.

取10 mL地下水樣品，加入到90 mL液體LB培養(yǎng)基中，SMZ的濃度為1 mg/L，置于恒溫水浴振蕩培養(yǎng)箱(37 ℃、150 r/min)中培養(yǎng)15 d，完成第1周期富集. 利用高速冷凍離心機，PBS緩沖液制備第1周期菌懸液，取10 mL菌懸液，同第1周期培養(yǎng)條件進(jìn)行第2周期的富集，此時SMZ的濃度為5 mg/L. 按照上述方法，依次完成后續(xù)3個周期的富集，SMZ濃度梯度依次為10、15、20 mg/L. 取第5周期富集液，用滅菌的生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，均勻涂布于SMZ濃度為20 mg/L的固體LB培養(yǎng)基平板上，在37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，挑取單菌落進(jìn)行菌株純化，最終篩得一株SMZ抗性菌，命名為SMZ-R9.

1.3 SMZ抗性菌的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察：菌株置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌株純化過程中形成單菌落的大小、顏色、形狀、邊緣、質(zhì)地、透明度等，并通過革蘭氏染色記錄菌株細(xì)胞大小.

生理生化試驗：測定微生物增殖過程中代謝產(chǎn)物的生理生化反應(yīng)是微生物分類鑒定的重要依據(jù)，觀察某些化學(xué)反應(yīng)，如糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)堿、檸檬酸鹽產(chǎn)酸產(chǎn)堿、甲基紅產(chǎn)酸、硝酸鹽還原、伏普糖代謝、尿素酶、接觸酶、氧化酶、淀粉酶酶催化等固有現(xiàn)象進(jìn)行試驗鑒定，試驗結(jié)果參考《伯杰氏鑒定手冊》.

分子生物學(xué)鑒定(16S rRNA)：將固體LB培養(yǎng)基上分離得到的純種菌株進(jìn)行16S rRNA基因序列測定(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，利用NCBI數(shù)據(jù)庫對測序結(jié)果進(jìn)行同源性比對，選取10條以上同源性較高的序列，利用MEGAX軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.4 菌株抗性特征及機制分析

以3種磺胺類ARGs、2種甲氧芐啶ARGs以及Int1基因為目標(biāo)基因，對SMZ-R9菌株中的ARGs進(jìn)行熒光定量PCR(BioRad CFX96 Touch，美國)檢測. 引物信息如表1所示.

表1 ARGs引物信息

qPCR采用20 μL體系，包含10.0 μL SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)，引物各0.4 μL，DNA模板1 μL及ddH2O 8.2 μL. 反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性1～2 min，95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán). 溶解曲線溫度為55～95 ℃，每0.5 ℃讀數(shù)一次，期間停留30 s，測定時將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒以10倍梯度稀釋，再根據(jù)質(zhì)粒濃度計算得到標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)，多次重復(fù)，計算檢出率.

近年來，基于試驗方法的優(yōu)化，蛋白質(zhì)功能預(yù)測準(zhǔn)確性提高，利用蛋白質(zhì)同源性分析或結(jié)合結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫Cdd[36]、Pfam[37]等進(jìn)行功能注釋研究時發(fā)現(xiàn)，同源性蛋白擁有相似甚至相同的生化功能[38]. 因此，將菌株SMZ-R9檢出率最高的磺胺類ARGs和甲氧芐啶ARGs作為目的基因進(jìn)行普通PCR定性檢測，并對核酸序列進(jìn)行解析獲得蛋白序列信息，通過NCBI數(shù)據(jù)庫與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列同源性比對與功能注釋，解析菌株SMZ-R9的SAs抗性特征及抗性機制.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株鑒定

如圖2(a)菌落形態(tài)所示，菌株SMZ-R9的菌落呈現(xiàn)暗白色、圓形、有黏性、邊緣不齊無光澤；如圖2(b)細(xì)胞形態(tài)所示，菌株細(xì)胞呈短桿狀，革蘭氏染色鑒定為陰性菌. 如表2所示，氧化酶反應(yīng)、硝酸鹽反應(yīng)呈陰性，接觸酶反應(yīng)呈陽性，糖發(fā)酵不產(chǎn)堿，參照《伯杰氏鑒定手冊》，初步判定與不動桿菌屬生理生化特征較為相似. 經(jīng)16S rRNA基因測序及序列同源性比對，SMZ-R9與多株不動桿菌的序列相似性較高；根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析(見圖3)發(fā)現(xiàn)，SMZ-R9與Acinetobacterlactucaestrain同源性為97%. 因此，鑒定菌株SMZ-R9為乳酸不動桿菌(Acinetobacterlactucae).

圖2 菌株SMZ-R9形態(tài)學(xué)鑒定

表2 菌株SMZ-R9生理生化鑒定結(jié)果

圖3 菌株SMZ-R9的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 抗性特征分析

如表3所示：菌株SMZ-R9磺胺類ARGssul2檢出率最高，為69.05%，sul3基因檢出率最低，為19.05%；Int1、sul1基因檢出率分別為54.76%與64.29%，可能與sul1基因與Int1基因片段重合有關(guān)[26]；甲氧芐啶ARGsdfrA1檢出率為40.48%，dfrA12未檢出.

表3 SMZ-R9菌株ARGs檢出率

以檢出率最高的磺胺類ARGssul2和甲氧芐啶ARGsdfrA1作為目的基因，進(jìn)行基因擴(kuò)增測序、序列解析及同源性分析，結(jié)果如圖4所示. 由圖4(a)可見，sul2基因編碼蛋白與鮑曼不動桿菌二氫蝶呤合成酶(DHPs，QBR76772.1)、二氫蝶呤合成酶(sul1)(DHPs，AAA22697.1)的同源性均為100%. DHPs是一種功能性同型二聚體，在生物合成葉酸的過程中催化對氨基苯甲酸(pABA)的縮合，是核酸和蛋白質(zhì)生物合成中不可或缺的輔助因子[39]. 如圖4(b)所示，dfrA1基因編碼蛋白與耐甲氧芐啶二氫葉酸還原酶(DHFR，WP010890144.1)的同源性為99%. DHFR是一種質(zhì)粒編碼的酶，參與介導(dǎo)細(xì)菌的抗性，與染色體編碼的DHFR有一定的相似性[40].

圖4 SMZ-R9菌株ARGs蛋白同源性比對

2.3 抗性機制分析

葉酸參與微生物的生物合成與氨基酸代謝，在SAs環(huán)境壓力下，菌株SMZ-R9體內(nèi)四氫葉酸的合成受磺胺類ARGssul2和甲氧芐啶ARGsdfrA1的調(diào)控. 如圖5所示，SAs與pABA具有相似結(jié)構(gòu)，與底物pABA競爭蝶啶結(jié)合位點，導(dǎo)致細(xì)菌體內(nèi)葉酸合成受阻，細(xì)菌生長、繁殖受挫[41-42]. SMZ-R9質(zhì)粒基因sul2編碼產(chǎn)生DHPs(EC 2.5.1.15)，可作為二氫葉酸前體二氫蝶酸合成的關(guān)鍵酶，催化蝶啶與pABA合成二氫蝶酸，導(dǎo)致SAs競爭抑制降低，葉酸上游合成途徑不受影響，SMZ-R9對SAs獲得抗性. 部分研究也在革蘭氏陽性細(xì)菌中分離出由sul1和sul2編碼的DHPS1型和DHPS2型產(chǎn)物[43].

圖5 SMZ-R9菌株抗性機制分析

SAs的靶標(biāo)DHPs是葉酸途徑中DHFR的上游酶[44]，TMP是一種二氨基嘧啶類藥物，與SAs之間起協(xié)同作用，以高于二氫葉酸的親和力與DHFR結(jié)合，抑制酶的活性，干擾葉酸合成的下游途徑[45]. 菌株SMZ-R9攜帶的dfrA1屬于A類dfr基因家族，這些基因間氨基酸序列有64%～88%的同源性，介導(dǎo)高水平的抗性[46].dfrA1編碼產(chǎn)生的DHFR(EC 1.5.1.3)即甲氧芐啶抗性蛋白，催化SMZ-R9菌株葉酸合成下游途徑，促使二氫葉酸還原成四氫葉酸，參與生物合成及代謝. 以上研究表明，sul2基因與dfrA1基因表達(dá)產(chǎn)物催化菌株SMZ-R9的葉酸正常合成，生物合成與代謝得以順利進(jìn)行，細(xì)菌生長、繁殖未受SAs影響，即對SAs產(chǎn)生抗性.

3 結(jié)論

a) 從地下水中篩得一株SMZ抗性菌SMZ-R9，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗及16S rRNA基因測序鑒定后，確定為乳酸不動桿菌(Acinetobacterlactucae)，屬于革蘭氏陰性細(xì)菌.

b) SMZ-R9同時攜帶3種磺胺類ARGs(sul1、sul2、sul3)、1種甲氧芐啶ARGs(dfrA1)以及Int1基因.

c)sul2、dfrA1基因為編碼DHPs與DHFR的核酸序列，表達(dá)產(chǎn)物分別催化葉酸合成的上游途徑，pABA與蝶啶反應(yīng)生成二氫蝶呤，以及下游途徑二氫葉酸還原成四氫葉酸，共同介導(dǎo)菌株SMZ-R9的SAs抗性.