陳善軍 王歡 胡凱慶 畢文杰 程貴東 王松松 韓利文 王曉靜

DOI：10.3976/j.issn.1002-4026.20230089

收稿日期：2023-05-27

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金（ZR2019MH037）；山東第一醫(yī)科大學(xué)學(xué)術(shù)提升計(jì)劃（2019LJ003）；山東省中醫(yī)藥高層次人才培育項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介：陳善軍（1997—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴帍?fù)雜藥效物質(zhì)解析。E-mail： 13562918151@163.com

*通信作者，王曉靜（1966—），女，研究員，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)。E-mail： xj68cn@163.com

韓利文（1980—），男，副研究員，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制。E-mail： hanliwen08@126.com

摘要：從確有療效的中藥天麻中挖掘潛在的抗癲癇活性成分對(duì)于癲癇的防治意義重大。使用斑馬魚(yú)幼魚(yú)癲癇模型評(píng)價(jià)兩個(gè)產(chǎn)地天麻樣本的抗癲癇活性；利用基于LC-MS/QE plus（液相色譜-質(zhì)譜）的代謝組學(xué)技術(shù)檢測(cè)天麻成分，結(jié)合模式判別分析方法尋找重要差異代謝物；通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜與二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)及文獻(xiàn)進(jìn)行代謝物鑒定，并利用斑馬魚(yú)癲癇模型進(jìn)一步對(duì)代謝物的抗癲癇活性進(jìn)行確認(rèn)。結(jié)果顯示9個(gè)天麻提取物能夠顯著減少斑馬魚(yú)的渦旋數(shù)量，并且兩產(chǎn)地天麻在抗癲癇活性上有著顯著差異（P<0.05）。代謝組學(xué)檢測(cè)以及模式判別分析篩選并鑒定出了6個(gè)重要差異代謝物（巴利森苷E、天麻素、巴利森苷C、巴利森苷D、N6-對(duì)羥基芐基腺苷、4， 4′-二羥基二芐基醚）?；钚则?yàn)證發(fā)現(xiàn)巴利森苷E、天麻素、N6-對(duì)羥基芐基腺苷能夠顯著抑制斑馬魚(yú)癲癇樣行為。該研究運(yùn)用斑馬魚(yú)模型與代謝組學(xué)找出并確定了天麻中多個(gè)具有抗癲癇活性的成分，其中巴利森苷E以及N6-對(duì)羥基芐基腺苷首次被發(fā)現(xiàn)具有抗癲癇活性，為天麻抗癲癇作用的研究提供了參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：天麻；癲癇；代謝組學(xué)；斑馬魚(yú)；活性成分

中圖分類(lèi)號(hào)：R917??? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A??? 文章編號(hào)：1002-4026（2024）03-0001-09

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)志碼（OSID）：

Screening of potential antiepileptic active ingredients in Rhizoma Gastrodiae

based on zebrafish model and metabolomics technology

CHEN Shanjun， WANG Huan， HU Kaiqing， BI Wenjie， CHENG Guidong， WANG Songsong， HAN Liwen*， WANG Xiaojing*

（National Key Laboratory of Advanced Drug Delivery System， School of Pharmaceutical Sciences &Institute of Materia Medica， Shandong First Medical University &Shandong Academy of Medical Sciences， Jinan 250117， China）

Abstract∶Identifying potential antiepileptic active ingredients in Rhizoma Gastrodiae is of immense significance for the prevention and treatment of epilepsy. In this study， we used a larval zebrafish epilepsy model to evaluate the antiepileptic activity of Rhizoma Gastrodiae from two different regions. In addition， we employed metabolomics technology based on liquid chromatography tandem mass spectrometry/QE plus to detect the ingredients in Rhizoma Gastrodiae and performed pattern analysis to identify key differential metabolites. The metabolites were further identified using primary and secondary mass spectrometry data and literature references. This step was followed by the confirmation of their antiepileptic activity using the zebrafish epilepsy model. The results showed that nine extracts of Rhizoma Gastrodiae significantly reduced the number of whirls in zebrafish， and significant differences in antiepileptic activity were observed between the Rhizoma Gastrodiae samples from the two regions （P<0.05）. Metabolomics and pattern analysis identified six important differential metabolites （Parishin E， Gastrodin， Parishin C， Parishin D， N6-p-hydroxybenzyl adenosine， and 4，4′-dihydroxydibenzyl ether）. Activity verification results showed that Parishin E， Gastrodin， and N6-p-hydroxybenzyl adenosine significantly inhibited zebrafish epilepsy-like behavior. This study utilized the zebrafish model and metabolomics to identify and determine several active antiepileptic ingredients in Rhizoma Gastrodiae. Of these， Parishin E and N6- p-hydroxybenzyl adenosine were reported for the first time to exhibit antiepileptic activity， thereby serving as a valuable reference for further research on the antiepileptic effects of Rhizoma Gastrodiae.

Key words∶Rhizoma Gastrodiae; epilepsy; metabolomics; zebrafish; active ingredients

癲癇（epilepsy）是一種由神經(jīng)元異常放電引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，影響著全球7 000多萬(wàn)人，具有突發(fā)性和不可預(yù)測(cè)的特征［1-2］。癲癇發(fā)作能夠引起大腦的形態(tài)和功能變化，主要表現(xiàn)為認(rèn)知和神經(jīng)心理障礙，若沒(méi)有得到及時(shí)控制與治療，可能會(huì)導(dǎo)致永久性認(rèn)知功能障礙［3］?？拱d癇藥物（AEDs）主要通過(guò)平衡興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)水平從而達(dá)到抑制癲癇發(fā)作的目的，但仍然有約三分之一的患者對(duì)抗癲癇藥物有著不同程度的耐藥［4］。天然產(chǎn)物具有毒副作用小、骨架結(jié)構(gòu)多樣、生物活性廣泛等特點(diǎn)［5］，因此從傳統(tǒng)中藥中篩選潛在的活性物質(zhì)能夠?yàn)榭拱d癇藥物研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

天麻又叫“赤箭”“定風(fēng)草”，是植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥塊莖。作為我國(guó)的傳統(tǒng)“止痙”中藥，天麻在治療驚癇抽搐上具有確切的療效?！吨袊?guó)藥典》中記載天麻具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽(yáng)、祛風(fēng)通絡(luò)的效果，常用于小兒驚風(fēng)、癲癇抽搐等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)天麻中的天麻素、香草醇等成分具有明顯的抗癲癇活性［6-7］。但天麻中以對(duì)羥基苯甲醇為母核的衍生物成分超過(guò)40種，還有許多成分的抗癲癇活性并不明確［8］，因此有必要對(duì)天麻中潛在抗癲癇成分進(jìn)行進(jìn)一步篩選。

本實(shí)驗(yàn)擬采用斑馬魚(yú)模型對(duì)天麻進(jìn)行抗癲癇活性評(píng)價(jià)，利用代謝組學(xué)與模式判別辨識(shí)天麻中潛在的抗癲癇活性物質(zhì)，并使用斑馬魚(yú)模型評(píng)價(jià)潛在活性成分的抗癲癇作用，從而確定抗癲癇活性成分，以便為天麻抗癲癇作用的研究提供參考價(jià)值。

1? 實(shí)驗(yàn)材料

1.1? 試劑與儀器

戊四唑（PTZ）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)：C15210581，純度：大于99.8%）、丙戊酸鈉（VPA，批號(hào)：C11370830，純度：98%）均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；天麻素（GAS，批號(hào)：T10M9F55562，純度：HPLC ≥ 98%）、巴利森苷E（PE，批號(hào)：M20HB178561，純度：HPLC ≥ 98%）、巴利森苷C（PC，批號(hào)：D06N11S130122，純度：HPLC ≥ 98%）、N6-對(duì)羥基芐基腺苷（NHBA，批號(hào)：C12073575，純度：98%），以上試劑購(gòu)自上海源葉生物有限公司；天麻藥材購(gòu)自濟(jì)南鼎國(guó)生物科技有限公司（2022年8月），由山東第一醫(yī)科大學(xué)韓利文副研究員鑒定為蘭科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥塊莖，共分為13批次，命名為P1～P13，其中P1～P6產(chǎn)自云南昭通，P7～P13產(chǎn)自吉林長(zhǎng)白山；無(wú)水乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20221213，AR），甲醇（賽默飛世爾科技，批號(hào)：A452-4，fisher），乙腈（賽默飛世爾科技，批號(hào)：A998-4，fisher），甲酸（賽默飛世爾科技，批號(hào)：A117-50，fisher），純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

索尼攝像機(jī)（DSC-RX100M7，日本索尼公司），中藥粉碎機(jī)（BJ-150，拜杰多功能粉碎機(jī)），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-200A，鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），全自動(dòng)樣品快速研磨儀（Wonbio-E，上海萬(wàn)柏生物科技有限公司），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（TGL-16MS，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司），高分辨質(zhì)譜儀（QE plus，賽默飛世爾科技公司），高效液相色譜儀（ACQUITY UPLC I-Class plus，Waters），色譜柱（ACQUITY UPLC HSS T3，100 mm×2.1 mm， 1.8 μm， Waters）。

1.2? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

AB系斑馬魚(yú)（Danio rerio）由山東第一醫(yī)科大學(xué)斑馬魚(yú)研究中心提供，斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)購(gòu)自上海海圣生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。AB系成年斑馬魚(yú)在（28±0.5）℃的恒溫養(yǎng)殖系統(tǒng)下養(yǎng)殖，整個(gè)系統(tǒng)為自動(dòng)水循環(huán)系統(tǒng)，并進(jìn)行14 h/10 h（上午8：30光照，晚上22：30黑暗）的光照/黑暗循環(huán)。健康成年雄性和雌性斑馬魚(yú)以2：2的比例光刺激產(chǎn)卵，在產(chǎn)卵2 h后收集的魚(yú)卵使用專(zhuān)用養(yǎng)魚(yú)水沖洗3次。將干凈的胚胎轉(zhuǎn)移到含有養(yǎng)魚(yú)水的90 mm培養(yǎng)皿中，加入適量的亞甲基藍(lán)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，并去除未受精以及發(fā)育不良的魚(yú)卵，健康魚(yú)卵在 28.5 ℃ 的恒溫培養(yǎng)箱中孵育用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)之前需要經(jīng)常觀察魚(yú)卵的發(fā)育狀況，并及時(shí)去除發(fā)育過(guò)程中魚(yú)卵褪下的卵膜以及死去的魚(yú)卵。

2? 實(shí)驗(yàn)方法

2.1? 天麻樣品的提取制備

天麻粉碎過(guò)4號(hào)篩（65目），稱(chēng)取各批天麻粉末約15 g，精密稱(chēng)定，置于500 mL圓底燒瓶中，按照料液比1：20加入70%的乙醇回流2.5 h，過(guò)濾，取濾液進(jìn)行55 ℃旋蒸，直至旋至無(wú)醇味，冷凍干燥24 h，得到各批次中藥天麻的提取物樣品。

2.2? 利用斑馬魚(yú)癲癇模型對(duì)不同產(chǎn)地天麻進(jìn)行抗癲癇活性評(píng)價(jià)

使用本實(shí)驗(yàn)室建立的斑馬魚(yú)抗癲癇活性評(píng)價(jià)方法，即ZebVortrack行為分析系統(tǒng)對(duì)天麻提取物的抗癲癇活性進(jìn)行評(píng)價(jià)［9］。斑馬魚(yú)癲癇發(fā)作時(shí)會(huì)產(chǎn)生癲癇樣渦旋游泳行為，ZebVortrack行為分析系統(tǒng)可以根據(jù)斑馬魚(yú)渦旋游泳時(shí)的向量夾角以及渦旋游泳持續(xù)時(shí)間進(jìn)行分析，量化斑馬魚(yú)幼魚(yú)在癲癇發(fā)作過(guò)程中產(chǎn)生的渦旋數(shù)量Number（N）。

精密稱(chēng)各批次天麻提取物粉末，加入純凈水溶解定容，得到400 μg/mL的溶液。精密稱(chēng)取戊四唑（PTZ）與丙戊酸鈉（VPA），加入純凈水溶解，分別配制得到2.90 mmol/L PTZ水溶液以及600 μmol/L VPA 水溶液，并分別作為造模藥物以及陽(yáng)性對(duì)照藥物。

將受精后4天（4 days post fertilization， 4 dpf）的AB品系斑馬魚(yú)置于6孔板中，加入400 μg/mL天麻提取物溶液或600 μmol/L VPA預(yù)處理幼魚(yú)24 h，之后轉(zhuǎn)移至12孔板中，每孔1條，除去水分并分別加入2.90 mmol/L PTZ溶液誘導(dǎo)幼魚(yú)癲癇發(fā)作30 min。PTZ處理過(guò)程中同時(shí)使用相機(jī)拍攝，拍攝結(jié)束后將視頻導(dǎo)入ZebVortrack系統(tǒng)進(jìn)行分析，輸出斑馬魚(yú)癲癇發(fā)作時(shí)的渦旋數(shù)量N。

對(duì)兩個(gè)產(chǎn)地天麻的抗癲癇活性進(jìn)行分析，檢驗(yàn)兩地天麻對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的抗癲癇活性差異。

2.3? 天麻樣品的LC-MS代謝組學(xué)檢測(cè)

稱(chēng)取各天麻樣本60 mg，放入1.5 mL的離心管，加入甲醇水溶液超聲溶解30 min，使用0.22 μm的有機(jī)相針孔過(guò)濾器過(guò)濾后，轉(zhuǎn)移到LC（液相色譜）進(jìn)樣小瓶進(jìn)行LC-MS（液相色譜-質(zhì)譜）分析。質(zhì)控樣本（QC）由所有樣本的提取液等體積混合制備而成。

色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3 （100 mm×2.1 mm， 1.8 μm）， 柱溫為45 ℃；流動(dòng)相A為水（含0.1%甲酸），B為乙腈（含0.1%甲酸）；流速為0.35 mL/min；進(jìn)樣體積2 μL。梯度程序：0～2 min，5% B；2～4 min，5%→30% B；4～8 min，30%→50% B；8～10 min，50%→80% B；10～14 min，80%→100% B；14～15 min，100% B；15～15.1 min，100%→5% B；15.1～16 min，5% B。離子源：ESI；樣品質(zhì)譜信號(hào)采集分別采用正負(fù)離子掃描模式。

2.4? 數(shù)據(jù)預(yù)處理與多元統(tǒng)計(jì)分析

使用質(zhì)譜檢測(cè)天麻樣本后，原始數(shù)據(jù)采用Progenesis QI v3.0 軟件 （Nonlinear Dynamics， Newcastle， UK） 進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，包括基線過(guò)濾、峰識(shí)別、積分、保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊和歸一化；刪除組內(nèi)缺失值（0值）> 50%的離子峰；最后將正負(fù)離子數(shù)據(jù)合并成一個(gè)數(shù)據(jù)矩陣表用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

主成分分析（PCA）是一種非監(jiān)督分析，可以反映數(shù)據(jù)的原始情況，能夠觀察樣本間的總體分布趨勢(shì)［10-11］。采用主成分分析對(duì)天麻樣本的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以判斷樣本的離散情況。如果兩組天麻樣本的成分之間有顯著性差異，那么兩組的樣本點(diǎn)在PCA得分圖上相距較遠(yuǎn)，若是兩組天麻樣本成分之間差異并不顯著，那么兩組樣本點(diǎn)在PCA得分圖上就會(huì)相距較近。

進(jìn)一步采用有監(jiān)督分析方法正交-偏最小二乘法（OPLS-DA）尋找兩組天麻樣本的差異代謝物［12-13］。同時(shí)采用7次循環(huán)交互驗(yàn)證（7-fold cross validation）實(shí)驗(yàn)和200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)（response permutation testing， RPT）驗(yàn)證模型是否過(guò)擬合。利用OPLS-DA分析的變量權(quán)重值（variable important in projection， VIP）、P值以及S-plot中的相關(guān)系數(shù)（correlation coefficient）絕對(duì)值|p（corr）|綜合衡量各代謝物的重要性，幫助挖掘差異代謝物。

2.5? 差異代謝物鑒定

差異代謝物主要通過(guò)文獻(xiàn)查閱以及一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒定。利用賽默飛Xcalibur軟件對(duì)差異代謝物進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜比對(duì)鑒定，鑒定標(biāo)準(zhǔn)為該化合物一級(jí)質(zhì)譜質(zhì)荷比的測(cè)量值與理論值的誤差，誤差的計(jì)算方法如式（1）。

Δ= ［（理論值－測(cè)量值）/理論值］×106， （1）

式（1）中Δ表示誤差，數(shù)值大小范圍為（-10， 10）。與文獻(xiàn)中查找的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，從而確定代謝物成分，即潛在抗癲癇活性成分。

2.6? 潛在抗癲癇活性成分的活性驗(yàn)證

使用斑馬魚(yú)行為分析系統(tǒng)對(duì)組學(xué)篩選出的差異代謝物進(jìn)行活性驗(yàn)證。稱(chēng)取篩選出的代謝物標(biāo)準(zhǔn)品適量，配制成合適濃度。使用以上溶液對(duì)4 dpf 斑馬魚(yú)進(jìn)行預(yù)處理24 h，處理結(jié)束后將斑馬魚(yú)置于12孔板，每孔1條，加入2.90 mmol/L PTZ溶液處理30 min，并使用攝像機(jī)拍攝斑馬魚(yú)幼魚(yú)的游動(dòng)狀態(tài)，拍攝結(jié)束后將視頻導(dǎo)入ZebVortrack系統(tǒng)進(jìn)行行為分析，輸出斑馬魚(yú)癲癇樣渦旋游泳數(shù)量N。

2.7? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

活性評(píng)價(jià)使用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差）的方式表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異通過(guò)單因素方差分析，P<0.05表示有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.01表示有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3? 結(jié)果

3.1? 不同產(chǎn)地天麻提取物對(duì)斑馬魚(yú)癲癇的影響

天麻提取物活性評(píng)價(jià)結(jié)果如圖1所示。使用2.90 mmol/L的PTZ處理后的斑馬魚(yú)幼魚(yú)癲癇樣渦旋次數(shù)顯著增多；使用VPA進(jìn)行了幼魚(yú)24 h的預(yù)處理以后進(jìn)行了PTZ誘導(dǎo)癲癇發(fā)作，從圖中可以看到斑馬魚(yú)幼魚(yú)的渦旋次數(shù)顯著減少，表明了斑馬魚(yú)癲癇模型在此次實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建成功。天麻提取物抗癲癇實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示P2、P3、P6～P12能夠顯著減少斑馬魚(yú)的渦旋數(shù)量，但P1、P5、P13批次并未顯著減少斑馬魚(yú)的渦旋次數(shù)，P4提取物在相等劑量處理斑馬魚(yú)的過(guò)程中造成斑馬魚(yú)死亡。通過(guò)進(jìn)一步檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)產(chǎn)地天麻之間對(duì)于PTZ誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)渦旋次數(shù)的影響有著顯著差異（P<0.05）。

3.2? 不同產(chǎn)地天麻樣品的組學(xué)檢測(cè)分析結(jié)果

實(shí)驗(yàn)采用液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)了天麻樣品并進(jìn)行了3次質(zhì)量控制檢查，圖2為在負(fù)離子與正離子模式下檢測(cè)的總離子流圖（TIC）。如圖3的PCA得分圖顯示， QC點(diǎn)分布在一起并處在原點(diǎn)附近，表明實(shí)驗(yàn)過(guò)程中儀器穩(wěn)定性較好。

實(shí)驗(yàn)采用PCA主成分分析觀察天麻樣本的總體分布，使用OPLS-DA尋找組間的差異代謝物。如圖4（a）所示，橢圓區(qū)域代表95%的置信區(qū)間，PCA能夠?qū)傻靥炻槌晒^(qū)分，其中第一主成分為41.2%，第二主成分為13%，表明兩地天麻成分含量有著顯著差異；OPLS-DA結(jié)果也顯示兩地天麻的成分含量具有顯著差異，其中變量擬合指數(shù)R2x為0.726，R2y 為0.998，預(yù)測(cè)指數(shù)Q2為0.975，表明了OPLS-DA模型具有良好的可測(cè)量性和適用性（圖4（b））；S-plot圖的左下角離子與右上角離子為重要離子（圖4（c））；響應(yīng)排序檢驗(yàn)結(jié)果顯示R2 為 0.858，Q2為-0.466，并且R2與Q2左邊的點(diǎn)均低于最右邊的點(diǎn)，同時(shí) Q2點(diǎn)的綠色回歸線與縱軸（左側(cè)）截距小于零，表明了OPLS-DA模型沒(méi)有過(guò)度擬合（圖4（d））。

3.3? 重要差異代謝物的鑒定結(jié)果

對(duì)代謝組學(xué)檢測(cè)到的天麻成分進(jìn)行判別分析，設(shè)定VIP值>3， P<0.05， |p（corr）|>0.58篩選后，得到183個(gè)差異特征離子，比對(duì)一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)與二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及文獻(xiàn)查閱鑒定辨識(shí)了6種成分，分別為巴利森苷E、天麻素、巴利森苷C、巴利森苷D、N6-對(duì)羥基芐基腺苷、4， 4′-二羥基二芐基醚，即潛在活性成分，詳情見(jiàn)表1。

天麻素（C13H18O7， m/z 286.104 7），負(fù)離子模式能量撞擊得到碎片離子峰為：m/z 123.045 3，具體裂解方式如圖5（a）所示。巴利森苷D （C20H20O9， m/z 404.110 1），正離子模式下能量撞擊得到碎片離子峰為：m/z 107.049 7。具體裂解方式如圖5（b）所示。

3.4? 潛在活性成分的抗癲癇作用驗(yàn)證

使用斑馬魚(yú)癲癇模型驗(yàn)證了4種潛在活性成分在不同濃度下的抗癲癇活性，具體為GAS（699、1 398、2 796 μmol/L）、PE（16.3、32.6、65.2 μmol/L）、PC（54.9、109.8、164.7 μmol/L）以及NHBA（26.8、53.6、80.4 μmol/L）。結(jié)果如圖6所示，GAS在中、高劑量下能夠顯著減少斑馬魚(yú)的渦旋次數(shù)，NHBA在低、中、高劑量下都能夠顯著減少斑馬魚(yú)渦旋次數(shù)，PE在低、高劑量下能夠顯著減少斑馬魚(yú)渦旋次數(shù)，PC在3個(gè)劑量下均未顯著減少斑馬魚(yú)幼魚(yú)的渦旋次數(shù)。

4? 討論

斑馬魚(yú)作為新型模式生物，與人類(lèi)基因高度同源［14-15］，并且斑馬魚(yú)胚胎透明，生長(zhǎng)周期短，體積小，適合高通量實(shí)驗(yàn)。斑馬魚(yú)的神經(jīng)系統(tǒng)與人類(lèi)相似，4 dpf斑馬魚(yú)中就可以檢測(cè)到膠質(zhì)細(xì)胞亞型（少突膠質(zhì)細(xì)胞、雪旺細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞），同時(shí)神經(jīng)系統(tǒng)還表達(dá)出一系列的信號(hào)分子［16］。此外，促驚厥劑還可以導(dǎo)致斑馬魚(yú)行為障礙，如游泳速度加快、姿勢(shì)喪失等［17］。這些行為表型結(jié)合強(qiáng)大的視頻跟蹤分析工具使斑馬魚(yú)成為藥物開(kāi)發(fā)研究中高通量篩選分析的優(yōu)良脊椎動(dòng)物。然而，當(dāng)斑馬魚(yú)暴露于其他外部刺激（如毒素）時(shí)，游泳速度與距離也會(huì)增加［18-19］。為此，本研究基于斑馬魚(yú)癲癇發(fā)作時(shí)產(chǎn)生的典型渦旋游泳行為，使用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的行為分析系統(tǒng)ZebVortrack對(duì)斑馬魚(yú)癲癇發(fā)作的渦旋行為進(jìn)行量化，以便更加準(zhǔn)確地評(píng)估天麻的抗癲癇活性。

中藥代謝組學(xué)的快速發(fā)展推動(dòng)了中藥研究，為中藥現(xiàn)代化發(fā)展注入了新的動(dòng)力。中藥代謝組學(xué)主要通過(guò)現(xiàn)代分析儀器對(duì)中藥或方劑中的成分進(jìn)行檢測(cè)，具有系統(tǒng)性、高靈敏度、特異性的特點(diǎn)，結(jié)合多元計(jì)量分析如主成分分析、偏最小二乘法或正交-偏最小二乘法尋找出中藥中的重要化合物，繼而對(duì)化合物進(jìn)一步分析，在中藥藥效物質(zhì)辨識(shí)研究以及質(zhì)量控制上發(fā)揮了巨大的作用［20-21］。本研究通過(guò)代謝組學(xué)檢測(cè)了不同產(chǎn)地天麻的成分，結(jié)合模式判別找出了6種重要差異代謝物，即潛在抗癲癇活性成分，其結(jié)構(gòu)多為對(duì)羥基苯甲醇衍生物，此外還有腺苷類(lèi)似物N6-對(duì)羥基芐基腺苷。對(duì)羥基苯甲醇［22］、腺苷［23］、天麻素［24-25］是天麻中已知的具有抗癲癇作用的成分。在本研究篩選出的6種潛在抗癲癇活性成分中，除天麻素是已知具有抗癲癇作用的成分外，其余5種均未被報(bào)道有抗癲癇作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證所篩選成分的抗癲癇活性，利用構(gòu)建的斑馬魚(yú)癲癇模型評(píng)價(jià)了天麻素、N6-對(duì)羥基芐基腺苷、巴利森苷E以及巴利森苷C的抗癲癇活性。結(jié)果顯示天麻素、N6-對(duì)羥基芐基腺苷以及巴利森苷E能夠顯著抑制斑馬魚(yú)的癲癇發(fā)作，巴利森苷C并未顯著抑制斑馬魚(yú)的癲癇發(fā)作，其中N6-對(duì)羥基芐基腺苷以及巴利森苷E首次被發(fā)現(xiàn)具有抗癲癇作用。

綜上所述，通過(guò)斑馬魚(yú)模型結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)找出了6種潛在的抗癲癇活性成分，并利用斑馬魚(yú)癲癇模型進(jìn)一步確定了天麻素、N6-對(duì)羥基芐基腺苷以及巴利森苷E的抗癲癇活性。其中N6-對(duì)羥基芐基腺苷以及巴利森苷E首次被發(fā)現(xiàn)具有抗癲癇活性，為天麻抗癲癇的復(fù)雜作用提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

［1］de FARIAS A C S， de PIERI PICKLER K， BERNARDO H T， et al. Melatonin pretreatment protects against Status epilepticus， glutamate transport， and oxidative stress induced by kainic acid in zebrafish［J］. Molecular Neurobiology， 2022， 59（1）： 266-275. DOI： 10.1007/s12035-021-02579-4.

［2］蘇發(fā)智， 孫延平， 白晨曦， 等. 中醫(yī)藥辨證治療癲癇的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2023， 29（11）： 200-211. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20220490.

［3］LANDI S， PETRUCCO L， SICCA F， et al. Transient cognitive impairment in epilepsy［J］. Frontiers in Molecular Neuroscience， 2019， 11： 458. DOI： 10.3389/fnmol.2018.00458.

［4］LERCHE H. Drug-resistant epilepsy - time to target mechanisms［J］. Nature Reviews Neurology， 2020， 16（11）： 595-596. DOI： 10.1038/s41582-020-00419-y.

［5］楊震. 活性天然產(chǎn)物和結(jié)構(gòu)多樣性類(lèi)天然產(chǎn)物的合成［J］. 化學(xué)進(jìn)展， 2009， 21（1）： 47-54.

［6］YANG C S， CHIU S C， LIU P Y， et al. Gastrodin alleviates seizure severity and neuronal excitotoxicities in the rat lithium-pilocarpine model of temporal lobe epilepsy via enhancing GABA ergic transmission［J］. Journal of Ethnopharmacology， 2021， 269： 113751. DOI： 10.1016/j.jep.2020.113751.

［7］HSIEH C L， CHANG C H， CHIANG S Y， et al. Anticonvulsive and free radical scavenging activities of vanillyl alcohol in ferric chloride-induced epileptic seizures in Sprague-Dawley rats［J］. Life Sciences， 2000， 67（10）： 1185-1195. DOI： 10.1016/S0024-3205（00）00706-2.

［8］于涵， 張俊， 陳碧清， 等. 天麻化學(xué)成分分類(lèi)及其藥理作用研究進(jìn)展［J］. 中草藥， 2022， 53（17）： 5553-5564. DOI： 10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.033.

［9］韓利文， 陳善軍， 李太平， 等. 利用斑馬魚(yú)幼魚(yú)模型高通量篩選抗癲癇藥物的方法及裝置： CN115227836A［P］. 2022-10-25.

［10］TA瘙塁-KKAYDN M， TEL-AYAN G， AYAN F， et al. Chemometric classification of chestnut honeys from different regions in Turkey based on their phenolic compositions and biological activities［J］. Food Chemistry， 2023， 415： 135727. DOI： 10.1016/j.foodchem.2023.135727.

［11］穆巖， 李麗麗， 馬雙雙， 等. 鉛離子導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞毒性的代謝組學(xué)機(jī)制［J］. 山東科學(xué)， 2019， 32（6）： 26-33. DOI： 10.3976/j.issn.1002-4026.2019.06.005.

［12］OTA M， XU F， LI Y L， et al. Comparison of chemical constituents among licorice， roasted licorice， and roasted licorice with honey［J］. Journal of Natural Medicines， 2018， 72（1）： 80-95. DOI： 10.1007/s11418-017-1115-4.

［13］LIU X L， ZHONG C， XIE J， et al. Geographical region traceability of Poria cocos and correlation between environmental factors and biomarkers based on a metabolomic approach［J］. Food Chemistry， 2023， 417： 135817. DOI： 10.1016/j.foodchem.2023.135817.

［14］DRIEVER W， SOLNICA-KREZEL L， SCHIER A F， et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish［J］. Development， 1996， 123： 37-46. DOI： 10.1242/dev.123.1.37.

［15］李雷， 蔣林華. 基于Cytoscape下斑馬魚(yú)衰老基因-蛋白質(zhì)的模塊化分析［J］. 生物信息學(xué)， 2019， 17（3）： 175-181. DOI： 10.12113/j.issn.1672-5565.201901001.

［16］GUO S. Using zebrafish to assess the impact of drugs on neural development and function［J］. Expert Opinion on Drug Discovery， 2009， 4（7）： 715-726. DOI： 10.1517/17460440902988464.

［17］BARABAN S C， TAYLOR M R， CASTRO P A， et al. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior， neural activity and c-fos expression［J］. Neuroscience， 2005， 131（3）： 759-768. DOI： 10.1016/j.neuroscience.2004.11.031.

［18］陳錫強(qiáng)， 侯海榮， 劉可春， 等. 蒼耳子提取物對(duì)斑馬魚(yú)的發(fā)育及運(yùn)動(dòng)行為的毒性研究［J］. 山東科學(xué)， 2014， 27（5）： 9-13. DOI： 10.3976/j.issn.1002-4026.2014.05.002.

［19］HUANG Y， ZHANG J S， HAN X B， et al. The use of zebrafish （Danio rerio） behavioral responses in identifying sublethal exposures to deltamethrin［J］. International Journal of Environmental Research and Public Health， 2014， 11（4）： 3650-3660. DOI： 10.3390/ijerph110403650.

［20］郭思凡， 蔡瑩， 張愛(ài)華. 基于代謝組學(xué)的中藥藥效評(píng)價(jià)、藥效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)及作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］. 藥物評(píng)價(jià)研究， 2022， 45（11）： 2338-2346. DOI： 10.7501/j.issn.1674-6376.2022.11.023.

［21］SHI Y P， ZHANG Y G， LI H N， et al. Discovery and identification of antithrombotic chemical markers in Gardenia Fructus by herbal metabolomics and zebrafish model［J］. Journal of Ethnopharmacology， 2020， 253： 112679. DOI： 10.1016/j.jep.2020.112679.

［22］蘇逸. 對(duì)羥基苯甲醇對(duì)大鼠杏仁核點(diǎn)燃的影響［D］. 杭州： 浙江大學(xué)， 2013.

［23］MASINO S A， KAWAMURA M Jr， RUSKIN D N. Adenosine receptors and epilepsy： Current evidence and future potential［J］. International Review of Neurobiology， 2014， 119： 233-255. DOI： 10.1016/B978-0-12-801022-8.00011-8.

［24］陸延安， 徐冬君. 天麻素治療癲癇患者腦電圖變化研究［J］. 中藥藥理與臨床， 2015， 31（2）： 114. DOI： 10.13412/j.cnki.zyyl.2015.02.049.

［25］JIN M， HE Q X， ZHANG S S， et al. Gastrodin suppresses pentylenetetrazole-induced seizures progression by modulating oxidative stress in zebrafish［J］. Neurochemical Research， 2018， 43（4）： 904-917. DOI： 10.1007/s11064-018-2496-9.