基金項目：國家自然科學(xué)基金青年基金項目（81901149）；湖北省自然科學(xué)基金資助項目（2022CFB356）

作者單位：湖北科技學(xué)院藥學(xué)院（郵編437100）

作者簡介：袁滿（1999），女，碩士在讀，主要從事炎癥相關(guān)痛覺機(jī)制方面研究。E-mail：1402002301@qq.com

△通信作者 E-mail：359048090@qq.com

摘要：目的 基于線粒體關(guān)鍵基因探究大黃素緩解骨關(guān)節(jié)炎模型小鼠痛覺行為的作用機(jī)制。方法 30只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為對照組、骨關(guān)節(jié)炎（OA）組和OA+大黃素組，每組10只。OA組和OA+大黃素組進(jìn)行膝關(guān)節(jié)內(nèi)注入完全弗氏佐劑（20 μL）建立OA模型，OA+大黃素組進(jìn)行大黃素腹腔內(nèi)給藥（10 mg/kg）。行為學(xué)測試后，收集小鼠膝關(guān)節(jié)組織進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色。蛋白免疫印跡分析膝關(guān)節(jié)組織炎性因子白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）以及線粒體相關(guān)蛋白NADH脫氫酶（泛醌）黃素蛋白1（NDUFV1）、細(xì)胞色素C氧化酶亞基5B（COX5B）、細(xì)胞色素C氧化酶15（COX15）、NADH脫氫酶（泛醌）1α亞復(fù)合物亞基10（NDUFA10）的表達(dá)水平。結(jié)果 與對照組相比，OA組小鼠機(jī)械痛閾值降低，轉(zhuǎn)棒停留時間和運動距離下降（P＜0.05）；與OA組相比，OA+大黃素組機(jī)械痛閾值升高，轉(zhuǎn)棒停留時間和運動距離均增加（P＜0.05）。對照組膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨結(jié)構(gòu)完整，OA組軟骨層變薄，軟骨下小梁退化，大黃素處理緩解了軟骨變性。與對照組相比，OA組IL-1β、TNF-α、COX15和NDUFA10表達(dá)升高，NDUFV1和COX5B表達(dá)降低，大黃素處理可恢復(fù)上述蛋白表達(dá)水平（P＜0.05）。結(jié)論 大黃素可通過調(diào)控炎性因子和線粒體相關(guān)蛋白的表達(dá)來緩解OA小鼠痛覺行為。

關(guān)鍵詞：骨關(guān)節(jié)炎；大黃素；線粒體；計算生物學(xué)；炎癥性疼痛

中圖分類號：R965.1，R684.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20240056

Mechanism of emodin modulating pain behavior in mouse model of osteoarthritis

YUAN Man， FENG Zihan， XIE Min， WANG Bojun△

School of Pharmacy， Hubei University of Science and Technology， Xianning 437100， China

△Corresponding Author E-mail： 359048090@qq.com

Abstract： Objective To explore the regulatory mechanism of emodin on pain behavior in a mouse model of osteoarthritis based on mitochondrial key genes. Methods Thirty C57BL/6J mice were randomly divided into the control group， the osteoarthritis （OA） model group and the emodin-treated （OA+emodin） group， 10 mice per each group. The mice in the OA group and the OA+emodin group were intra-articular injection of complete Freund’s adjuvant （20 μL） in knee to establish the OA model， and mice in the OA+emodin group were treated by intraperitoneal emodin （10 mg/kg） injection. After behavioral testing， knee tissue of mice was collected for hematoxylin-eosin staining. Western blot analysis was used to detect expression levels of proinflammatory factors interleukin-1β （IL-1β）， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and mitochondria-related proteins NADH dehydrogenase （ubiquinone） flavoprotein 1 （NDUFV1）， cytochrome C oxidase subunit 5B （COX5B）， cytochrome C oxidase assembly protein COX15 homolog （COX15）， NADH dehydrogenase （ubiquinone） 1 alpha subcomplex subunit 10 （NDUFA10） in knee tissue. Results Compared with the control group， mice in the OA group showed decreased mechanical nociceptive threshold （PWT）， reduced latency and distance in rotarod test （P＜0.05）. Compared with the OA group， mice in the OA+emodin group showed increased PWT， latency， and distance （P＜0.05）. In the control group， the structures of cartilage and subchondral bone were intact， while in the OA group， the cartilage was thinner and the subchondral trabeculae was deteriorated. The treatment with emodin alleviated cartilage degeneration. The expression levels of IL-1β， TNF-α， COX15 and NDUFA10 were increased while expression levels of NDUFV1 and COX5B were decreased in the OA group compared with the control group. The emodin treatment restored the above-mentioned protein expression levels （P＜0.05）. Conclusion Emodin can alleviate pain behavior in OA mice by regulating the expressions of inflammatory factors and mitochondrial related proteins.

Key words： osteoarthritis; emodin; mitochondria; computational biology; inflammatory pain

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是常見的退行性肌肉骨骼疾病，是導(dǎo)致慢性疼痛和行走限制的主要原因，具有較高的發(fā)病率和致殘率，其特點是軟骨退行性變、骨贅形成、軟骨下骨增厚、滑膜炎癥和半月板損傷［1］。2019年全球膝骨關(guān)節(jié)炎患者數(shù)量已達(dá)3億人［2］。膝骨關(guān)節(jié)炎是OA中最常見的類型，患者常伴有關(guān)節(jié)腫脹、疼痛和僵硬，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［3］。線粒體功能障礙是導(dǎo)致OA發(fā)生和發(fā)展的重要因素，主要特點為腺苷三磷酸（ATP）產(chǎn)生減少、氧化應(yīng)激增加、鈣失調(diào)以及線粒體膜通透性增加［4］。在OA的軟骨和滑膜組織中均發(fā)現(xiàn)線粒體形態(tài)異常和功能損傷［5］。抑制線粒體相關(guān)的氧化應(yīng)激和線粒體分裂導(dǎo)致的軟骨細(xì)胞凋亡可治療OA［6-7］。因此，改善線粒體功能可作為OA的潛在治療策略。本研究運用生物信息學(xué)方法分析OA和線粒體數(shù)據(jù)，構(gòu)建OA小鼠模型，驗證篩選的關(guān)鍵基因表達(dá)水平，以期從調(diào)控線粒體功能的角度為治療OA提供有效數(shù)據(jù)及思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集及分析 通過高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus，GEO；https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載數(shù)據(jù)集GSE206848，該數(shù)據(jù)集包含7例健康對照和7例OA患者的滑膜樣本的數(shù)據(jù)。利用MitoCarta3.0數(shù)據(jù)庫收集人類線粒體相關(guān)基因，使用韋恩圖分析OA差異性表達(dá)基因與線粒體數(shù)據(jù)集之間的重疊基因，然后運用基因間功能關(guān)聯(lián)關(guān)系數(shù)據(jù)庫（search tool for recurring instances of neighbouring genes，STRING）進(jìn)行蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，最后運用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析和可視化開源平臺Cytoscape可視化并篩選核心基因。

1.2 實驗試劑及儀器 大黃素（分析標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司。蛋白酶抑制劑、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠快速配制試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒、完全弗氏佐劑、蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。本實驗所用一抗為：兔抗鼠白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、細(xì)胞色素C氧化酶亞基5B（cytochrome c oxidase subunit 5B，COX5B）、細(xì)胞色素C氧化酶組裝同系物COX15（cytochrome c oxidase assembly protein COX15 homolog，COX15）、NADH脫氫酶（泛醌）黃素蛋白1［NADH dehydrogenase （ubiquinone） flavoprotein 1，NDUFV1］購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；兔抗鼠NADH脫氫酶（泛醌）1α亞復(fù)合物亞基10［NADH dehydrogenase （ubiquinone） 1 alpha subcomplex subunit 10，NDUFA10］、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）購自江蘇親科生物有限公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。von Frey纖維（Stoelting，美國），轉(zhuǎn)棒疲勞儀（北京眾實迪創(chuàng)，中國），熒光顯微鏡（Olympus，日本），冷凍臺式微型離心機(jī)（Eppendorf，德國），電泳槽、轉(zhuǎn)印槽（Bio-Rad，美國），顯影儀（Invitrogen，美國）。

1.3 實驗動物及分組 C57BL/6J小鼠30只（SPF級，雄性，6～8周，體質(zhì)量18～20 g）購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（遼）2020-0001，動物使用許可證號SYXK（鄂）2023-0071。實驗動物飼養(yǎng)在室溫（22±2）℃，12 h/12 h晝夜節(jié)律交替的環(huán)境中自由飲水進(jìn)食。采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為對照組、OA組和OA+大黃素組，每組10只。本研究動物實驗經(jīng)湖北科技學(xué)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：2021-05-981）。

1.4 模型構(gòu)建及藥物處理 小鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉及乙醇消毒后，OA組和OA+大黃素組使用無菌微量注射器向左膝關(guān)節(jié)內(nèi)緩慢注入完全弗氏佐劑（20 μL）從而構(gòu)建OA模型；對照組小鼠注射等體積生理鹽水。14 d后，OA+大黃素組小鼠進(jìn)行大黃素腹腔內(nèi)給藥（10 mg/kg）［8-9］，對照組和OA組小鼠注射等體積生理鹽水。本實驗操作流程見圖1。lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image1.tiffgt;[對照組][OA組][OA+大黃素組][完全弗氏佐劑][生理鹽水][完全弗氏佐劑][生理鹽水][生理鹽水][大黃素][機(jī)械痛][轉(zhuǎn)棒運動][骨HE染色][免疫印跡][Fig.1 Schematic diagram of experimental procedures of emodin regulating pain behavior in a mouse model of osteoarthritis

圖1 大黃素調(diào)節(jié)OA模型小鼠痛覺行為的實驗流程圖]

1.5 行為學(xué)檢測 動物給藥后，各組小鼠測定痛覺行為學(xué)和運動能力。小鼠機(jī)械縮足閾值（PWT）用于表征機(jī)械痛。待動物適應(yīng)環(huán)境30 min后，用von Frey纖維垂直刺激小鼠左后肢足底正中，持續(xù)時間≤5 s。若動物出現(xiàn)快速舔足或抬足等行為記為陽性，反之為陰性；記錄6次數(shù)據(jù)后結(jié)束檢測。根據(jù)公式50%PWT（g）=（10［Xf+Kδ］）/10 000計算各組小鼠的縮足閾值（Xf為本次行為學(xué)測試中使用的最后一個von Frey纖維的階數(shù)，K為痛覺閾矯正系數(shù)，δ為相鄰不同纖維刺激之間的差異）。

轉(zhuǎn)棒實驗用于表征小鼠運動平衡能力，記錄指標(biāo)為運動距離和潛伏期（即在轉(zhuǎn)棒上停留的時間）。待小鼠適應(yīng)30 min后，將小鼠放置于10 r/min的恒定速度旋轉(zhuǎn)桿上，運動10 s并將速度增加到20 r/min，運動持續(xù)進(jìn)行10 min。重復(fù)3次，每次間隔10 min。記錄其運動距離和轉(zhuǎn)棒停留時間。

1.6 組織學(xué)檢測 行為學(xué)檢測結(jié)束后，每組取3只小鼠麻醉，用4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌流固定，分離左膝關(guān)節(jié)，經(jīng)10%乙二胺四乙酸溶液脫鈣10 d，乙醇脫水，石蠟包埋，制備骨切片，厚度為4 μm，然后進(jìn)行HE染色。步驟如下：石蠟切片依次放入二甲苯（5 min，2次）、100%乙醇（10 min，2次）、90%乙醇（10 min）、70%乙醇（10 min）中脫蠟，自來水沖洗2 min。然后將切片用蘇木素溶液染色3 min，自來水沖洗10 s。切片用伊紅染色3 min，自來水沖洗10 s。再將切片放入80%乙醇（5 min）、90%乙醇（5 min）、95%乙醇（5 min）、100%乙醇（5 min，2次）、 二甲苯（5 min，2次）中脫水透明處理。最后用中性樹膠封片。顯微鏡下觀察骨組織結(jié)構(gòu)形態(tài)。

1.7 Western blot檢測線粒體相關(guān)蛋白和促炎細(xì)胞因子表達(dá) 行為學(xué)測試結(jié)束后，每組取3只小鼠麻醉。取膝關(guān)節(jié)組織，用含蛋白酶抑制劑的裂解液裂解，4 ℃、12 000×g離心20 min。收集上清液，使用BCA蛋白濃度試劑盒對蛋白濃度進(jìn)行定量分析。收集的蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，在4 ℃條件下一抗（1∶1 000）孵育過夜；洗膜3次，每次10 min。二抗（1∶10 000）在室溫下孵育1 h；洗膜3次，每次10 min。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（[x] ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠行為學(xué)比較 與對照組相比，OA組小鼠機(jī)械痛閾值降低，轉(zhuǎn)棒停留時間和運動距離下降（P＜0.05）。與OA組相比，OA+大黃素組小鼠機(jī)械痛閾值升高，轉(zhuǎn)棒停留時間和運動距離均增加（P＜0.05），見表1。[組別 機(jī)械痛閾值/g 轉(zhuǎn)棒停留時間/s 運動距離/m 對照組 1.48±0.25 543.92±46.50 23.89±2.17 OA組 0.21±0.13a 215.18±50.45a 8.42±2.16a OA+大黃素組 0.78±0.20b 353.49±23.94b 14.98±1.14b F 100.531＊＊ 154.783＊＊ 169.678＊＊ ][Tab.1 Comparison of behavioral tests between different groups of mice

表1 各組小鼠行為學(xué)測試結(jié)果比較" ][（n=10，[x] ±s）

][＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與OA組比較，P＜0.05。]

2.2 大黃素對小鼠膝關(guān)節(jié)形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 HE染色顯示，對照組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨結(jié)構(gòu)完整，軟骨表面光滑，厚度均勻。與對照組相比，OA組關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)退化，軟骨層變薄，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，軟骨下小梁退化，骨贅形成。大黃素處理緩解了OA小鼠關(guān)節(jié)軟骨的變性和侵蝕，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下小梁結(jié)構(gòu)的部分恢復(fù)，見圖2。lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image6_1.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image5_1.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image4.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image3_1.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image2.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image1.jpeggt;[對照組][OA組][OA+大

黃素組][ A：關(guān)節(jié)間隙；B：關(guān)節(jié)軟骨；C軟骨下骨；D：骨贅形成；▲：軟骨下小梁；左側(cè)標(biāo)尺=100 μm，右側(cè)標(biāo)尺=50 μm。

Fig.2 HE staining of mouse knee cartilage tissue in each group

圖2 各組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織HE染色]

2.3 OA差異性表達(dá)基因與線粒體相關(guān)性分析 OA數(shù)據(jù)集GSE206848差異性表達(dá)基因分析見圖3A。韋恩圖顯示，與線粒體相關(guān)的重疊基因共141個（圖3B）。將重疊基因相互作用在線分析并可視化，篩選出核心基因（圖3C）。后續(xù)選取OA患者中表達(dá)下調(diào)的NDUFV1、COX5B蛋白和表達(dá)上調(diào)的COX15、NDUFA10蛋白進(jìn)行蛋白表達(dá)水平分析驗證。lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image1_1.tiffgt;[-4][-2][0][2][0][2][4][6][8][下調(diào)

上調(diào)][log2（fold change）][-log10（P）]lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image2_1.tiffgt;[OA][線粒體]lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image3.tiffgt;[A][GSE206848：對照vs. OA][ A：OA數(shù)據(jù)差異性表達(dá)基因火山圖；B：OA差異性表達(dá)基因和線粒體相關(guān)重疊基因韋恩圖；C：重疊差異性基因相互作用網(wǎng)絡(luò)。

Fig.3 Correlation analysis of OA differentially expressed

genes and mitochondria

圖3 OA差異性表達(dá)基因和線粒體相關(guān)分析][C][B]

2.4 大黃素對線粒體相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，OA組小鼠NDUFV1和COX5B表達(dá)水平降低，COX15和NDUFA10表達(dá)水平升高（P＜0.05）；大黃素處理后NDUFV1和COX5B表達(dá)水平升高，COX15和NDUFA10表達(dá)水平降低（P＜0.05），見圖4、表2。[NDUFV1 lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image12.jpeggt; 51 ku COX5B lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image13.jpeggt; 13 ku COX15 lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image14_1.jpeggt; 60 ku NDUFA10 lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image15_2.jpeggt; 41 ku β-actin lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image16_1.jpeggt; 43 ku " " " " "A" " " " " " " "B" " " " " " " " C ][A：對照組；B：OA組；C：OA+大黃素組。

Fig.4 Protein expression of mitochondria-associated proteins in each group detected by Western blot assay

圖4 Western blot檢測各組線粒體相關(guān)蛋白表達(dá)水平][組別 NDUFV1 COX5B COX15 NDUFA10 對照組 1.00±0.04 1.00±0.04 1.00±0.09 1.00±0.03 OA組 0.53±0.03a 0.55±0.05a 1.77±0.08a 2.40±0.09a OA+大黃素組 0.67±0.03b 1.12±0.03b 1.31±0.05b 0.55±0.03b F 148.151＊＊ 133.223＊＊ 82.022＊＊ 767.383＊＊ ][Tab.2 Comparison of mitochondria-associated proteins NDUFV1， COX5B， COX15 and NDUFA10

expression between different groups of mice

表2 各組小鼠線粒體相關(guān)蛋白NDUFV1、COX5B、

COX15和NDUFA10表達(dá)水平比較" " " "][（n=3，[x] ±s）

][＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與OA組比較，P＜0.05。]

2.5 大黃素對炎性因子表達(dá)的影響 與對照組相比，OA組小鼠IL-1β和TNF-α水平升高；與OA組相比，OA+大黃素組小鼠IL-1β和TNF-α水平降低（P＜0.05），見圖5、表3。[IL-1β lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image17_1.jpeggt; 17 ku TNF-α lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image18_1.jpeggt; 17 ku β-actin lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image19_1.jpeggt; 43 ku " " " " A" " " " " " "B" " " " " " " C ][A：對照組；B：OA組；C：OA+大黃素組。

Fig.5 Protein expressions of IL-1β and TNF-α in knee joint tissue of each group detected by Western blot assay

圖5 Western blot檢測各組膝關(guān)節(jié)組織IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)][組別 n IL-1β TNF-α 對照組 3 1.00±0.17 1.00±0.04 OA組 3 2.19±0.16a 1.52±0.04a OA+大黃素組 3 1.14±0.16b 1.15±0.05b F 47.405＊＊ 104.231＊＊ ][Tab.3 Comparison of IL-1β and TNF-α protein expression between different groups of mice

表3 各組小鼠膝關(guān)節(jié)組織IL-1β和TNF-α蛋白

表達(dá)水平比較][（[x] ±s）

][ ＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與OA組比較，P＜0.05。]

3 討論

OA是一個由炎癥和代謝因素導(dǎo)致的復(fù)雜的病理過程［10］。效應(yīng)分子（如細(xì)胞因子和酶）以及細(xì)胞外基質(zhì)成分（如膠原蛋白和蛋白多糖的前體或降解產(chǎn)物）都具有作為生化標(biāo)志物的潛力。撲熱息痛和非甾體抗炎藥物在OA癥狀控制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［11］。一般來說，口服和外用非甾體抗炎藥，包括環(huán)氧化酶-2抑制劑，因其改善疼痛和功能的作用而被強烈推薦作為OA的一線治療用藥，但會增加患者某些合并癥的風(fēng)險（例如心血管風(fēng)險）。通常建議關(guān)節(jié)內(nèi)注射皮質(zhì)類固醇用于OA治療，且不良反應(yīng)相對較?。?2］?？诜妥⑸渌幬镏委熯m用于OA患者，藥物干預(yù)之前應(yīng)考慮年齡、同時用藥以及合并癥（特別是心血管和胃腸道問題）。目前，藥物治療大多是緩解癥狀，但是尚無改善OA病情的藥物（即除了減緩或阻止疾病進(jìn)展之外，還可以減輕癥狀的治療方法）［13］。因此，需要開發(fā)更有效的治療OA的藥物。大黃素是從大黃中提取的一種化合物，是一種天然蒽醌衍生物，因其具有強大的抗炎作用而被廣泛使用［14］。

線粒體穩(wěn)態(tài)失衡會導(dǎo)致OA的發(fā)生和進(jìn)展，包括氧化應(yīng)激、軟骨基質(zhì)代謝紊亂、炎癥反應(yīng)和軟骨細(xì)胞死亡等。在OA患者中，線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅱ和Ⅲ的活性分別降低35%和13%，從而導(dǎo)致軟骨合成阻斷、軟骨細(xì)胞凋亡、軟骨基質(zhì)鈣化和炎癥反應(yīng)［15］。生物信息學(xué)分析也顯示，線粒體相關(guān)蛋白的改變與OA的病理變化密切相關(guān)。本研究選取其中4種線粒體相關(guān)蛋白進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)NDUFV1和COX5B表達(dá)降低，COX15和NDUFA10表達(dá)升高，該結(jié)果與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致。蛋白線粒體復(fù)合物Ⅰ是線粒體中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的重要來源，可引起細(xì)胞氧化應(yīng)激。線粒體復(fù)合物Ⅰ分為3個模塊：電子輸入模塊、電子輸出模塊和質(zhì)子轉(zhuǎn)移模塊，組成電子輸入模塊的亞單位由基因NDUFV1、NDUFV2和NDUFS1編碼。NDUFV1可氧化還原型輔酶Ⅰ是ROS產(chǎn)生的主要位點［16］。NDUFV1基因突變與多種疾病表型相關(guān)［17］。細(xì)胞色素C氧化酶（cytochrome c oxidase，COX）是線粒體呼吸鏈的末端酶，可催化電子從還原的細(xì)胞色素C轉(zhuǎn)移到分子氧［18］。COX5B是COX的一種外周核編碼亞基，催化線粒體電子傳遞鏈的最后一步，COX5B的缺失導(dǎo)致COX活性降低和無法形成功能性復(fù)合物，并伴隨膜電位降低和ROS形成增加，表明COX5B對于功能型COX復(fù)合物的組裝和穩(wěn)定至關(guān)重要［19］。COX15蛋白產(chǎn)物定位于線粒體內(nèi)膜，COX15在線粒體血紅素生物合成途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［20］。NDUFA10屬于復(fù)合物Ⅰ的輔助亞基，位于線粒體內(nèi)膜［21］。微陣列分析和蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果表明，NDUFA10蛋白或mRNA表達(dá)改變與多種疾病相關(guān)，包括心肌肥大和Ⅱ型糖尿病等［22］。NDUFA10基因突變患者表現(xiàn)出復(fù)合物Ⅰ活性顯著降低，并且組裝或穩(wěn)定性受到干擾［23］。大黃素可減少線粒體功能障礙介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，抑制線粒體ROS的過量產(chǎn)生，加速ATP的回收［24］。此外，線粒體質(zhì)量控制紊亂是軟骨細(xì)胞衰老和凋亡的主要因素［25］。大黃素可阻止線粒體分裂，恢復(fù)線粒體動力學(xué)平衡［24］。本研究表明，大黃素處理后NDUFV1和COX5B表達(dá)水平上調(diào)，COX15和NDUFA10的表達(dá)水平下調(diào)，提示大黃素可通過靶向線粒體基因來保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，緩解OA疼痛。

軟骨細(xì)胞是成熟軟骨中唯一存在的細(xì)胞類型，因此OA的疾病過程是以這些細(xì)胞的變化為主要特征的。OA軟骨細(xì)胞可以產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)降解蛋白（如基質(zhì)金屬蛋白酶）和以IL-1β和TNF-α為主的促炎細(xì)胞因子。OA軟骨細(xì)胞還能產(chǎn)生前列腺素、一氧化氮和其他ROS［26］。本研究也顯示，OA小鼠膝關(guān)節(jié)組織中IL-1β和TNF-α的表達(dá)上調(diào)。在OA的病理過程中，線粒體電子轉(zhuǎn)移不完全會導(dǎo)致過量的ROS和活性氮產(chǎn)生，隨后損害線粒體DNA和線粒體膜蛋白［27］。線粒體功能障礙而釋放的線粒體成分和產(chǎn)物，如線粒體DNA可導(dǎo)致細(xì)胞因子的合成，如干擾素-β1、IL-6和TNF-α。此外，當(dāng)功能失調(diào)的線粒體釋放時，線粒體DNA和ROS都可以作為炎癥小體信號的結(jié)果，驅(qū)動IL-1β和IL-18的分泌［28］。大黃素可通過抑制促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6和IL-8）、介質(zhì)（前列腺素E2、基質(zhì)金屬蛋白酶）和血管內(nèi)皮生長因子來抑制炎癥［29］。大黃素能夠抑制軟骨細(xì)胞的損傷，減緩關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的降解［30］。本研究顯示，大黃素處理后炎性因子的表達(dá)水平下調(diào)，表明大黃素可通過緩解OA炎癥減少關(guān)節(jié)軟骨的損傷。結(jié)合大黃素處理后OA動物的痛覺敏感性下降，可改善動物的痛覺行為和運動能力，表明大黃素可保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，延緩OA的發(fā)展，從而緩解疼痛。

綜上所述，OA軟骨細(xì)胞中的線粒體功能障礙可導(dǎo)致炎性因子的表達(dá)增加，從而引起炎癥反應(yīng)，大黃素治療可靶向線粒體基因，降低炎性因子的表達(dá)，延緩OA進(jìn)展，緩解軟骨組織基質(zhì)降解，從而緩解疼痛。但是大黃素對骨關(guān)節(jié)的作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究，在后續(xù)研究中將線粒體基因作為核心進(jìn)行藥理學(xué)方面的調(diào)控，從而闡明其在OA中的機(jī)制。

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（2024-01-08收稿 2024-02-08修回）

（本文編輯 胡小寧）