張帝

摘 要：DNA疫苗是第三代核酸疫苗的領(lǐng)軍者，因其比傳統(tǒng)疫苗有著多種優(yōu)勢，近年來重新進(jìn)入科研工作者的研究路線中。相比mRNA疫苗，DNA疫苗的研究更加深入廣泛，并有受市場檢驗的產(chǎn)品及多款臨床產(chǎn)品，未來將作為人類及動物疫病防控的重要技術(shù)手段。疫苗作為家禽養(yǎng)殖業(yè)始終依賴的基石，多年來隨著疾病的發(fā)展傳統(tǒng)疫苗已無法滿足其防治要求，而DNA疫苗正好可填補(bǔ)此空缺。本文概述了DNA疫苗在人用疫苗及禽用疫苗中的研究應(yīng)用，相比人用疫苗近年來的深入探索，禽用DNA疫苗起點雖早，但隨著新技術(shù)的更新，其發(fā)展后繼乏力。期望未來，研究者參考人用DNA疫苗中的新技術(shù)、新手段，對禽用DNA疫苗進(jìn)行更深入廣泛的研究。

關(guān)鍵詞：DNA；禽用疫苗

中圖分類號：S859.797文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1673-1085（2024）06-0076-05

DNA疫苗是核酸疫苗家族的一員，與mRNA疫苗的作用機(jī)理相似，均可被靶細(xì)胞吞入，在胞內(nèi)應(yīng)用其相關(guān)元件及原料進(jìn)行蛋白表達(dá)，經(jīng)過遞呈后刺激機(jī)體免疫力的產(chǎn)生，誘導(dǎo)特異性B細(xì)胞及T細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答。有所區(qū)別的是，mRNA疫苗在細(xì)胞質(zhì)中直接翻譯為多肽進(jìn)而組裝生成蛋白質(zhì)，而DNA疫苗需要先進(jìn)入細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄生成mRNA方可啟動翻譯。

相比新冠疫情以來較為火爆的mRNA疫苗技術(shù)路線，DNA疫苗無論從誕生時間、研究基礎(chǔ)及臨床應(yīng)用方面均有著更為顯著的優(yōu)勢。曾經(jīng)作為第三代核酸疫苗的領(lǐng)軍者，盡管DNA疫苗在研究熱度上已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及mRNA疫苗，其仍然存在著眾多mRNA疫苗無法媲美的優(yōu)勢，未來仍然是人類、動物疾病防控及治療的重要技術(shù)途徑。

1? DNA疫苗的特點

1.1? 免疫原性好

DNA疫苗進(jìn)入細(xì)胞后，通過細(xì)胞自身的原料及酶轉(zhuǎn)錄后翻譯生成目標(biāo)抗原，其過程全程位于天然的細(xì)胞工廠，因此其翻譯后的修飾與天然蛋白十分相近，保證了蛋白抗原的正確折疊與表位的暴露，提高免疫原性，能夠更準(zhǔn)確地遞呈給免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用[1]。

1.2? 安全性高

DNA疫苗無論從大規(guī)模生產(chǎn)到應(yīng)用，均不涉及致病病原的使用，尤其對于培養(yǎng)復(fù)雜或高致病性病原制備疫苗過程中，僅設(shè)計并制備質(zhì)粒，無強(qiáng)毒株使用，生物安全防護(hù)要求低[2]。而且質(zhì)粒進(jìn)入人體毒副作用較低，目前的研究在毫克級別暫無可見的不良反應(yīng)。對于部分研究者認(rèn)為的，相比于mRNA疫苗來講，DNA疫苗整合基因組的風(fēng)險較高，根據(jù)目前的研究顯示，DNA自然整合相比病原進(jìn)入體內(nèi)自然整合的概率并無顯著差異。

1.3? 持續(xù)的免疫應(yīng)答

DNA疫苗進(jìn)入細(xì)胞后，短時間內(nèi)難以被細(xì)胞清除，因此在極低劑量下即可持續(xù)誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生反復(fù)的免疫刺激，誘導(dǎo)更強(qiáng)烈的中和抗體產(chǎn)生及細(xì)胞免疫反應(yīng)，避免多次免疫，縮短免疫窗口期，提高免疫效率[3]。

1.4? 低成本，高效率，快響應(yīng)

DNA疫苗設(shè)計效率較高，在類似新冠等疾病突然爆發(fā)時，DNA疫苗可被快速響應(yīng)并進(jìn)行設(shè)計，且DNA疫苗具有用量極低、生產(chǎn)成本低、后期的純化方法簡單、生產(chǎn)效率較高、疫苗穩(wěn)定、易于儲存等特點，使其適合用于流行性疾病的及時防控[4]。

2? DNA疫苗在人用疫苗中的研究

自1990年DNA疫苗發(fā)現(xiàn)以來[5]，至今已走過34年的研究歷程，但迄今為止，僅一款DNA疫苗產(chǎn)品成功上市。盡管如此，學(xué)者們做了大量的研究，截止目前，全球現(xiàn)有約160個DNA疫苗或腫瘤免疫治療的臨床試驗正在進(jìn)行，相信未來會有更多的產(chǎn)品通過臨床，成功應(yīng)用。

2.1? 新冠疫苗

2021年8月，印度Cadila Healthcare公司的新冠DNA疫苗ZyCoV-D獲得緊急授權(quán)許可，成為世界上第一款人用DNA疫苗。此外，全球包括Inovio公司的INO-4800疫苗[6]、Genexine公司的GX-19疫苗[7]、AnGes公司的AG0301-COVID19疫苗[8]在內(nèi)的30余種DNA新冠疫苗已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗階段。

2.2? 流感疫苗

流感病毒傳播性強(qiáng)，危害大，易造成世界性大流行，其疫苗的研制始終為防控的第一手段，而DNA疫苗因其強(qiáng)大的優(yōu)勢，近年來成為研究疫苗的重要手段。Kodojalli S等[9]選擇H5N1毒株免疫原性表位作為抗原，構(gòu)建DNA疫苗，免疫小鼠后可對人或禽的不同毒株H5N1型流感病毒產(chǎn)生保護(hù)作用。

2.3? 丙肝疫苗

丙型肝炎病毒與流感病毒具有相似的特點—亞型多、易突變，使其成為一種疫苗研發(fā)難度較大的病毒性疾病。其表面核心蛋白HCV作為疫苗首選抗原表位，將其核心序列與HBV核心序列融合構(gòu)建質(zhì)粒后制備成疫苗，免疫后能夠?qū)π∈螽a(chǎn)生免疫應(yīng)答[10]。

2.4? 腫瘤疫苗

腫瘤DNA疫苗是DNA疫苗應(yīng)用領(lǐng)域中另一重大應(yīng)用前景，研究者認(rèn)為DNA疫苗能夠更好的靶向APC細(xì)胞，刺激APC細(xì)胞成熟并提呈抗原，通過不同途徑激活特異性免疫應(yīng)答[11]，其中針對HPV的DNA疫苗表現(xiàn)尤其突出，在III期臨床試驗中取得了振奮人心的治療效果，研究證實其能夠引起強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)，降低患者手術(shù)率，且在接受治療后18個月內(nèi)患者體內(nèi)均無法檢出HPV16/18病毒[12]。

3? DNA疫苗在禽用疫苗中的應(yīng)用

研究者們對于DNA疫苗基因整合人類基因組方面的擔(dān)憂，多年來限制了DNA疫苗的應(yīng)用；而在動物疫苗中，此方面的考慮因素較弱，因此在動物疫苗中DNA疫苗產(chǎn)品上市更容易，目前已經(jīng)獲批的DNA疫苗有鮭魚傳染性造血組織壞死病毒疫苗、狗黑色素瘤治療性疫苗、母豬分娩綜合征疫苗、雞H5N1型禽流感疫苗等，還有針對多種動物疾病的DNA疫苗處于研發(fā)過程中。其中以H5N1型禽流感疫苗為代表的禽用疫苗中，DNA疫苗的研究最為廣泛。

3.1? 禽流感疫苗

禽流感是一種禽類烈性傳染病，嚴(yán)重影響?zhàn)B禽業(yè)發(fā)展，疫苗接種作為控制禽流感傳播的首選策略，始終作為核心研究內(nèi)容。傳統(tǒng)疫苗通常為滅活疫苗及減毒活疫苗，但因免疫效果不佳或疫苗株存有毒力返強(qiáng)的風(fēng)險等，無法更好的滿足市場需求。研究發(fā)現(xiàn)，AIV外膜蛋白已經(jīng)被證實具有較強(qiáng)的免疫原性，其中M蛋白和NP蛋白序列為核心的DNA疫苗均可誘導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng)，且攻毒保護(hù)率高達(dá)70%[13]。

2018年，哈爾濱獸醫(yī)研究所研發(fā)的禽流感DNA疫苗（H5亞型）獲得國家一類新獸藥證書，是中國首個獲得批準(zhǔn)的動物DNA疫苗。除此之外，其他亞型禽流感疫苗如H7、H9等均被廣泛研究，并在佐劑、載體及抗原設(shè)計等方面均有顯著的研究進(jìn)展[14]。

將禽流感病毒H7N9的HA蛋白序列優(yōu)化克隆至載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒制備成DNA疫苗，免疫后攻毒，結(jié)果證明，所有免疫雞均無發(fā)病，且可免受不同血清型強(qiáng)毒株的攻擊，證明此DNA疫苗不僅對于本毒株具有保護(hù)效力，還可產(chǎn)生交叉保護(hù)作用[15]。

3.2? 雞球蟲疫苗

球蟲病是危害養(yǎng)雞業(yè)的重大疾病，其病原雞柔嫩艾美耳球蟲屬于細(xì)胞內(nèi)寄生性原蟲，傳統(tǒng)的寄生蟲活疫苗防控效果不佳，且存在生物安全風(fēng)險，因此DNA疫苗被廣泛研究。其中編碼EtSAG4基因[16]、pEtK2基因[17]等多種表位已經(jīng)被證實，作為核心序列制備DNA疫苗免疫雞后，均可誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答，產(chǎn)生保護(hù)效力。

3.3? 雞傳染性支氣管炎疫苗

雞傳染性支氣管炎是危害養(yǎng)禽業(yè)重要的病毒性傳染病之一，其血清型眾多，且相互之間交叉保護(hù)性弱，因此限制疫苗的研發(fā)進(jìn)展。DNA疫苗可以做到將不同抗原表位融合構(gòu)建，包括保守區(qū)域，使其能夠具備更好的交叉保護(hù)作用。唐夢君[18]研究了IBV的結(jié)構(gòu)蛋白S1蛋白、M蛋白、N蛋白，分別將三種蛋白添加刺激因子構(gòu)建DNA疫苗，結(jié)果表明S1蛋白為核心序列的DNA疫苗能夠抵抗強(qiáng)毒株攻毒，保護(hù)率高達(dá)85%。田浪[19]則通過生物信息學(xué)篩選了S1、S2、N蛋白的B細(xì)胞及T細(xì)胞表位，將其融合構(gòu)建DNA疫苗，并添加CpG序列作為刺激因子，與IL-2佐劑共同免疫雞，能夠提供90%的攻毒保護(hù)率。

3.4? 其他禽類疫苗

除上述疫苗外，如新城疫DNA疫苗、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病DNA疫苗、禽波氏桿菌DNA疫苗等多種DNA疫苗也處于研究中，但由于臨床危害較小、市場關(guān)注不足或傳統(tǒng)疫苗效果可達(dá)預(yù)期等因素，尚無更深入廣泛的研究。

4? 討論與展望

DNA疫苗問世已長達(dá)34年，其中不乏學(xué)者對其深入研究，使其成為一種未來可期的疫苗技術(shù)路線，而轉(zhuǎn)基因概念的不良宣傳引起人們對“基因”談之色變，極大限制了DNA疫苗的應(yīng)用前景。在人用疫苗學(xué)術(shù)領(lǐng)域，DNA疫苗通常被認(rèn)為易引起基因重組以及由于外源核酸引起的自身免疫疾病等缺點，使其研究受到質(zhì)疑；在禽用疫苗研究應(yīng)用中，DNA疫苗的研究起步較早，2000年以來即有不同研究者研究禽類的DNA疫苗，并已有產(chǎn)品注冊新獸藥， 2018年以后對其研究熱度稍有減弱。近幾年來，隨著核酸藥物的發(fā)展，免疫信號通路的廣泛研究，DNA疫苗的優(yōu)勢盡顯，且可通過融合表達(dá)靶向信號分子、基因槍或可溶性微針等多種途徑提高靶向性及吸收率，能夠更好地指導(dǎo)禽類DNA疫苗的研究與更新，未來為養(yǎng)禽業(yè)提供更安全、更有效、質(zhì)量可控的疫苗。

參考文獻(xiàn)：

[1]? 殷俊磊，文明，周碧君，等.核酸疫苗的研究現(xiàn)狀及展望[J]．貴州畜牧獸醫(yī)，2009，33（1）：19-21.

[2]? 吳庭才，張春杰．核酸疫苗的特點、組成及在動物免疫中的應(yīng)用[J]．生物學(xué)通報，2009，44（3）：5-7.

[3]? 王英．DNA疫苗的研究與進(jìn)展[J]．社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志，2008，6（3）：19-20.

[4]? SMITH RFT，PATEL A，RAMOS S，et al.Immunogenicity of a DNA vaccine candidate for COVID-19[J].Nature Communications， 2020， 11（14）： 727-733.

[5] WOLFF JA，MALONE RW，WILLIAMS P，et al.Direct gene transfer into mouse muscle in vivo[J]. Science，1990，247（4949 Pt 1）：1465-1468.

[6]? Inovio.Safety，tolerability and immunogenicity of INO-4800 followed by electroporation in healthyvolunteersforCOVID-19[EB/OL].（2020-06-25）[2020-06-29].https：//clinicaltrials.gov/ct 2/show/NCT04447781？term=INO-4800&draw=2&rank=2.

[7]? Genexine.Genexine，COVID-19 preventive vaccine，GX-19，clinical 1/2 phase approval [EB/OL].（2020-06-11）[2020-06-22].http：//www.genexine.com/m62_view.php？idx=157&cate =1&year=.

[8]? Inc AnGes.AnGes and Osaka University launch joint DNA vaccine development against coronavirus disease 2019（COVID-19） [EB/OL].（2020-03-05）[2020-05-05]. https：//www.anges. co.jp/en/pdf.php？pdf=003Mk7IxCg7spYu6nteDj80QPMCznRi2.pdf.

[9]? Kodohalli S，Kibasa D L，Webster R G，et al.Strategies for inducing protection against Avian influenza A virus subtypes with DNA vaccines [J].Vaccine，2000，18（23）：2592-2599.

[10] 孫永年.丙型肝炎疫苗的研究進(jìn)展[J]．國外醫(yī)學(xué)流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊，2002，29（5）：266-268.

[11] REZAEI T，DAVOUDIAN E，KHALILI S.Strategies in DNA vaccine for melanoma cancer [J]. Pigment Cell Melanoma Res， 2021，34（5）：869-91.

[12]BHUYAN P K，DALLAS M，KRAYNYAK K， et al.Durability of response to VGX-3100 treatment of HPV16/18 positive cervical HSIL [J].Hum Vaccin Immunother， 2021，17（5）： 1288-93.

[13]ZHENG M，LUO J，CHEN Z，Development of universal influenza vaccines based on influenza virus M and NP genes[J].Infection，2014，42（2）：251-262.

[14] 馮亞亞，郭晶等.禽流感DNA疫苗研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī)2020，47（11）：3667-3675.

[15] 梁真潔，潘俊慧，于曉菲，等．H7N9禽流感DNA疫苗的免疫保護(hù)效力研究[J]．中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2019，41（9）：935-939.

[16] ZHAO P，LI Y，ZHOU Y，et al.In vivo immunoprotective comparison between recombinant protein and DNAvaccine of Eimeria tenella surface antigen 4[J].Veterinary Parasitology 2020，278：109032.

[17] ZHANG B，YUAN C，SONG X，et al.Optimization of immunization procedure for Eimeria tenella DNA vaccine pVAX1-pEtK2-IL-2 and its stability[J].Acta Parasitologica，2019，64（4）：745-752.

[18] 唐夢君.禽傳染性支氣管炎病毒基因雙順反子DNA疫苗及mRNA3的分子特性研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[19] 田浪.禽傳染性支氣管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗構(gòu)建及免疫研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

Research Progress of DNA Vaccine and its Application

in Poultry Vaccine

ZHANG Di

（Feicheng Animal Husbandry and Veterinary Industry Development Service Center，

Feicheng 271600，China）

Abstract： DNA vaccine is the leader of the third generation of nucleic acid vaccine. Because of its many advantages compared with traditional vaccine， DNA vaccine has re-entered the research route of scientific researchers in recent years. Compared with mRNA vaccine， DNA vaccine research is more in-depth and extensive， and there are market tested products and a number of clinical products， which will be used as an important technical means for the prevention and control of human and animal diseases in the future. Vaccines have always been the cornerstone of the poultry industry. Over the years， with the development of diseases， traditional vaccines have been unable to meet the requirements of prevention and control， and DNA vaccines can fill this gap. This paper lists the research of DNA vaccine in human vaccine and poultry vaccine. It can be seen that compared with the in-depth exploration of human vaccine in recent years， poultry DNA vaccine started early， but with the update of new technology， its development is weak. In the future， we can refer to the new technical means of human DNA vaccine to conduct more in-depth and extensive research on avian DNA vaccine.

Keywords：? DNA; poultry vaccine