［摘要］ 牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞（DMSCs） 是來(lái)源于神經(jīng)嵴外胚層的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有優(yōu)越的自我更新和多向分化的能力，被廣泛應(yīng)用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)研究。利用三維培養(yǎng)方法可對(duì)DMSCs進(jìn)行大量體外擴(kuò)增以滿(mǎn)足研究和治療的需要。與傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)方法比較，三維培養(yǎng)技術(shù)可更有效地模擬干細(xì)胞在體內(nèi)所處的結(jié)構(gòu)和微環(huán)境，從時(shí)間和空間上共同調(diào)控干細(xì)胞的增殖及分化。近年來(lái)開(kāi)展的體外三維培養(yǎng)方法較多，懸滴培養(yǎng)法操作簡(jiǎn)單，但較難控制培養(yǎng)組織的氣象環(huán)境；微流控芯片可更好地控制細(xì)胞參數(shù)，但成本高昂，且存在技術(shù)平臺(tái)的難題而難以廣泛應(yīng)用；磁懸浮培養(yǎng)費(fèi)用低廉，操作簡(jiǎn)便，細(xì)胞成球速度快，但由于磁化作用難以用來(lái)定量分析。其他三維培養(yǎng)方法還包括旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、離心成球培養(yǎng)法、液體覆蓋法和人工支架法等，上述培養(yǎng)方法都存在不同的優(yōu)勢(shì)和一定的局限性?，F(xiàn)對(duì)體外三維培養(yǎng)DMSCs 的不同方法及其在不同組織再生和疾病治療中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，為DMSCs 功能的精準(zhǔn)調(diào)控和再生醫(yī)學(xué)研究提供參考。

［關(guān)鍵詞］ 牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞； 球體培養(yǎng)； 干性維持； 組織工程； 再生醫(yī)學(xué)

［中圖分類(lèi)號(hào)］ R780. 2 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞（dental mesenchymalstem cells， DMSCs） 包括牙髓干細(xì)胞（dentalpulp stem cells， DPSCs）、牙齦干細(xì)胞（gingivalfibroblastic stem cells， GFSCs）、牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells， PDLSCs）、乳牙干細(xì)胞（stem cells from human exfoliated teeth，SHED）、牙囊干細(xì)胞（dental follicular stem cells，DFSCs） 和牙乳頭干細(xì)胞（stem cells from apicalpapilla， SCAP） 等。DMSCs 具有多向分化潛能，且容易獲得，免疫原性低，這些特性使得DMSCs成為再生醫(yī)學(xué)重要的種子細(xì)胞，為多種組織相關(guān)疾病的治療提供可能。將組織內(nèi)提取的DMSCs 在體外進(jìn)行大量擴(kuò)增，獲取足夠的種子細(xì)胞，這對(duì)再生醫(yī)學(xué)的研究至關(guān)重要。傳統(tǒng)的二維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，往往缺乏組織特異性結(jié)構(gòu)，難以模擬體內(nèi)生物學(xué)行為和細(xì)胞之間的相互作用。與二維培養(yǎng)方法比較，最新的三維球體培養(yǎng)方法可以更好地模擬干細(xì)胞在體內(nèi)所處的結(jié)構(gòu)與環(huán)境，且能夠增加細(xì)胞間和細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM） 間的相互作用，使干細(xì)胞可以更好地維持干性并發(fā)揮更大的分化潛能。

目前綜述類(lèi)報(bào)道［1-2］ 中關(guān)于不同細(xì)胞三維培養(yǎng)的方法及其優(yōu)缺點(diǎn)，多針對(duì)其他組織來(lái)源的干細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，未見(jiàn)針對(duì)DMSCs 不同培養(yǎng)方法及應(yīng)用的報(bào)道。本文作者特異性針對(duì)DMSCs，系統(tǒng)分析并總結(jié)了近年來(lái)DMSCs 不同三維培養(yǎng)的方法及其優(yōu)缺點(diǎn)以及其在組織再生和疾病治療中的作用，為進(jìn)一步深入研究并探索不同培養(yǎng)方法對(duì)DMSCs在組織再生和疾病治療中的應(yīng)用提供參考。

1 DMSCs 的三維培養(yǎng)方法

1. 1 懸滴培養(yǎng)法

三維培養(yǎng)方法中的懸滴培養(yǎng)法是由HARRION 等創(chuàng)立的一種培養(yǎng)組織和器官的方法［3］，利用載有細(xì)胞懸滴培養(yǎng)液的表面張力來(lái)形成無(wú)骨架的三維細(xì)胞球體［4-5］。

與其他三維培養(yǎng)方法比較，懸滴培養(yǎng)法操作簡(jiǎn)單，有利于細(xì)胞間緊密聚合，使細(xì)胞間以及細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)間的相互作用增強(qiáng)，提高了DMSCs 的分化潛能［6-7］。在音猬因子（sonic hedgehog， SHH）誘導(dǎo)下， DPSCs 可分化成神經(jīng)細(xì)胞用于神經(jīng)退行性疾病的治療［7］。研究［6，8］ 表明：利用懸滴培養(yǎng)法培養(yǎng)的DPSCs 和PDLSCs 分化能力及礦化能力較應(yīng)用二維貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)的細(xì)胞更強(qiáng)。MORITANI 等［9］ 基于懸滴培養(yǎng)法設(shè)計(jì)了微孔芯片用來(lái)培養(yǎng)人牙周韌帶間充質(zhì)干細(xì)胞（humanperiodontal ligament mesenchymal stromal cells，hPDLMSCs），發(fā)現(xiàn)所培養(yǎng)的細(xì)胞與調(diào)節(jié)干性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和mRNA 表達(dá)水平均較單層hPDLMSCs 升高，且礦化結(jié)節(jié)明顯增多。

采用懸滴培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞也存在一些不足，如培養(yǎng)所需的氣象環(huán)境較難控制， 細(xì)胞懸滴易被污染，不易懸掛等。針對(duì)懸滴培養(yǎng)法應(yīng)用過(guò)程中氣象環(huán)境較難控制的缺點(diǎn)， 李秀群等［3］ 改良了Maximow 雙蓋片法，即在瓶底加入一定量的Hanks緩沖液，利用碳酸氫鈉和水的作用釋放二氧化碳，利用水分蒸發(fā)調(diào)節(jié)相對(duì)濕度，進(jìn)而創(chuàng)造出適宜的氣象環(huán)境。針對(duì)細(xì)胞懸滴培養(yǎng)液不易懸掛的問(wèn)題，液滴體積應(yīng)限制在50 μL 以下以保證重力和表面張力達(dá)到平衡而形成懸滴［10］。

除此之外，懸滴培養(yǎng)法培養(yǎng)的細(xì)胞聚合物容易由于營(yíng)養(yǎng)物和氧氣的缺乏導(dǎo)致中心壞死，控制細(xì)胞接種數(shù)在合適的范圍內(nèi)可避免這種情況的發(fā)生［8］。懸滴培養(yǎng)法可與芯片技術(shù)結(jié)合，如微流體懸滴芯片和超疏水芯片，通過(guò)裝置泵不斷更新培養(yǎng)基，補(bǔ)充消耗掉的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期培養(yǎng)［10-11］。

1. 2 微流控芯片

微流控芯片是一種由微米級(jí)的培養(yǎng)室、通道和微泵等功能元件構(gòu)成的由微流體控制的裝置。這種裝置可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、組織和化學(xué)試劑等進(jìn)行制備、反應(yīng)、分離及檢測(cè)等操作［12-13］，主要由水油兩相的兩根微米級(jí)通道組成，由于水油不相容，持續(xù)流動(dòng)的含細(xì)胞的水相液體在油相液體中會(huì)形成水相多細(xì)胞球［14］。

微流控芯片具有以下特點(diǎn)：①可以通過(guò)改變動(dòng)態(tài)參數(shù)來(lái)調(diào)控微米級(jí)通道中細(xì)胞的流動(dòng)，模擬特定的環(huán)境以滿(mǎn)足多細(xì)胞球體的培養(yǎng)需求［15］； ②可以控制多細(xì)胞球體的體積，控制剪切應(yīng)力以減小細(xì)胞損傷，降低試劑損耗；③可以在相對(duì)空間和時(shí)間尺度對(duì)細(xì)胞的微環(huán)境進(jìn)行干預(yù)調(diào)節(jié)，精確控制物質(zhì)濃度、溶液溫度和pH 值等，更精確地模擬干細(xì)胞在體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境，在疾病發(fā)病機(jī)制研究和藥物篩選等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

近年來(lái)，微流控芯片被廣泛應(yīng)用于DMSCs 的研究中。微流控芯片可用于監(jiān)測(cè)DMSCs 的細(xì)胞遷移［13］， RUFAS 等［16］ 采用微流控芯片技術(shù)觀察細(xì)胞在補(bǔ)體C3a 梯度下的遷移情況，結(jié)果顯示：牙髓損傷后， 補(bǔ)體C3a 能夠募集DPSCs 和牙髓成纖維細(xì)胞（dental pulp fibroblasts，DPFs）。微流控芯片可通過(guò)添加物理和化學(xué)刺激因素來(lái)研究牙源性細(xì)胞的生理及病理活動(dòng)，如采用該技術(shù)評(píng)估氟化二胺銀（silver diammine fluoride， SDF） 對(duì)DPSCs 的毒性潛力［17］， 探討根尖SCAP 對(duì)微流體中牙科材料的反應(yīng)［18］。研究者［19］ 利用微流控芯片技術(shù)將DPSCs固定在具有生物相容性材料的微膠囊中，為細(xì)胞提供三維細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境， 通過(guò)更好地控制細(xì)胞參數(shù)，使細(xì)胞保持增殖和神經(jīng)元分化的潛能。

微流控芯片技術(shù)也存在一些不足，如生產(chǎn)成本高昂、制備難度大、核心技術(shù)缺乏規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)化以及相關(guān)人才嚴(yán)重不足，因此很難廣泛應(yīng)用。

1. 3 磁懸浮培養(yǎng)法

磁懸浮培養(yǎng)法是細(xì)胞在磁懸浮系統(tǒng)中與磁顆粒結(jié)合，受磁力作用而保持懸浮狀態(tài)的一種三維培養(yǎng)技術(shù)，通過(guò)對(duì)磁場(chǎng)的空間控制，可以控制細(xì)胞團(tuán)的幾何形狀，使細(xì)胞間接觸、凝集而形成細(xì)胞球體［20-21］。磁懸浮培養(yǎng)法由SOUZA 等［21］于2010 年開(kāi)創(chuàng)， 使細(xì)胞攝取由噬菌體顆粒、磁性氧化鐵和金納米顆粒組成的生物無(wú)機(jī)水凝膠，隨后進(jìn)行磁懸浮。在此基礎(chǔ)上，有研究者［21］ 提出用金、氧化鐵和聚-l-賴(lài)氨酸納米顆粒構(gòu)成的磁性納米顆粒以靜電及非特異性結(jié)合的方式結(jié)合到細(xì)胞膜上以磁化細(xì)胞。

磁懸浮培養(yǎng)法具有費(fèi)用低廉，操作簡(jiǎn)便，生物兼容性好［20］，且磁懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)的細(xì)胞活力強(qiáng)，球體核心的壞死少等優(yōu)勢(shì)［22］。與常規(guī)三維培養(yǎng)技術(shù)相比，磁懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)的細(xì)胞球體成形更快，可以形成緊密連接并可自行分泌內(nèi)源性ECM ［23-24］，因此無(wú)需使用人工基質(zhì)或?qū)Ｓ媒橘|(zhì)，獲得的球體可以長(zhǎng)期培養(yǎng)。CHAN 等［25］ 利用磁懸浮培養(yǎng)人DPSCs （human DPSCs， hDPSCs）， 結(jié)果表明：磁懸浮培養(yǎng)法可快速形成球體，且結(jié)構(gòu)牢固，不損傷細(xì)胞， 提高了hDPSCs 用于再生醫(yī)學(xué)的治療效率。磁懸浮培養(yǎng)法的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可以通過(guò)操縱磁場(chǎng)的強(qiáng)度從而改變細(xì)胞培養(yǎng)物的形狀，在組成細(xì)胞球體之后，即使去除磁場(chǎng)，細(xì)胞球體的完整性仍然保持 ［26］。與其他無(wú)磁性培養(yǎng)物比較，磁性三維培養(yǎng)物結(jié)構(gòu)更加緊湊， 具有更多的脂滴和細(xì)胞外囊泡，培養(yǎng)的細(xì)胞分化能力更強(qiáng) ［27］。同時(shí)，磁懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)的球體多系譜分化能力、表面標(biāo)志物和胞外基質(zhì)表達(dá)及成骨和血管生成蛋白均高于二維細(xì)胞以及三維聚集體。磁懸浮培養(yǎng)法還可以明顯激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated proteinkinase， MAPK） 和核因子κB （nuclear factorkappa B， NF-κB） 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路， 改善三維培養(yǎng)的細(xì)胞凋亡效應(yīng) ［22］。

磁懸浮培養(yǎng)法也存在劣勢(shì)：①可能會(huì)由于磁體的不均勻磁化、單元大小和聚集程度等因素，使測(cè)量區(qū)域定義不明確，從而使定量分析受到影響［27］；②高磁引力條件會(huì)使人間充質(zhì)干細(xì)胞呈現(xiàn)典型凋亡特征［28］。

1. 4 旋 轉(zhuǎn) 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 系 統(tǒng)（rotary cell culturesystem， RCCS）

RCCS 又稱(chēng)轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器，是一種應(yīng)用微載體技術(shù)，通過(guò)模擬微重力環(huán)境使細(xì)胞、組織和培養(yǎng)液處于類(lèi)似自由落體的狀態(tài)下旋轉(zhuǎn)，產(chǎn)生貼壁和懸浮的三維球體細(xì)胞，繼而進(jìn)行細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)增的三維體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)［29-30］。

RCCS 的微重力環(huán)境和低剪切應(yīng)力有利于細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)分化［31］。王田田等［32］ 研究顯示：與普通重力培養(yǎng)的細(xì)胞比較，模擬微重力環(huán)境培養(yǎng)的hDPSCs 的體內(nèi)增殖能力更強(qiáng)。侯延華［33］ 研究表明：應(yīng)用微載體與RCCS 相結(jié)合的三維球體培養(yǎng)法在體外培養(yǎng)DPSCs， 較普通二維培養(yǎng)在生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖上有顯著的差異，可延長(zhǎng)細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，快速得到大量擴(kuò)增的DPSCs。RCCS 模擬的微重力環(huán)境可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的神經(jīng)向分化，適合神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)［34-35］。李石［36］ 關(guān)于PDLSCs 的增殖分化能力影響的研究結(jié)果顯示：采用RCCS 培養(yǎng)出的細(xì)胞最顯著的優(yōu)點(diǎn)是具有非常高的比表面積，其培養(yǎng)效率極高，培養(yǎng)出的細(xì)胞生命力旺盛，在骨誘導(dǎo)條件下，RCCS 所產(chǎn)生的微重力環(huán)境可以促進(jìn)細(xì)胞向成骨方向分化。LI 等［37］ 研究表明：使用RCCS模擬微重力環(huán)境培養(yǎng)DPSCs 可以提高其增殖和牙源分化能力。

與細(xì)胞的靜態(tài)培養(yǎng)比較，RCCS 培養(yǎng)的細(xì)胞受到外界機(jī)械力小， 受到機(jī)械損傷少， 細(xì)胞自由度高，易形成三維球體［31］。在RCCS 生物反應(yīng)器中，細(xì)胞呈自由落體狀態(tài)，轉(zhuǎn)動(dòng)和混合不受單個(gè)方向重力向量的影響，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞向各個(gè)方向生長(zhǎng)［30］。且由于處于微重力環(huán)境下，細(xì)胞內(nèi)部微管的聚合、解聚受影響， 細(xì)胞內(nèi)部壓力小， 分子發(fā)生相應(yīng)改變， 因此細(xì)胞能夠維持良好的形態(tài)［31］。同時(shí)， 細(xì)胞額外受到了血液流動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，具有應(yīng)力纖維，延緩細(xì)胞的增殖速度，細(xì)胞不易快速衰老，可以更好地參與后續(xù)實(shí)驗(yàn)［38］。

RCCS 存在的不足之處：①RCCS 儀器的使用成本較高， 儀器使用和消毒方法較為繁瑣［30］；②根據(jù)RCCS 原理，旋轉(zhuǎn)半徑會(huì)受到限制，在一定程度影響其培養(yǎng)規(guī)模［36］。

1. 5 離心成球培養(yǎng)法

離心成球培養(yǎng)法是通過(guò)離心增加細(xì)胞間黏附，隨后將細(xì)胞沉淀重懸于細(xì)胞培養(yǎng)基中，再將細(xì)胞分配至具有細(xì)胞排斥表面的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上獲得三維球體細(xì)胞團(tuán)［39］。

離心成球培養(yǎng)法可以模擬細(xì)胞在體內(nèi)的發(fā)育過(guò)程， 增加細(xì)胞間以及細(xì)胞與ECM 的相互聯(lián)系［40］。在細(xì)胞聚集成球的過(guò)程中，該培養(yǎng)法使用的是非蛋白質(zhì)水溶性基質(zhì)， 因此可以快速地分離細(xì)胞球體［39］。與單層細(xì)胞培養(yǎng)比較， 通過(guò)離心成球培養(yǎng)法構(gòu)建的大鼠DPSCs 的體外三維培養(yǎng)模型的細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯變化， 但細(xì)胞中堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP） 活性明顯升高［41］。ALP 可能通過(guò)調(diào)節(jié)膠原合成， 促進(jìn)牙本質(zhì)的高度礦化， 可應(yīng)用于齲病和牙髓病的治療。FERRé 等［42］ 研究表明：利用離心成球培養(yǎng)法培養(yǎng)的人牙齦干細(xì)胞（human gingival stem cells，HGSCs） 具有分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞譜系的能力，因此HGSCs 應(yīng)用于牙周病和骨質(zhì)疏松等疾病治療的研究。

離心成球培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、可控性強(qiáng)、效益高、成本低，對(duì)于少量細(xì)胞的培養(yǎng)制備速度較快［43］。該方法的不足之處： 離心分離獲得的細(xì)胞團(tuán)密度過(guò)高，缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸通道，物質(zhì)交換困難，導(dǎo)致中心壞死或凋亡［10， 44-45］。因此這種方法培養(yǎng)的細(xì)胞體積受限，培養(yǎng)周期和藥物處置時(shí)間需要控制［10］。

1. 6 液體覆蓋法

液體覆蓋法主要原理是利用非貼壁培養(yǎng)板來(lái)抑制細(xì)胞與培養(yǎng)板間的低黏性表面吸附，使得細(xì)胞與細(xì)胞之間開(kāi)始相互吸引，自發(fā)地聚集形成細(xì)胞球體［46］。低黏性表面可由瓊脂、瓊脂糖凝膠或聚甲基丙烯酸甲酯制成，這些材料制成的培養(yǎng)層可有效抑制其對(duì)細(xì)胞的吸附［46-47］。

液體覆蓋法操作簡(jiǎn)單，成本較低，不需要專(zhuān)用設(shè)備；細(xì)胞受到的剪切應(yīng)力低，培養(yǎng)過(guò)程中容易接觸細(xì)胞球， 還可以長(zhǎng)期大規(guī)模地獲取球體細(xì)胞［47-48］。然而，這種方法也存在以下弊端：①液體覆蓋法屬于靜態(tài)培養(yǎng)法，即培養(yǎng)基內(nèi)物質(zhì)均處于靜止?fàn)顟B(tài)， 代謝產(chǎn)物會(huì)隨著培養(yǎng)進(jìn)程的發(fā)展不斷堆積， 可能會(huì)影響細(xì)胞的正常生理活動(dòng)［49］； ②在非貼壁培養(yǎng)板的低吸附表面上，細(xì)胞球體的生長(zhǎng)狀態(tài)易受影響，可重復(fù)性低［48］。

1. 7 人工支架法

常規(guī)細(xì)胞體外培養(yǎng)多缺乏ECM成分，這可能不利于細(xì)胞的存活和增殖，特別對(duì)于干細(xì)胞的培養(yǎng)造成較大的影響。人工支架法可通過(guò)模擬天然的ECM 來(lái)改善細(xì)胞的增殖活性［50］。人工支架法通過(guò)將細(xì)胞接種在人工基質(zhì)構(gòu)成的支架對(duì)細(xì)胞進(jìn)行三維培養(yǎng)，細(xì)胞附著于支架后逐漸遷移至支架內(nèi)部，并在支架的間隙中形成細(xì)胞球體［48］。

水凝膠是一種常見(jiàn)的用于模擬ECM 的生物材料，具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和良好的生物相容性，可為細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)和遷移提供支持 ［10，51］。通過(guò)調(diào)整水凝膠的物理特性，或根據(jù)研究目的引入不同功能的官能團(tuán)，可創(chuàng)造出穩(wěn)定且適合特定細(xì)胞生長(zhǎng)分化的微環(huán)境［52］。天然水凝膠（膠原蛋白） 具有支撐細(xì)胞的作用， 為細(xì)胞間物質(zhì)交換提供了良好的空間，且具有可降解和低毒性等優(yōu)點(diǎn)。研究［53］ 表明：膠原蛋白，尤其是Ⅰ型膠原蛋白能較好地促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的增殖和礦化。肽段水凝膠材料，即一種含有肽鍵的高分子水凝膠材料，也是現(xiàn)階段廣泛應(yīng)用的支架材料［51］。

FUKUSHIMA 等［54］ 研究發(fā)現(xiàn)：用水凝膠支架培養(yǎng)的DPSCs 都能夠形成與牙髓相似的結(jié)締組織。納米纖維素-殼聚糖熱敏水凝膠培養(yǎng)的hDPSCs 可用于微創(chuàng)軟骨再生［55］?？愋赖龋?1］ 研究表明：凝膠樣支架常被用于牙髓組織再生。黃健萍等［56］ 研究結(jié)果顯示： 由鈣黏蛋白多肽修飾的透明質(zhì)酸（hyaluronic acid， HA） 水凝膠可作為牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的理想支架，有助于牙髓-牙本質(zhì)的再生。 李鑫平制備的改性后的 β - 磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP） /殼聚糖水凝膠可促進(jìn)DPSCs 的早期黏附、增殖和成骨分化［57］。

但人工支架法的缺陷在于：①膠原和水凝膠支架法穩(wěn)定性較差，且支架的引入可能會(huì)改變細(xì)胞的微環(huán)境，干擾細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用，并產(chǎn)生有毒小分子［52］。若支架含有動(dòng)物源成分， 可能干擾研究結(jié)果［48］；②支架材料的濃度控制是一大難點(diǎn)，支架材料濃度較高時(shí)， 材料流動(dòng)性下降， 常會(huì)形成氣泡影響后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)； 支架材料濃度較低時(shí)， 材料的彈性受到影響， 進(jìn)而抑制牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的發(fā)生［51］。③支架外形較為固定， 導(dǎo)致可重復(fù)性低；且細(xì)胞僅黏附于支架的表面，細(xì)胞培養(yǎng)效率較低，不能形成理想的細(xì)胞分布形式［58］。

2 DMSCs 三維培養(yǎng)的應(yīng)用

DMSCs 具有多向分化潛能， 在適當(dāng)條件下可以分化為牙組織細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等。三維培養(yǎng)方法可以誘導(dǎo)其定向分化為多種需要的組織細(xì)胞，可以增強(qiáng)干細(xì)胞因子分泌的功能，從而實(shí)現(xiàn)有效的干細(xì)胞治療的目的。

2. 1 牙體組織再生

根管治療目前雖廣泛應(yīng)用于齲病引起的牙髓受損或壞死的治療，但這種療法會(huì)導(dǎo)致牙齒活力喪失。而基于DMSCs 的牙髓組織工程利用適當(dāng)?shù)闹Ъ苋S細(xì)胞培養(yǎng)以修復(fù)牙髓，保持牙髓活力［59］， 恢復(fù)其正常生理功能。研究［60］ 顯示：將DPSCs 與人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，在三維培養(yǎng)皿中獲得微球體，再將微球體置于牙根片段內(nèi)，將其植入免疫缺陷鼠背部皮下，4 周后可見(jiàn)血管和牙髓樣組織再生。研究［61］ 表明： 將SHED 和生物支架（Puramatrix ? 或 rhCollagentype Ⅰ） 置入全長(zhǎng)根管后移植到裸鼠背部皮下后，SHED 可分化成具有分泌功能的成牙本質(zhì)細(xì)胞，并形成與正常牙髓的細(xì)胞、血管組分類(lèi)似的功能性牙髓以及管狀牙本質(zhì)。李欣悅等［62］ 研究顯示：利用PDLSCs 進(jìn)行三維球體培養(yǎng)，有骨組織和牙周膜類(lèi)似組織的結(jié)合體形成。研究者［63］ 將支架法培養(yǎng)的DPSCs 進(jìn)行體內(nèi)種植， 出現(xiàn)了再生牙根， 再生牙根在6 個(gè)月后初步具備了牙齒的特征，包括牙本質(zhì)小管狀和功能性牙周韌帶狀結(jié)構(gòu)等。

目前利用DMSCs 可分化為牙本質(zhì)細(xì)胞、根尖細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞等特定細(xì)胞的能力，雖已實(shí)現(xiàn)牙髓-牙本質(zhì)再生，但僅局限于異位再生，尚未實(shí)現(xiàn)在口腔中的牙髓-牙本質(zhì)再生。

2. 2 骨和軟骨再生

骨組織異常常是因嚴(yán)重機(jī)械損傷、 炎癥、 先天疾病和腫瘤等導(dǎo)致的［61］，DMSCs 具有向成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞分化的潛能，且不同來(lái)源的DMSCs 的各向分化能力有所差異［64］，因此DMSCs 在骨組織再生領(lǐng)域的應(yīng)用前景非常廣闊。TATSUHIRO 等［65］ 研究顯示： 由細(xì)胞、ECM 和鈣化基質(zhì)組成的hDPSC 構(gòu)建體可能成為骨再生無(wú)支架材料。JAHANBIN 等［66］ 對(duì)SHED進(jìn)行成骨分化的定向誘導(dǎo)，并與支架膠原蛋白基質(zhì)一并接種于鼠的上頜牙槽骨缺損處，可介導(dǎo)新骨形成，治療效果與自體髂骨移植類(lèi)似。KHAJEH 等［67］發(fā)現(xiàn)缺氧條件下DPSCs 的軟骨分化能力增強(qiáng)。KIM 等［68］ 研究表明： 體外三維培養(yǎng)的人DSFCs（human DFSCs， hDFSCs） 球體可用作骨組織再生的自體干細(xì)胞。目前利用DMSCs 的三維培養(yǎng)已成為提高人工移植物骨再生潛力的重要因素［64］。

2. 3 神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療

神經(jīng)系統(tǒng)疾病一般較為嚴(yán)重，主要由于神經(jīng)元細(xì)胞為非再生細(xì)胞。神經(jīng)系統(tǒng)的再生修復(fù)能力有限，藥物和手術(shù)等治療方式很難從根本上解決受損神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及功能重建問(wèn)題［61］。而DMSCs 不僅擁有強(qiáng)大的多向分化潛能，而且與神經(jīng)細(xì)胞均來(lái)源于神經(jīng)嵴外胚層，可用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。研究［69］ 發(fā)現(xiàn)：SHED 可向神經(jīng)細(xì)胞系定向分化， SHED 誘導(dǎo)分化形成神經(jīng)球后， 經(jīng)進(jìn)一步誘導(dǎo)可形成多巴胺能神經(jīng)元。將SHED 植入損傷的鼠坐骨神經(jīng)，可觀察到神經(jīng)纖維數(shù)量增加［61］ 。 ROOZAFZOON 等［69］ 成功將DPSCs 在三維球體培養(yǎng)系統(tǒng)中分化出視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞，提示其可用于青光眼等神經(jīng)退行性疾病的治療。

2. 4 免疫系統(tǒng)疾病的治療

在我國(guó)，牙周病的患病率高于齲病， 隨著對(duì)牙周病發(fā)病機(jī)制的深入研究，目前認(rèn)為牙周病的罹患多由宿主的免疫應(yīng)答引起，而非感染的微生物直接引起［70］。王松靈［71］ 通過(guò)對(duì)生理以及炎癥狀態(tài)下的DMSCs 免疫學(xué)特性的研究發(fā)現(xiàn)，生理狀態(tài)下DMSCs 具有良好的免疫調(diào)節(jié)能力。羅傲翔等［70］ 研究顯示：通過(guò)三維培養(yǎng)的PDLSCs 能提高其抗炎特性， 降低宿主免疫應(yīng)答，緩解炎癥反應(yīng)， 提示三維培養(yǎng)的PDLSCs 對(duì)牙周炎的治療有一定的應(yīng)用前景。綜上，DMSCs 在牙周炎和自身免疫疾病的治療上具有很大的應(yīng)用潛力。

除了上述疾病的治療應(yīng)用， 利用三維培養(yǎng)的DMSCs 在角膜修復(fù)、肝炎治療、改善糖尿病患者臨床癥狀和肺損傷修復(fù)等領(lǐng)域也得到了不同程度的應(yīng)用［61］。

3 結(jié) 語(yǔ)

隨著組織工程和臨床治療技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)DMSCs 的需求也在不斷增加。三維球體培養(yǎng)的DMSCs 自我更新能力強(qiáng)，多向分化潛能大，在臨床疾病治療、組織再生和器官移植等方面具有良好的應(yīng)用前景。同時(shí)，三維球體培養(yǎng)技術(shù)存在一定缺陷，主要是球體中心容易因代謝產(chǎn)物堆積、缺氧及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏而發(fā)生壞死。如何解決并消除這一弊端可作為DMSCs 三維球體培養(yǎng)技術(shù)后續(xù)的研究方向之一。

綜上所述，結(jié)合研究需要，選擇合適的方法培養(yǎng)DMSCs，通過(guò)不斷改善三維培養(yǎng)方法，以獲得更好的研究效果，并為進(jìn)一步應(yīng)用于臨床治療奠定基礎(chǔ)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)DMSCs 在骨分化、軟骨分化和神經(jīng)分化等方面具有巨大分化潛能，后續(xù)研究可以繼續(xù)向其他分化方向進(jìn)行探索。此外，DMSCs已應(yīng)用于骨損傷治療等方面，但口腔治療領(lǐng)域的應(yīng)用研究依然較少，可以期待將具有多向分化能力的DMSCs 更多地應(yīng)用在口腔環(huán)境中的牙髓再生、牙本質(zhì)或牙釉質(zhì)修復(fù)等領(lǐng)域。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：安政雯負(fù)責(zé)論文的整體設(shè)計(jì)，李國(guó)鑫、趙小琳、李晨曦、劉影馳、朱芷墨和袁瑤負(fù)責(zé)文獻(xiàn)檢索及論文的撰寫(xiě)。

[參考文獻(xiàn)]

［1］ 趙范范， 章麗娜， 商迎輝， 等. 神經(jīng)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)及其在神經(jīng)疾病中應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志， 2020， 33（2）： 227-231.

［2］ HABANJAR O， DIAB-ASSAF M， CALDEFIECHEZETF， et al. 3D cell culture systems： tumorapplication， advantages， and disadvantages［J］. Int JMol Sci， 2021， 22（22）： 12200.

［3］ 李秀群， 薛慶善， 保天然， 等. 改良的懸滴培養(yǎng)法［J］.四川解剖學(xué)雜志， 1995， 3（2）： 119-119.

［4］ 林鶴， 王婉秋， 焦佳媛， 等. 培養(yǎng)板懸滴法三維細(xì)胞培養(yǎng)模型建立及細(xì)胞活力檢測(cè)方法比較［J］. 藥物評(píng)價(jià)研究， 2017， 40（8）： 1103-1106.

［5］ FOTY R. A simple hanging drop cell culture protocol forgeneration of 3D spheroids［J］. J Vis Exp， 2011（51）：2720.

［6］ 羅傲翔， 吳補(bǔ)領(lǐng)， 侯晉， 等. 3D培養(yǎng)牙周膜干細(xì)胞生物學(xué)特性的初步研究［J］. 牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2014（5）： 264-268.

［7］ FARHANG S，SOLEIMANI M，OSTADSHARIF M，et al. Neurogenic induction of human dental pulp derivedstem cells by hanging drop technique， basic fibroblastgrowth factor， and SHH factors［J］. Dental Res J， 2021，18： 57.

［8］ 羅傲翔， 吳補(bǔ)領(lǐng). 懸滴法培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞生物學(xué)特性的初步研究［C］. 廣州： 2014年第九次全國(guó)牙體牙髓病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編，2014： 105.

［9］ MORITANI Y， USUI M， SANO K， et al. Spheroidculture enhances osteogenic potential of periodontalligament mesenchymal stem cells［J］. J Periodontal Res，2018， 53（5）： 870-882.

［10］SUN B Y，ZHAO Y，WU W M，et al.A superhydrophobicchip integrated with an array of medium reservoirs forlong-term hanging drop spheroid culture ［J］. ActaBiomater， 2021， 135： 234-242.

［11］鄧俊豪， 李 苗， 張里程， 等. 三維懸滴法培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞在組織損傷修復(fù)中的應(yīng)用及優(yōu)勢(shì)［J］. 中國(guó)組織工程研究， 2020， 24（7）：1101-1106.

［12］關(guān)冀弛， 劉 丹， 陳艷閣， 等. 神經(jīng)細(xì)胞三維培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展［J］. 精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)雜志， 2022， 37（6）： 554-558， 564.

［13］張荷旋，侯本祥. 微流控芯片在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)用口腔科雜志，2021，14（5）：610-614.

［14］梁 瑜， 喬 勇， 劉星志， 等. 三維成球培養(yǎng)優(yōu)化間充質(zhì)干細(xì)胞的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)材料進(jìn)展，2020，39（4）：278-286.

［15］SHAO C， CHI J， SHANG L， et al. Dropletmicrofluidics-based biomedical microcarriers［J］. ActaBiomater， 2022， 138：21-33.

［16］RUFAS P， JEANNEAU C， ROMBOUTS C， et al.Complement C3a mobilizes dental pulp stem cells andspecifically guides pulp fibroblast recruitment［J］.J Endodontics， 2016， 42（9）：1377-1384.

［17］SHIJIA H. Characterization of silver diamine fluoridecytotoxicity using microfluidic tooth-on-a-chip andgingival equivalents［J］. Dental Mat， 2022，38（8）： 1385-1394.

［18］FRAN?A C M， TAHAYERI A， RODRIGUES N S，et al. The tooth on-a-chip： a microphysiologic modelsystem mimicking the biologic interface of the tooth withbiomaterials［J］. Lab on a Chip， 2020， 20（2）： 405-413.

［19］LORENA H S J， PHIL S， BING S， et al. Microfluidicencapsulation supports stem cell viability， proliferation，and neuronal differentiation［J］. Tissue Eng Part C，2018， 24（3）： 158-170.

［20］李正鈞， 梁高峰. 三維腫瘤球聚體的構(gòu)建及其研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新， 2015， 12（9）： 147-149.

［21］SOUZA G R， MOLINA J R， RAPHAEL R M， et al.Three-dimensional tissue culture based on magnetic celllevitation［J］. Nat Nanotechnol， 2010， 5（4）： 291-296.

［22］LEWIS N S， LEWIS E E L， MULLIN M， et al.Magnetically levitated mesenchymal stem cell spheroidscultured with a collagen gel maintain phenotype andquiescence［J］. J Tissue Eng， 2017， 8： 2041-7314.

［23］肖成榮， 李丹丹， 高月. 3D HepG2細(xì)胞肝毒性評(píng)價(jià)模型的建立［C］. 重慶： 2016年第六屆全國(guó)藥物毒理學(xué)年會(huì)論文集， 2016： 201.

［24］MARQUES I A， FERNANDES C， TAVARES N T，et al. Magnetic-based human tissue 3D cell culture： asystematic review［J］.Int J Mol Sci，2022，23（20）：12681.

［25］CHAN Y H， LEE Y C， HUNG C Y， et al. Threedimensionalspheroid culture enhances multipotentdifferentiation and stemness capacities of human dentalpulp-derived mesenchymal stem cells by modulatingMAPK and NF-kB signaling pathways［J］. Stem CellRev Rep， 2021， 17（5）： 1810-1826.

［26］CALEFFI J T，AAL M C E，GALLINDO H O M，et al.Magnetic 3D cell culture： state of the art and currentadvances［J］. Life Sci， 2021， 286： 120028.

［27］GAO Q H， WEN B Q， KANG Y N， et al. Pump-freemicrofluidic magnetic levitation approach for densitybasedcell characterization ［J］. Biosens Bioelectron，2022， 204： 114052.

［28］關(guān)冀弛， 劉 丹， 陳艷閣， 等. 腫瘤細(xì)胞三維培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展［J］. 沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2022， 24（6）： 641-647.

［29］MENG R， XU H， DI S， et al. Human mesenchymalstem cells are sensitive to abnormal gravity and exhibitclassic apoptotic features［J］. Acta Biochim Biophys Sin，2011， 43（2）： 133-142.

［30］來(lái)元亮. 旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的原理及應(yīng)用［J］. 生物化工， 2020， 6（3）： 157-160.

［31］張延芳， 陳槐卿， 黃 華， 等. 旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的力學(xué)環(huán)境及其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響［J］. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志， 2006， 23（2）： 400-404.

［32］王田田， 張巍巍， 朱澌潔， 等. 模擬微重力環(huán)境對(duì)人牙髓干細(xì)胞體內(nèi)增殖能力的影響［J］. 口腔醫(yī)學(xué)研究，2014， 30（6）： 489-492.

［33］侯延華. 人牙髓干細(xì)胞體外三維培養(yǎng)擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)研究［D］. 重慶： 第三軍醫(yī)大學(xué)， 2006.

［34］CHEN J， LIU R R， YANG Y， et al. The simulatedmicrogravity enhances the differentiation of mesenchymalstem cells into neurons［J］. Neurosci Lett，2011，505（2）：171-175.

［35］ZARRINPOUR V，HAJEBRAHIMI Z，JAFARINIA M.Expression pattern of neurotrophins and their receptorsduring neuronal differentiation of adipose-derived stemcells in simulated microgravity condition［J］. Iran J BasicMed Sci， 2017， 20（2）： 178-186.

［36］李 石. 模擬微重力環(huán)境對(duì)人牙周膜干細(xì)胞增殖分化的影響及其機(jī)制的研究［D］. 西安： 第四軍醫(yī)大學(xué)， 2009.

［37］LI Y P， HE L N， PAN S， et al. Three-dimensionalsimulated microgravity culture improves the proliferationand odontogenic differentiation of dental pulp stem cell inPLGA scaffolds implanted in mice［J］. Mol Med Rep，2017， 15（2）： 873-878.

［38］趙靈犀， 丁 皓， 徐 萌， 等. 旋轉(zhuǎn)式三維細(xì)胞培養(yǎng)裝置的研制［J］. 中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)， 2011，15（19）： 3531-3533.

［39］MARITAN S M， LIAN E Y， MULLIGAN L M. Anefficient and flexible cell aggregation method for 3Dspheroid production［J］. J Vis Exp， 2017（121）： 55544.

［40］肖 楊， 劉 然， 邢麗娜， 等. 采用微團(tuán)培養(yǎng)模型探討染料木黃酮的發(fā)育毒性［J］. 癌變·畸變·突變， 2010，22（4）： 271-275.

［41］王亦菁， 宋九余， 金 巖， 等. 牙髓干細(xì)胞體外三維培養(yǎng)及生物學(xué)特性的研究［J］. 現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志， 2009，23（6）： 631-633.

［42］FERRé F C， LARJAVA H， LOISON-ROBERT L S，et al. Formation of cartilage and synovial tissue byhuman gingival stem cells［J］. Stem Cells Dev， 2014，23（23）： 2895-2907.

［43］黃亮節(jié)， 翁土軍， 張春麗， 等. Pellet培養(yǎng)與纖維蛋白凝膠支架體外成軟骨能力的比較［J］.中國(guó)骨與關(guān)節(jié)雜志，2017， 6（3）： 198-203.

［44］ZHANG S Y，BUTTLER-BUECHER P，DENECKE B，et al. A comprehensive analysis of human dental pulp cellspheroids in a three-dimensional pellet culturesystem［J］. Arch Oral Biol， 2018， 91： 1-8.

［45］劉蘭濤， 朱瑜潔， 黃 博， 等. Pellet法和Micromass法誘導(dǎo)軟骨終板干細(xì)胞成軟骨的比較［J］. 中國(guó)矯形外科雜志， 2013， 21（1）： 75-81.

［46］CARLSSON J， YUHAS J M. Liquid-overlay culture of cellular spheroids［J］. Recent Results Cancer Res， 1984，95： 1-23.

［47］梁婷婷， 張世昌. 間充質(zhì)干細(xì)胞球形體培養(yǎng)的研究進(jìn)展［J］.中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志（電子版），2021，11（6）：372-377.

［48］COSTA E C， DE MELO-DIOGO D D， MOREIRA A F，et al. Spheroids formation on non-adhesive surfaces byliquid overlay technique： considerations and practicalapproaches ［J］. Biotechnol J， 2018， 13 （1）. DOI：10.1002/biot.201700417.

［49］馬忠義， 莊 華， 常 成， 等. 多細(xì)胞腫瘤球體培養(yǎng)技術(shù)在膀胱癌治療中的研究進(jìn)展［J］. 腫瘤研究與臨床，2018， 30（7）： 490-493.

［50］ZHANG S H， LIN A Q， TAO Z W， et al.Microsphere-containing hydrogel scaffolds for tissueengineering［J］.Chem Asian J，2022，17（20）：e202200630.

［51］孔麗欣， 李 靜， 徐丹陽(yáng)， 等. 凝膠樣支架材料對(duì)三維培養(yǎng)的人牙髓干細(xì)胞增殖的影響［J］. 口腔醫(yī)學(xué)， 2018，38（7）： 593-597.

［52］HUANG Q T， ZOU Y J， ARNO M C， et al. Hydrogelscaffolds for differentiation of adipose-derived stemcells［J］. Chem Soc Rev， 2017， 46（20）： 6255-6275.

［53］帕爾哈提· 阿布肚熱合曼， 白爾娜· 吾守爾，木合塔爾·霍 加， 等. 兔牙髓干細(xì)胞與Pluronic F-127嵌段共聚物的體外相容性［J］. 中華口腔醫(yī)學(xué)研究雜志（電子版）， 2016， 10（2）： 97-103.

［54］FUKUSHIMA K A，MARQUES M M，TEDESCO T K，et al. Screening of hydrogel-based scaffolds for dentalpulp regeneration-a systematic review［J］. Arch OralBiol， 2019， 98： 182-194.

［55］TALAAT W， ARYAL AC S， KAWAS S A， et al.Nanoscale thermosensitive hydrogel scaffolds promotethe chondrogenic differentiation of dental pulp stem andprogenitor cells： a minimally invasive approach forcartilage regeneration［J］. Int J Nanomedicine， 2020，15： 7775-7789.

［56］黃健萍， 王 君， 林思恩. 鈣粘蛋白多肽修飾的透明質(zhì)酸水凝膠誘導(dǎo)牙本質(zhì)-牙髓再生的研究［J］. 中國(guó)衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)， 2018， 15（9）： 162-163.

［57］李鑫平. β：TCP/殼聚糖水凝膠的改性對(duì)牙髓干細(xì)胞生長(zhǎng)與礦化的影響［D］. 廣州： 南方醫(yī)科大學(xué)， 2019.

［58］于海悅， 麻丹丹， 吳補(bǔ)領(lǐng). 3D打印明膠海藻酸鈉凝膠支架對(duì)人牙髓細(xì)胞的黏附增殖作用［J］. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2017，37（5）：668-672.

［59］RAVINDRAN S， ZHANG Y B， HUANG C C， et al.Odontogenic induction of dental stem cells byextracellular matrix-inspired three-dimensionalscaffold［J］. Tissue Eng Part A， 2014，20（1/2）：92-102.

［60］馬學(xué)娟， 陳 旭. 牙源性干細(xì)胞應(yīng)用于牙髓牙本質(zhì)再生研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)實(shí)用口腔科雜志，2017，10（10）：635-638.

［61］李曉霞， 方滕姣子， 余 湜， 等. 人乳牙牙髓干細(xì)胞在干細(xì)胞治療中的應(yīng)用［J］. 華西口腔醫(yī)學(xué)雜志， 2017，35（5）： 533-537.

［62］李欣悅， 李熙恒， 毛天嬌， 等. 三維培養(yǎng)人牙周膜干細(xì)胞的形態(tài)、活性及成骨分化能力［J］. 中國(guó)組織工程研究， 2023， 27（6）： 846-852.

［63］張曉月， 趙 卿， 王小聰， 等. 牙源性干細(xì)胞在生物牙根中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志， 2022， 38（8）：502-504.

［64］SALGADO C L， BARRIAS C C，MONTEIRO F J M.Clarifying the tooth-derived stem cells behavior in a 3Dbiomimetic scaffold for bone tissue engineeringapplications［J］. Front Bioeng Biotechnol， 2020， 8： 724.

［65］TATSUHIRO F， SEIKO T， YUSUKE T， et al.Dental pulp stem cell-derived， scaffold-free constructsfor bone regeneration［J］. Int J Mol Sci， 2018， 19（7）：1846.

［66］JAHANBIN A， RASHED R， ALAMDARI D H， et al.Success of maxillary alveolar defect repair in rats usingosteoblast-differentiated human deciduous dental pulpstem cells［J］. J Oral Maxillofac Surg， 2016， 74（4）：829.e1-829.e9.

［67］KHAJEH S，RAZBAN V，TALAEI-KHOZANI T，et al.Enhanced chondrogenic differentiation of dental pulpderivedmesenchymal stem cells in 3D pellet culturesystem： effect of mimicking hypoxia ［J］. Biologia，2018， 73（7）： 715-726.

［68］KIM H J， SUNG I Y， CHO Y C， et al. Threedimensionalspheroid formation of cryopreserved humandental follicle-derived stem cells enhances pluripotencyand osteogenic induction properties ［J］. Tissue EngRegen Med， 2019， 16（5）： 513-523.

［69］ROOZAFZOON R， LASHAY A， VASEI M， et al.Dental pulp stem cells differentiation into retinalganglion-like cells in a three dimensional network［J］.Biochem Biophysi Res Com， 2015， 457（2）： 154-160.

［70］羅傲翔， 吳補(bǔ)領(lǐng). 3D 培養(yǎng)牙周膜干細(xì)胞提高其抗炎特性［C］. 北京： 第七次中國(guó)老年口腔醫(yī)學(xué)年會(huì)暨亞洲老年口腔醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編， 2012： 141-142.

［71］王松靈. 異體干細(xì)胞的牙周再生基礎(chǔ)及轉(zhuǎn)化研究［C］.南京： 2016牙周病學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)， 2016： 7-8.

[基金項(xiàng)目] 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82270960）；科技部國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2022YFC2504200）；吉林省科技廳科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（JCSZ2021893-35）