［摘 要］ 目的：探討丹參酮ⅡA 磺酸鈉 （STS） 對尿毒癥毒素作用下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（hUVECs） 功能的影響，并闡明其作用機(jī)制。方法：將 hUVECs進(jìn)行傳代培養(yǎng)并分為空白對照組、尿毒癥毒素刺激組、尿毒癥毒素+STS 組和尿毒癥毒素+STS+細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK） 抑制劑組，其中后2 組中STS 的濃度為10 mg·L-1；先給予各組剪切力刺激，剪切力大小為12 dyn·cm-2；采用CCK-8 法測定各組細(xì)胞增殖活性， Western blotting 法檢測各組細(xì)胞中ERK、核因子κB （NF-κB）和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平，實(shí)時(shí)熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測細(xì)胞中ERK、NF-κB 和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)情況；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù) （TUNEL） 法檢測各組細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：CCK-8法檢測，在剪切力作用后，尿毒癥毒素刺激組和尿毒癥毒素+STS+ERK 抑制劑組細(xì)胞增殖活性低于尿毒癥毒素+STS 組（Plt;0. 01）。Western blotting 法檢測，與尿毒癥毒素組比較，尿毒癥毒素+STS 組細(xì)胞中ERK、NF-κB 和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 01）；抑制ERK 信號通路后，與空白對照組、尿毒癥毒素組和尿毒癥毒素+STS 組比較，尿毒癥毒素+STS+ERK 抑制劑組細(xì)胞中ERK、NF-κB和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01）。RT-qPCR 法檢測，與尿毒癥毒素組比較，尿毒癥毒素+STS 組細(xì)胞中ERK、NF-κB 和Ⅰ型膠原mRNA 表達(dá)水平升高（Plt;0. 01）；抑制ERK 通路后，與空白對照組、尿毒癥毒素組和尿毒癥毒素+STS 組比較， 尿毒癥毒素+STS+ERK 抑制劑組細(xì)胞中ERK 、NF- κB 和Ⅰ 型膠原mRNA 表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01）。TUNEL 法檢測， 尿毒癥毒素+STS 組的細(xì)胞凋亡率小于尿毒癥毒素刺激組和尿毒癥毒素+STS+ERK 抑制劑組（Plt;0. 05）。結(jié)論：一定濃度STS能通過ERK信號通路調(diào)節(jié)NF-κB和Ⅰ型膠原mRNA及蛋白表達(dá)來改善尿毒癥毒素作用下的內(nèi)皮細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡。

［關(guān)鍵詞］ 血液透析； 動(dòng)靜脈內(nèi)瘺； 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞； 尿毒癥； 丹參酮ⅡA 磺酸鈉

［中圖分類號］ R459. 5;R543. 6 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

動(dòng)靜脈內(nèi)瘺（arteriovenous fistula， AVF） 是尿毒癥患者血液透析的首選血管通路，但其功能障礙是影響尿毒癥血液透析患者長期預(yù)后的關(guān)鍵因素［1-3］，AVF 建立后在血流剪切力影響下，由靜脈新生內(nèi)膜增生引起的靜脈狹窄是AVF 功能障礙的主要原因。同時(shí)，尿毒癥狀態(tài)下各種毒素也會(huì)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖從而出現(xiàn)內(nèi)膜增生情況。丹參酮是從丹參根中提取的一種脂溶性化合物，是丹參的主要活性成分，其中丹參酮ⅡA 是丹參酮的主要活性單體成分，其分子中的醌型結(jié)構(gòu)易氧化，具有較強(qiáng)的生物活性，參與機(jī)體抗氧化反應(yīng)。丹參酮ⅡA的磺化產(chǎn)物丹參酮Ⅱ A 磺酸鈉（sodium tanshinoneⅡ A sulphonate， STS） 能溶解于水， 在冠心病、高脂血癥和糖尿病的治療中被廣泛應(yīng)用，同時(shí)可清除氧自由基，抑制組胺形成，對血管內(nèi)皮具有較好的保護(hù)作用［4-7］。但是STS 在尿毒癥環(huán)境下對血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常的影響尚未明確。因此，本研究以尿毒癥環(huán)境下培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象，探討STS 對尿毒癥環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響，并闡明其作用機(jī)制，為AVF 功能不良的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells， hUVECs）（中國科學(xué)院）。 STS 注射液（上海第一生化藥業(yè)有限公司）， 磷酸鹽緩沖液（phosphate bufferedsaline，PBS）［生工生物工程（上海） 股份有限公司］、胰蛋白酶和CCK-8 試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）， 胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）和DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）（美國Sigma 公司），細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulatedkinase， ERK） 抑制劑PD98059 （美國ApexBio 公司），超純RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitativePCR， RT-qPCR） 試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）， 引物（美國ThermoFisher 公司）。倒置熒光顯微鏡（型號：TE300，日本Nikon 公司）。

1. 2 hUVECs的培養(yǎng)及處理

hUVECs培養(yǎng)：用含 10% FBS 的 L-DMEM 培養(yǎng)液（含葡萄糖1. 0 g·L-1）， 于37 ℃、5% CO2 飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔1～2 d 更換培養(yǎng)液1 次，待細(xì)胞長至80% 時(shí)， 用含0. 25% 胰酶-0. 05%EDTA 消化2～3 min， 用含30% FBS 的 M199 完全培養(yǎng)液終止消化， 離心， 用10% FBS 的 M199完全培養(yǎng)液重懸，傳代培養(yǎng)。將細(xì)胞分為空白對照組（不做任何處理）、尿毒癥毒素刺激組［采用尿毒癥毒素（50 mmol·L-1 尿素、200 μmol·L-1肌酐、80 μmol·L-1尿酸、2 ng·L-1甲狀旁腺激素和1×10-4 μmol·L-1 精脒的混合液） 刺激細(xì)胞］［25］、尿毒癥毒素+STS 組（10 g·mL-1 STS）； 尿毒癥毒素+STS 組（10 g·mL-1 STS） +ERK 抑制劑（PD98059） 組， 培養(yǎng)24 h 后將培養(yǎng)液換成無血清M199 培養(yǎng)液， 并用胰島素（5 mIU·L-1） 刺激細(xì)胞15 min。在細(xì)胞分組后，每組細(xì)胞利用平板流動(dòng)腔、蠕動(dòng)泵、硅膠軟管和儲(chǔ)液瓶搭建流體剪切力系統(tǒng)［23］，調(diào)節(jié)液體流速至75 mL·min-1，對hUVECs進(jìn)行剪切力刺激6 h。

1. 3 CCK-8法檢測hUVECs的增殖活性

在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入hUVECs 懸液100 μL （濃度為每毫升6×105 個(gè)細(xì)胞），邊緣孔用等體積的PBS 緩沖液填充； 在培養(yǎng)箱中孵育12 h 后， 按上述方法分組處理； 之后向每孔中加入10 μL CCK-8 溶液或等體積DMEM，繼續(xù)孵育4 h；以僅含有培養(yǎng)基和CCK-8 溶液而無hUVECs 的孔作為空白組， 以加入DMEM 而非CCK-8 溶液的孔作為對照組，采用分光光度計(jì)測定450 nm 處的吸光度（A） 值，根據(jù)細(xì)胞活性計(jì)算公式計(jì)算各組hUVECs 的增殖活性。細(xì)胞增殖活性= （實(shí)驗(yàn)組A 值- 空白組A 值） / （對照組A 值-空白組A 值） ×100%。

1. 4 RT-qPCR法檢測各組hUVECs中ERK、Ⅰ型膠 原 和 核 因 子 κB（nuclear factor- κB，NF- κB）mRNA表達(dá)水平

取凍存于液氮中hUVECs細(xì)胞，按試劑盒操作步驟提取總RNA， 測定RNA 純度，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA， 再進(jìn)行PCR 擴(kuò)增， 引物序列： ERK 上游引物5′-GGCTGTTCCCAAATGCTGAC-3′，ERK 下游引物5′-AACTTGAATGGTGCTTCGGC-3′；NF- κB 上游引物5′-GTGGTGCGGCTCATGTTTAC-3′，NF- κB 下游引物5′-CGTCTGATACCACGGGTTCC-3′； Collagen Ⅰ上游引物5′-AGTGGTTTGGATGGTGCCAA-3′，Collagen Ⅰ 下游引物5′-GCACCATCATTTCCACGAGC-3′；GAPDH 上游引物5′-AGATCCCTCCAAAATCAAGTGG-3′， GAPDH 下游引物5′-GGCAGAGATGATGACCCTTTT-3′。PCR 反應(yīng)體系：2×SYBR Premix Ex Taq 12. 5 μL，上游引物和下游引物（10 μmol·L-1） 各0. 5 μL， cDNA模板2 μL， 加入ddH2O 至總體系25 μL。擴(kuò)增條件：變性95 ℃、30 s；退火95 ℃、5 s，延伸60 ℃、34 s， 共30 個(gè)循環(huán)。將各樣品cDNA 稀釋10 倍后取2 μL 為模板， 分別以目的基因引物和內(nèi)參基因（GAPDH） 引物進(jìn)行擴(kuò)增， 每組重復(fù)8 次， 在60 ℃～95 ℃進(jìn)行熔解曲線分析。采取2-ΔΔCt 法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

1. 5 Western blotting 法 檢 測 各 組 hUVECs 中ERK、Ⅰ型膠原和NF-κB蛋白表達(dá)水平

按“1. 2”所述方法分組處理hUVECs，RIPA 裂解細(xì)胞后提取蛋白。其中ERK 抑制劑使用時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋至工作濃度為10 μmol·L-1。所得蛋白樣本以12% SDS-PAGE 進(jìn)行電泳并將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。5% 牛血清白蛋白封閉1 h 后，分別加入兔抗人Ⅰ型膠原抗體、兔抗人NF-κB p65 抗體（以Tris 緩沖鹽溶液， TBS 溶液按1∶ 400 稀釋） 和兔抗人ERK 抗體，4 ℃孵育過夜。第2 天，加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP） 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體（用TBS 溶液按1∶ 3 000 稀釋），室溫孵育1 h。TBST 溶液洗膜3 次后，加入ECL 顯色液并曝光條帶。樣品測定：①分別取100 μL檢測樣品（稀釋100 倍） 加入到微孔板中，每個(gè)樣品取3 個(gè)平行樣進(jìn)行測定； ② 加入100 μL 工作液后， 立即混勻； ③ 37 ℃水浴中反應(yīng)60 min 后， 冷卻至室溫； ④采用酶標(biāo)儀在波長562 nm 處測定蛋白灰度值，在20 min 內(nèi)檢測完畢所有樣品；⑤采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1. 6 原 位 末 端 轉(zhuǎn) 移 酶 標(biāo) 記 技 術(shù)（TdT-mediateddUTP-biotin nick end labeling，TUNEL）法檢測各組細(xì)胞凋亡情況

采用1×PBS緩沖液浸泡潤洗樣本2～3 次， 每次3～5 min； 按照1∶ 100 的比例用1×PBS 緩沖液稀釋濃度為2 g·L-1 的Proteinase K溶液，使其終濃度為20 mg·L-1。每個(gè)樣本上滴加100 μL 稀釋好的Proteinase K 溶液，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫孵育20 min；用1×PBS 緩沖液浸泡潤洗樣本2～3 次， 按照1∶ 5 的比例用ddH2O將5×Equilibration Buffer 稀釋成1×EquilibrationBuffer； 滴加100 μL 1×Equilibration Buffer 使其全部覆蓋待檢樣本區(qū)域，室溫平衡10～30 min；滴加DAPI 避光孵育5 min， 對標(biāo)本進(jìn)行染核， 1×PBS緩沖液浸洗爬片3 次；用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1. 7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采 用 GraphPad Prism 7. 0 和SPSS 20. 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞凋亡率，hUVECs 中ERK、Ⅰ型膠原和NF-κB mRNA及蛋白表達(dá)水平符合正態(tài)分布， 以-x±s 表示， 多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 hUVECs 的形態(tài)表現(xiàn)

hUVECs 傳代培養(yǎng)24 h 后開始單層貼壁生長，光鏡下可見細(xì)胞呈多邊形，生長融合后呈鋪路石狀排列，具有典型上皮細(xì)胞形態(tài)。見圖1。

2. 2 各組細(xì)胞增殖活性

CCK-8法檢測結(jié)果顯示：與空白對照組（99. 86%±0. 12%） 比較， 尿毒癥毒素刺激組細(xì)胞增殖活性（76. 85%±0. 59%） 降低（Plt;0. 001）；與尿毒癥毒素刺激組比較，尿毒癥毒素+STS 組細(xì)胞增殖活性（84. 35%±0. 92%）升高（Plt;0. 001）；與尿毒癥毒素刺激組和尿毒癥毒素+STS 組比較， 尿毒癥毒素+STS+ERK 抑制劑組細(xì)胞增殖活性（50. 98%±0. 92%） 降低（Plt;0. 001）。

2. 3 各組細(xì)胞凋亡率

與空白對照組 （5. 96%±4. 31%） 比較， 尿毒癥毒素刺激組細(xì)胞凋亡率（27. 88%±8. 61%） 升高（P=0. 021 8）； 與尿毒癥毒素刺激組比較， 尿毒癥毒素+STS 組細(xì)胞凋亡率（19. 69%±3. 51%） 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0. 669 5）；與尿毒癥毒素+STS 組比較，尿毒癥毒素+STS+ERK 抑制劑組細(xì)胞凋亡率（46. 57%±8. 40%） 升高（P=0. 000 7）。見圖2。

2. 4 各組 hUVECs中 ERK、Ⅰ型膠原和 NF-κB蛋白表達(dá)水平

與空白對照組比較，尿毒癥毒素刺激組hUVECs 中ERK、Ⅰ 型膠原和NF-κB 蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 01）；與尿毒癥毒素刺激組比較，尿毒癥毒素+STS 組hUVECs 中ERK、Ⅰ 型膠原和NF-κB 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 01）； 與尿毒癥毒素+STS 組比較，尿毒癥毒素+STS+ERK 抑制劑組hUVECs 中ERK、Ⅰ 型膠原和NF-κB 蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 01）。見圖3 和表1。

2. 5 各組 hUVECs 中 ERK、Ⅰ型膠原和 NF- κBmRNA 表達(dá)水平。

與空白對照組比較，尿毒癥毒素刺激組hUVECs 中ERK、Ⅰ 型膠原和NF- κBmRNA 表達(dá)水平降低（Plt;0. 01）； 與尿毒癥毒素刺激組比較， 尿毒癥毒素+STS 組hUVECs 中ERK、I 型膠原和NF-κB mRNA 表達(dá)水平升高（Plt;0. 01）； 與尿毒癥毒素+STS 組比較， 尿毒癥毒素+STS+ERK 抑制劑組hUVECs 中ERK、Ⅰ 型膠原和NF- κB mRNA 表達(dá)水平降低（Plt;0. 01）。見表2。

3 討 論

在本研究中，CCK-8 法檢測結(jié)果顯示：與尿毒癥毒素刺激組比較， STS 預(yù)處理的hUVECs 活力增強(qiáng)， 提示STS 能改善內(nèi)皮細(xì)胞活性， 與既往文獻(xiàn)［8-11］ 報(bào)道一致。

在AVF 內(nèi)膜增生過程中，一直存在血流動(dòng)力學(xué)的改變，剪切力作用也起重要作用。血流動(dòng)力是對內(nèi)皮細(xì)胞最直接的生理刺激，在各種血管生物學(xué)過程中起重要作用［12-17］。研究［18］ 顯示：絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK） 信號通路介導(dǎo)低剪切力誘導(dǎo)的氧化損傷，而低剪切力可促進(jìn)ERK、p38 和JNK 磷酸化，表明ERK、p38 和JNK 通路與剪切力作用下細(xì)胞的內(nèi)皮功能障礙有關(guān)。ERK1/2 磷酸化后可與細(xì)胞核內(nèi)的Egr-1 結(jié)合， 并促進(jìn)早期生長反應(yīng)因子1 （earlygrowth responsive-1，Egr-1） 轉(zhuǎn)錄和激活，而Egr-1是剪切力調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的主要細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子［19-24］。

本課題組前期研究［25］ 發(fā)現(xiàn)：剪切力可以通過調(diào)控小窩蛋白-1-ERK1/2 信號通路影響內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果顯示： 在尿毒癥毒素刺激下的hUVECs 經(jīng)過STS 預(yù)處理后， 給予一定時(shí)間的剪切力刺激模擬AVF 建立后的剪切力改變， 發(fā)現(xiàn)hUVECs 中與細(xì)胞增殖相關(guān)的細(xì)胞因子I 型膠原在經(jīng)STS 預(yù)處理后較處理前升高， 而進(jìn)一步抑制ERK 通路， 可以明顯降低I 型膠原的表達(dá)， 提示STS 能通過激活ERK 通路增強(qiáng)細(xì)胞增殖因子的表達(dá)， 從而改善內(nèi)皮細(xì)胞的功能。在mRNA 水平，給予STS 處理后， 也存在相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子水平表達(dá)的變化。

尿毒癥毒素刺激下也存在微炎癥狀態(tài)， 其對AVF 的內(nèi)膜增生也有影響。在與細(xì)胞增殖相關(guān)的細(xì)胞因子中，NF-κB 途徑可以引起內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)以及凋亡發(fā)生［17］。本研究結(jié)果顯示： 尿毒癥環(huán)境下hUVECs 中NF-κB 表達(dá)水平升高， 而經(jīng)STS 處理后表達(dá)水平降低， 而經(jīng)過一定時(shí)間的剪切力刺激后， 尿毒癥環(huán)境下NF-κB 表達(dá)水平降低，而經(jīng)STS 處理后其表達(dá)水平升高，抑制ERK信號通路后其表達(dá)水平降低。提示尿毒癥環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB 的表達(dá)與剪切力刺激有關(guān)， 長期剪切力刺激后可使STS 促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB 的表達(dá)。同時(shí)ERK 通路作為參與細(xì)胞增殖的重要信號通路，在靜態(tài)尿毒癥環(huán)境中也呈類似的變化，提示在血流動(dòng)力學(xué)影響下， STS 對內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響可能與靜態(tài)條件的作用不同， 可能是通過ERK 通路參與細(xì)胞增殖。而AVF 的成熟需要適當(dāng)?shù)耐庀蛐詢?nèi)膜擴(kuò)張， 維持適度的彈性。STS 的作用可能會(huì)有助于這種AVF 的成熟。

綜上所述， STS 作為一種中藥成分， 未來需要在不同剪切力環(huán)境下探討其對AVF 功能的影響，并進(jìn)行更加深入的分子機(jī)制研究，以期為AVF 功能不良防治提供新的治療策略。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：王立華參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)施、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及論文撰寫，賈嵐參與實(shí)驗(yàn)技術(shù)操作，陳海燕參與實(shí)驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)和數(shù)據(jù)分析，楊波參與實(shí)驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)，王喆和畢學(xué)青參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

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[基金項(xiàng)目] 天津市衛(wèi)健委中醫(yī)中西醫(yī)結(jié)合項(xiàng)目（2021173）