景祎馨 張貽幗 潘 銳 丁 可 孟慶濤

腸缺血再灌注 (intestinal ischemia reperfusion, IIR) 損傷是臨床常見的一種損傷,可發(fā)生在多種病理生理條件下,例如急性腸系膜缺血、嚴(yán)重創(chuàng)傷、急性休克、小腸移植和敗血癥。在缺血期間,組織缺氧導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能受損和血管通透性增加,隨后在再灌注期間血流和氧氣的恢復(fù)導(dǎo)致細(xì)菌易位、組織損傷、炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激。除腸道局部損傷外,IIR還可引起腸道菌群移位、內(nèi)毒素血癥及遠(yuǎn)端器官損害,最終導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征、多器官功能障礙綜合征甚至死亡[1]。

IIR損傷的病理進(jìn)程中,線粒體已經(jīng)成為關(guān)鍵的參與者和調(diào)節(jié)者。線粒體作為大多數(shù)真核細(xì)胞內(nèi)必不可少的細(xì)胞器,主要通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP供應(yīng)能量。線粒體擁有獨立于細(xì)胞核的遺傳物質(zhì)——線粒體DNA (mitochondrial DNA, mtDNA),人類的mtDNA由高度保守的輕鏈及重鏈組成環(huán)狀結(jié)構(gòu),共編碼了氧化磷酸化相關(guān)的13種mRNA、2種rRNA以及22種tRNA[2]。內(nèi)共生學(xué)說認(rèn)為線粒體來源于真核生物吞噬的細(xì)菌,因此mtDNA與細(xì)菌基因具有結(jié)構(gòu)的相似性,釋放到細(xì)胞質(zhì)或循環(huán)中的mtDNA可作為“外來”分子被先天免疫系統(tǒng)中不同模式識別受體識別,從而觸發(fā)Ⅰ型干擾素(interferon,IFN)及促炎反應(yīng)[3]。本文討論了mtDNA釋放到胞質(zhì)或循環(huán)中的可能機(jī)制,重點關(guān)注了mtDNA觸發(fā)的免疫反應(yīng)在IIR損傷的作用,主要涉及Toll樣受體9(Toll-like receptor 9,TLR9)、環(huán)狀GMP-AMP合成酶(cyclic GMP-AMP,cGAS)和NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)信號通路。

一、mtDNA的跨膜釋放機(jī)制

1. mtDNA胞質(zhì)釋放機(jī)制:在生理情況下,mtDNA主要存在于線粒體基質(zhì)內(nèi),缺氧、敗血癥、外傷或線粒體膜電位劇烈變化等刺激可造成mtDNA穿越線粒體膜而轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中,這個過程與線粒體膜的結(jié)構(gòu)與功能密不可分[3]。目前已有研究顯示多種線粒體膜孔道參與了mtDNA的胞質(zhì)易位。

(1)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔:線粒體通透性轉(zhuǎn)換最初由Haworth和Hunter提出,他們發(fā)現(xiàn)高水平的鈣會引起線粒體內(nèi)膜通透性的增加[4]。隨著進(jìn)一步研究證實,這一現(xiàn)象由一種組裝在線粒體膜上的分子實體支持——線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP),該孔道直徑為2～3nm,可允許水及小于1.5kDa的溶質(zhì)通過[5,6]。

mPTP開放除了允許代謝物流出外,也可介導(dǎo)mtDNA的釋放。線粒體在受到Fe2+、H2O2和鈣離子誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激刺激下,mtDNA的部分片段會通過mPTP離開線粒體[7]。同樣在小鼠腦線粒體中發(fā)現(xiàn),輻射誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激會引起mtDNA氧化損傷及片段化,而且還會使mPTP自發(fā)打開和關(guān)閉的頻率增加,促進(jìn)mtDNA片段易位到細(xì)胞質(zhì)[8]。mPTP介導(dǎo)的mtDNA的胞質(zhì)釋放在多種炎性疾病中得到廣泛研究。在肌萎縮性側(cè)索硬化癥模型中,一種核DNA/RNA結(jié)合蛋白TDP-43可錯位進(jìn)入線粒體,打開mPTP導(dǎo)致mtDNA泄漏到細(xì)胞質(zhì)中,從而進(jìn)一步驅(qū)動cGAS介導(dǎo)的免疫信號[9]。

(2)BAK/BAX孔:Bcl-2蛋白家族是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子,目前已發(fā)現(xiàn)18種同源蛋白,其中BAX與BAK是關(guān)鍵的促凋亡蛋白[10]。在生理情況下,BAX和BAK主要以無活性的單體形式存在,但在細(xì)胞凋亡進(jìn)程中,BAX/BAK會發(fā)生積聚并插入線粒體外膜,經(jīng)歷構(gòu)象重排與低聚等過程形成孔道,釋放細(xì)胞色素c等促凋亡因子以激活半胱天冬酶級聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致細(xì)胞收縮、染色質(zhì)縮合和凋亡體形成[11]。

線粒體外膜形成的BAX/BAK孔隙不僅僅參與細(xì)胞凋亡的激活,近年來研究顯示,BAX/BAK孔介導(dǎo)的mtDNA釋放可激活先天免疫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。使用晶格光片活細(xì)胞顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞線粒體發(fā)現(xiàn),線粒體外膜出現(xiàn)的BAK/BAX孔可允許攜帶mtDNA的線粒體內(nèi)膜膨出,隨后線粒體內(nèi)膜發(fā)生透化釋放mtDNA進(jìn)入胞質(zhì)[12]。在膜孔道的組裝過程中,BAX與BAK會形成單獨的線、弧和環(huán)狀結(jié)構(gòu),這些弧和環(huán)狀結(jié)構(gòu)與膜孔的形成密切相關(guān)。此外BAX與BAK之間可進(jìn)行相互調(diào)節(jié),促進(jìn)彼此組裝,兩者的組裝速率是mtDNA釋放動力學(xué)的主要決定因素[13]。

(3)電壓依賴性陰離子通道:電壓依賴性陰離子通道(voltage dependent anion channel,VDAC)是線粒體外膜上嵌入的β-桶狀蛋白,控制著線粒體代謝物質(zhì)的進(jìn)出。VDAC可以在氧化應(yīng)激條件下發(fā)生低聚,并且VDAC的低聚體可以形成大的線粒體外膜透化孔。在活細(xì)胞中,VDAC1或VDAC3的低聚都有助于線粒體外膜透化并促進(jìn)mtDNA的釋放,此外,高效的VDAC1低聚化抑制劑VBIT-4抑制了mtDNA的流出。VDAC1的N端結(jié)構(gòu)域包含3個帶正電荷的殘基可以與mtDNA的負(fù)電荷骨架相互作用,同時mtDNA可能會進(jìn)一步促進(jìn)VDAC1寡聚化,兩者之間的相互作用可進(jìn)一步促進(jìn)VDAC低聚并增加mtDNA釋放[14]。

2.mtDNA細(xì)胞外空間釋放機(jī)制:mtDNA可以釋放到細(xì)胞外,在血漿和血清、腦脊液或滑液等多種體液中都觀察到了循環(huán)mtDNA的存在,循環(huán)中存在的mtDNA水平與炎癥性疾病、癌癥、衰老、創(chuàng)傷或組織損傷密切相關(guān)[15]。

(1)細(xì)胞外陷阱:以中性粒細(xì)胞外陷阱(neutrophil extracellular trap,NET)為例,NET是中性粒細(xì)胞激活后釋放到胞外的網(wǎng)狀超微結(jié)構(gòu),主要由DNA骨架及附著的顆粒蛋白及肽類組成,NET可以直接捕獲致病微生物,是抵御微生物入侵機(jī)體的一道防線[16,17]。盡管NET中的大部分DNA來自細(xì)胞核,但這些結(jié)構(gòu)中也包含mtDNA[18]。有研究顯示,激活后的中性粒細(xì)胞會以ROS依賴性方式釋放僅含有mtDNA的NET[19]。與NET類似,巨噬細(xì)胞可以產(chǎn)生由mtDNA組成的巨噬細(xì)胞外陷阱,從而抵御微生物入侵及擴(kuò)散[20]。同樣在嗜酸性粒細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)含有mtDNA的細(xì)胞外陷阱形成[21,22]。

(2)細(xì)胞外囊泡:細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)是一種細(xì)胞膜衍生結(jié)構(gòu),通常分為外泌體、微泡和凋亡小體3個亞型[23,24]。EV可以攜帶特定的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或基因片段,在細(xì)胞間成分交換與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮著重要作用[25]。在慢加急性酒精性肝損傷中,循環(huán)中含有mtDNA的EV的水平增加,并且與中性粒細(xì)胞增多癥和肝毒性密切相關(guān)。在慢性心力衰竭患者,血漿來源的攜帶mtDNA的外泌體增加可通過TLR9途徑引發(fā)炎性反應(yīng),并且這種炎癥的作用程度與外泌體mtDNA拷貝數(shù)密切相關(guān)[26]。同樣,在抗磷脂抗體刺激后,含mtDNA的EV水平會增加可通過TLR9受體引起內(nèi)皮細(xì)胞的活化,從而增加先兆子癇的風(fēng)險[27]。

二、IIR損傷中mtDNA介導(dǎo)的先天免疫信號通路

線粒體是缺血再灌注病理進(jìn)程的重要參與者和調(diào)節(jié)者,線粒體功能障礙會通過氧化應(yīng)激,炎癥和凋亡加劇IIR損傷。在IIR期間,受損的線粒體所釋放mtDNA是內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式的重要來源,可激活TLR9,cGAS和NLRP3等先天免疫的傳感器以增強(qiáng)促炎和Ⅰ型干擾素反應(yīng)[28]。

1.TLR9:TLR9 是第一個發(fā)現(xiàn)對胞質(zhì)DNA有反應(yīng)的特異性受體,TLR9位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,可以識別DNA的低甲基CpG序列,mtDNA的低聚化CpG序列是TLR9的有效激活劑[29]。與DNA結(jié)合后,TLR9會通過銜接蛋白MyD88發(fā)出信號,在核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)的存在下激活促炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄,此外還可通過干擾素調(diào)節(jié)因子7的磷酸化導(dǎo)致Ⅰ型干擾素基因的激活[30]。

TLR9已被證明在肝臟IR期間的加劇先天免疫反應(yīng),而TLR9的抑制可扭轉(zhuǎn)肝臟損傷[31]。有研究發(fā)現(xiàn),在肝細(xì)胞受到凋亡刺激時,Bak/Bax孔介導(dǎo)的mtDNA釋放會誘導(dǎo)TLR9依賴性IFN-β產(chǎn)生。此外,在急性肺損傷中mtDNA可以通過激活TLR9/NF-κB通路介導(dǎo)隨后的炎性反應(yīng)[32]。在腸組織中,創(chuàng)傷導(dǎo)致的細(xì)胞破壞可以釋放mtDNA至循環(huán)中,通過激活中性粒細(xì)胞TLR9受體介導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子的釋放加劇腸道功能障礙[33,34]。但矛盾的是,Slone等[35]通過對TLR9基因敲除小鼠進(jìn)行IIR后,檢查腸組織損傷及炎性相關(guān)指標(biāo)后發(fā)現(xiàn)TLR9在IIR誘導(dǎo)的組織損傷及炎癥中似乎是可有可無的。因此,mtDNA觸發(fā)TLR9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的炎性反應(yīng)可能有組織器官差異性,仍需要進(jìn)一步研究。

2.cGAS:大量研究已經(jīng)證實,cGAS信號軸可響應(yīng)外源或內(nèi)源DNA刺激而調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。在沒有DNA刺激的情況下,cGAS會以自抑制狀態(tài)存在。當(dāng)cGAS檢測到DNA后可利用GTP和ATP作為底物,催化第二信使cGAMP的合成,隨后cGAMP與位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)結(jié)合并誘導(dǎo)構(gòu)象變化,活化的STING與TANK結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)結(jié)合,進(jìn)而磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3),隨后IRF3二聚化并易位到細(xì)胞核。此外STING還可招募并激活I(lǐng)κB激酶,從而誘導(dǎo)NF-κB易位到細(xì)胞核,進(jìn)入細(xì)胞核的NF-κB與IRF3可以與其他轉(zhuǎn)錄因子一起發(fā)揮作用,誘導(dǎo)干擾素和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。

盡管激活cGAS的大多數(shù)內(nèi)源性DNA都認(rèn)為來源于核基因,但目前有多項研究證實,mtDNA也可用作為cGAS配體。Guo等[36]研究顯示,向玻璃體內(nèi)注射mtDNA可導(dǎo)致細(xì)胞損傷和視網(wǎng)膜功能障礙,這一機(jī)制主要與mtDNA激活cGAS-STING通路誘導(dǎo)炎性反應(yīng)密切相關(guān)。此外,在牙本質(zhì)細(xì)胞炎癥及腎損傷等疾病中也觀察到mtDNA-cGAS-STING通路激活。在有關(guān)IIR的研究中,cGAS-STING信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與了mtDNA誘導(dǎo)的壞死性凋亡,mtDNA可通過誘導(dǎo)壞死性凋亡進(jìn)一步促進(jìn)IIR損傷,而STING敲除可改善mtDNA誘導(dǎo)的腸道損傷。此外,mtDNA-cGAS-STING的激活可通過誘導(dǎo)過量脂質(zhì)過氧化而加重腸道損傷,在該研究中,mtDNA可以以劑量和時間依賴性的方式誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞死亡,這一過程可通過STING的敲除而逆轉(zhuǎn)。

針對mtDNA-cGAS-STING信號軸的靶向治療可顯著減輕IIR損傷。使用線粒體靶向抗氧化劑減輕DNA損傷或DNase-1降解細(xì)胞外DNA可以有效改善IIR損傷。STING作為通路關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白,STING的敲除可有效改善IIR中mtDNA引起的損傷,此外,STING的抑制劑已經(jīng)在小鼠腎缺血再灌注保護(hù)中得到廣泛應(yīng)用,因此STING在IIR預(yù)防及治療的作用值得進(jìn)一步探究。

3. NLRP3:NLRP3是一種NLR家族的關(guān)鍵受體蛋白,NLRP3的激活可吸引ASC和caspase-1組裝成炎性小體,從而誘導(dǎo)caspase-1自切割和活化?；罨腸aspase-1一方面促進(jìn)IL-1β和IL -18等炎性細(xì)胞因子的成熟和分泌,另一方面還可切割GSDMD引發(fā)焦亡,最終導(dǎo)致缺血再灌注的損傷。NLRP3激動劑不僅包括病原體相關(guān)的RNA、DNA、成孔毒素和肽聚糖,mtDNA也是NLRP3的有效激動劑。

既往研究提出,氧化的mtDNA易位到胞質(zhì)后可直接導(dǎo)致NLRP3炎性小體激活,增加IL-1β的分泌。Xian等[37]進(jìn)一步驗證了在線粒體中,氧化的mtDNA要么被DNA糖基化酶OGG1修復(fù),要么被內(nèi)切酶FEN1切割成500～650bp片段,這些片段通過mPTP和VDAC依賴性通道離開線粒體以啟動胞質(zhì)NLRP3炎性小體活化,并導(dǎo)致了促炎性細(xì)胞因子的釋放。盡管目前缺乏IIR損傷中mtDNA激活NLRP3炎性小體的直接證據(jù),但已有多項研究證實NLRP3炎性小體在IIR期間的損傷作用。一方面,NLRP3可以以GSDMD依賴性方式誘導(dǎo)焦亡加劇IIR損傷,另一方面,NLRP3活化所介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子生成也促進(jìn)了IIR損傷。

mtDNA-NLRP3通路激活是IIR損傷的可能機(jī)制之一。研究顯示,VX-765作為一種選擇性caspase-1抑制劑,可有效抑制NLRP3炎性小體活化,VX-765預(yù)處理可以有效減輕IIR期間的氧化損傷及炎性反應(yīng)。此外,靶向mtDNA氧化損傷及釋放也可有效推進(jìn)IIR損傷治療進(jìn)展。特異性內(nèi)切核酸酶1可將氧化的mtDNA切割成小分子片段,其抑制劑FEN1-IN-4可減少mtDNA碎片化,mPTP抑制劑CsA與VADC孔抑制劑VBIT-4可有效減少mtDNA向胞質(zhì)釋放,而上述抑制劑在小鼠模型中均有效抑制了下游NLRP3炎性小體活化及炎性細(xì)胞因子釋放,減弱了組織損傷,但未來仍需要進(jìn)一步的實驗驗證其臨床可行性。

四、展 望

IIR常見于急性腸系膜缺血、創(chuàng)傷、感染性休克、燒傷以及外科操作等,線粒體與腸缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)線粒體的生理功能不單單局限于能量的生成,在外界或自身刺激下,線粒體自身基因組mtDNA可作為一種損傷相關(guān)分子模式激活TLR9、cGAS及NLRP3信號通路,誘導(dǎo)干擾素及炎性細(xì)胞因子的釋放從而進(jìn)一步加重IIR。在這個過程中,mtDNA必須跨越線粒體內(nèi)外膜才能到達(dá)線粒體外,其可能的機(jī)制主要包括了以mPTP、BAK/BAX 孔和VDAC孔為主的胞質(zhì)釋放途徑,以細(xì)胞外陷阱及EV為主的胞外釋放途徑,但目前有關(guān)mtDNA釋放通路的具體機(jī)制尚未完全闡明。此外,釋放后的mtDNA如何特異性篩選并結(jié)合模式識別受體也有待于進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。