郝丕達(dá) 蘇冉 謝浩博 李玉花 王維清 趙曉娟 范存東

在全球范圍內(nèi), 癌癥的負(fù)擔(dān)日益加重, 已成為威脅人類健康的主要疾病之一。根據(jù)2010 年世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù), 癌癥的死亡率已超過(guò)心臟病, 成為全球死亡的首要原因, 其中每8 個(gè)死者中就有1 人死于惡性腫瘤［1］。腦膠質(zhì)瘤作為最常見的惡性腦腫瘤, 其治療仍然是當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的一個(gè)重大挑戰(zhàn)。近年來(lái), 靶向藥物治療已經(jīng)迅速發(fā)展, 成為腫瘤治療領(lǐng)域的主要研究方向和藥物類別, 其在全球腫瘤藥物市場(chǎng)的份額已經(jīng)達(dá)到了40%［1］。這一發(fā)展趨勢(shì)的背后是分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的快速進(jìn)展, 提供了大量的潛在藥物靶點(diǎn),如細(xì)胞生長(zhǎng)因子、蛋白激酶和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子等［2］。同時(shí), 化學(xué)合成技術(shù)、晶體衍射技術(shù)、分子模擬、高通量篩選技術(shù)和計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)等先進(jìn)技術(shù)的運(yùn)用, 也為靶向藥物的開發(fā)提供了有力支持。盡管如此,癌癥的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣, 靶向藥物在臨床應(yīng)用中也面臨著耐藥性、劑量依賴性毒性和胃腸道不良反應(yīng)等問題［3］。因此, 開發(fā)高效低毒的靶向抗癌藥物, 仍然需要在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多個(gè)通路和靶標(biāo)上進(jìn)行深入研究。硒作為一種對(duì)人類和動(dòng)物都必需的微量元素, 其在抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血糖等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［4］。硒化合物在癌癥防治中的作用已經(jīng)得到了廣泛的研究驗(yàn)證, 無(wú)論是流行病學(xué)研究, 還是臨床前和臨床干預(yù)研究, 都證實(shí)了硒在癌癥預(yù)防和治療中的潛在價(jià)值。本研究著重探討硒化合物通過(guò)靶向硫氧還蛋白氧化還原酶(thioredoxin reductase, TrxR)抑制腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的分子機(jī)制, 希望為開發(fā)新型、高效低毒的靶向抗癌藥物提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究使用人類惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251 和U87 作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ? 采用不同濃度的硒化合物進(jìn)行處理, 并運(yùn)用Western blot 技術(shù)和流式細(xì)胞分析技術(shù), 深入分析硒化合物對(duì)TrxR 蛋白表達(dá)及其下游凋亡信號(hào)通路的影響。通過(guò)這一系列的實(shí)驗(yàn)探索, 期望能夠揭示硒化合物抑制腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的分子機(jī)制, 為靶向治療提供新的策略和方法。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇U251 和U87 人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞、癌旁組織細(xì)胞作為研究對(duì)象, 將人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞納入觀察組, 癌旁組織細(xì)胞納入對(duì)照組, 以不同濃度的硒化合物處理U251 和U87 人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞一定時(shí)間。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞活性檢測(cè) 在細(xì)胞活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中, 選用了幾種不同類型的腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng), 確保細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。細(xì)胞分為多組, 分別用不同濃度(0、10、20、50、100 μM)的硒化合物處理, 并設(shè)立對(duì)照組不添加硒化合物。處理時(shí)間設(shè)定為24 h, 以觀察硒化合物對(duì)細(xì)胞活性的影響。之后, 使用四唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞活性, 將MTT 溶液添加到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板中, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h, 使MTT 能夠被活細(xì)胞中的脫氫酶還原, 形成可溶解的紫色甲晶石沉淀。隨后添加二甲基亞砜(DMSO)溶劑, 充分溶解甲晶石沉淀, 并使用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度, 從而計(jì)算出細(xì)胞活性。通過(guò)這一系列實(shí)驗(yàn), 能夠篩選出對(duì)硒化合物響應(yīng)最敏感的腫瘤細(xì)胞系, 為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

1.2.2 TrxR 蛋白的表達(dá) 在研究硒化合物對(duì)TrxR 蛋白表達(dá)的影響時(shí), 選用了U251 和U87 人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料。細(xì)胞分為多組, 分別用不同濃度(0、10、20、50、100 μM)的硒化合物處理, 處理時(shí)間分別設(shè)定為24 h 和48 h。處理后, 提取細(xì)胞中的蛋白質(zhì),并使用Bradford 法確定蛋白質(zhì)濃度。隨后, 將蛋白樣品進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳, 并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC 膜)上。使用5%脫脂奶粉封閉膜, 然后用抗TrxR 的一抗孵育, 再用相應(yīng)的二抗孵育。通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影系統(tǒng)檢測(cè)信號(hào), 并使用ImageJ 等軟件進(jìn)行分析, 從而了解硒化合物對(duì)TrxR 蛋白表達(dá)的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)。

1.2.3 ROS 變化和DNA 斷裂檢測(cè) 在觀察硒化合物對(duì)細(xì)胞ROS 水平和DNA 斷裂的影響時(shí), 將細(xì)胞分為多組, 分別用不同濃度(0、10、20、50、100 μM)的硒化合物處理。使用2', 7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)作為探針, 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平, 并通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析, 得到ROS 水平的變化情況。同時(shí), 使用原位末端凋亡法(TUNEL)技術(shù)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)斷裂的DNA,觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性, 所有實(shí)驗(yàn)都至少重復(fù)3 次, 結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。利用SPSS26.0 等統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 兩組之間利用雙尾檢驗(yàn), 多組之間利用多重比較。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組TrxR 蛋白的表達(dá)水平比較 觀察組U251、U87 人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞TrxR 蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表1。

表1 兩組TrxR 蛋白的表達(dá)水平比較( ±s, ng/ml)

表1 兩組TrxR 蛋白的表達(dá)水平比較( ±s, ng/ml)

注：與對(duì)照組比較, aP<0.05

組別 TrxR 蛋白 U87 人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞TrxR 蛋白U251 人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞TrxR 蛋白觀察組 26.78±2.06a 26.92±2.14a 26.76±2.32a對(duì)照組 1.09±0.21 t 24.566 24.824 24.746 P<0.001 <0.001 <0.001

2.2 SeC、MeSe、SeMe 對(duì)觀察組細(xì)胞活性的影響隨著SeC、MeSe、SeMe 濃度的升高, U251 和U87 人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性逐漸下降。見表2, 表3, 表4。

表2 SeC 對(duì)U251 和U87 人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性的影響(%)

表3 MeSe 對(duì)U251 和U87 人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性的影響(%)

表4 SeMe 對(duì)U251 和U87 人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性的影響(%)

2.3 SeC、MeSe、SeMe 對(duì)觀察組細(xì)胞TrxR 蛋白表達(dá)水平的影響 與干預(yù)前相比, 經(jīng)過(guò)SeC、MeSe、SeMe干預(yù)后, U251 和U87 人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞組織中TrxR蛋白表達(dá)下降, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表5,表6。

表5 SeC、MeSe、SeMe 對(duì)U251 人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞TrxR 蛋白表達(dá)水平的影響( ±s, ng/ml)

表5 SeC、MeSe、SeMe 對(duì)U251 人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞TrxR 蛋白表達(dá)水平的影響( ±s, ng/ml)

注：與干預(yù)前比較, aP<0.05

時(shí)間 SeC MeSe SeMe干預(yù)前 26.76±2.32干預(yù)后 20.19±3.70a 20.89±3.58a 20.89±2.58a t 8.154 8.224 8.146 P<0.001 <0.001 <0.001

表6 SeC、MeSe、SeMe 對(duì)U87 人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞TrxR 蛋白表達(dá)水平的影響( ±s, ng/ml)

表6 SeC、MeSe、SeMe 對(duì)U87 人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞TrxR 蛋白表達(dá)水平的影響( ±s, ng/ml)

注：與干預(yù)前比較, aP<0.05

時(shí)間 SeC MeSe SeMe干預(yù)前 26.92±2.14干預(yù)后 20.89±3.14a 21.09±3.47a 20.96±3.48a t 8.548 8.425 8.236 P<0.001 <0.001 <0.001

2.4 SeC、MeSe、SeMe 對(duì)觀察組細(xì)胞組織中ROS表達(dá)水平的影響 與干預(yù)前相比, 經(jīng)過(guò)SeC、MeSe、SeMe 干預(yù)后, U251 和U87 人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞組織中ROS 表達(dá)水平升高, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表7, 表8。

表7 SeC、MeSe、SeMe 對(duì)U251 人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞組織中ROS 表達(dá)的影響( ±s, U/ml)

表7 SeC、MeSe、SeMe 對(duì)U251 人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞組織中ROS 表達(dá)的影響( ±s, U/ml)

注：與干預(yù)前比較, aP<0.05

時(shí)間 SeC MeSe SeMe干預(yù)前 832.76±30.32干預(yù)后 1097.23±54.76a 1001.84±54.54a 1096.89±54.58a t 78.224 80.598 79.36 P<0.001 <0.001 <0.001

表8 SeC、MeSe、SeMe 對(duì)U87 人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞組織中ROS 表達(dá)的影響( ±s, ng/ml)

表8 SeC、MeSe、SeMe 對(duì)U87 人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞組織中ROS 表達(dá)的影響( ±s, ng/ml)

注：與干預(yù)前比較, aP<0.05

時(shí)間 SeC MeSe SeMe干預(yù)前 839.76±42.47干預(yù)后 1065.89±54.65a 1046.09±54.12a 1096.96±54.48a t 78.561 78.862 78.645 P<0.001 <0.001 <0.001

3 討論

腫瘤的惡性生長(zhǎng)對(duì)人類健康構(gòu)成了巨大威脅, 其中腦膠質(zhì)瘤作為一種高發(fā)的惡性腫瘤, 其治療一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。從本研究的結(jié)果來(lái)看, 觀察組U251、U87 人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞TrxR 蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組高, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；且隨著硒化合物濃度的增加, U251 和U87 人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性逐漸下降；與干預(yù)前相比, 經(jīng)過(guò)SeC、MeSe、SeMe 干預(yù)后,U251 和U87 人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞組織中ROS 表達(dá)水平升高, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。這一結(jié)果表明,硒化合物可能通過(guò)抑制TrxR 蛋白的活性, 增加細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平, 從而誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡, 抑制腫瘤的生長(zhǎng)。這為臨床提供了一種新的靶向治療策略, 即通過(guò)靶向TrxR 蛋白, 調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平, 達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。這一發(fā)現(xiàn)不僅豐富了對(duì)腦膠質(zhì)瘤治療機(jī)制的認(rèn)識(shí), 也為開發(fā)新型抗腫瘤藥物提供了新的研究方向［5］。

值得注意的是, 盡管本研究的結(jié)果在一定程度上驗(yàn)證了硒化合物通過(guò)靶向TrxR 蛋白抑制腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的分子機(jī)制, 但仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和深入研究。未來(lái)的研究可以從硒化合物的劑量效應(yīng)、時(shí)間效應(yīng)以及與其他抗腫瘤藥物的聯(lián)用效應(yīng)等方面進(jìn)行深入探討,以期為臨床應(yīng)用提供更加全面和準(zhǔn)確的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

硫氧還蛋白系統(tǒng)是除谷胱甘肽和超氧化物歧化酶之外的另一內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng), 由 TrxR、天然底物硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)組成, 是一種NADPH 依賴的包含F(xiàn)AD 結(jié)構(gòu)域的二聚體硒酶, 屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員, 其主要功能是利用NADPH 催化小分子蛋白 Trx 上的-S2還原成(-SH)2的反應(yīng), 即維持Trx 的還原型(見圖1)［6］。隨著對(duì)TrxR 深入研究發(fā)現(xiàn), 其N-端的FAD 結(jié)構(gòu)域有一個(gè)保守的氧化還原活性中心-Cys-Val-Asn-Val-Gly-Cys-, 在C-末端含有由硒半胱氨酸和半胱氨酸構(gòu)成的活性中心-Gly-Cys-Sec-Gly-。由于處于還原態(tài)的C-端氧化還原活性中心Cys 和SeCys 殘基具有很強(qiáng)的親核性, 因此TrxR 可以催化還原多種底物或配體。除Trx 外許多內(nèi)生的和外來(lái)的化合物, 如維生素K3、硫辛酸、5, 5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)和四氧嘧啶、磷脂氫過(guò)氧化物等, 都可被TrxR 還原。因此TrxR 在機(jī)體氧化還原調(diào)節(jié)和抗氧化防御中起著重要的作用［7］。由于臨床上70%的癌癥發(fā)生與細(xì)胞凋亡失控有關(guān), 利用凋亡調(diào)控機(jī)制尋找高效低毒、作用機(jī)制明確的凋亡誘導(dǎo)劑已成為腫瘤防治的一個(gè)重要策略［8］。當(dāng)前臨床上常規(guī)使用的化療藥物基本上都是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡而達(dá)到治療的目的。

圖1 硫氧還蛋白系統(tǒng)氧化還原循環(huán)

硒化合物作為一類具有抗腫瘤潛力的化合物, 其通過(guò)多種機(jī)制抑制腫瘤生長(zhǎng)。硒化合物不僅能提升細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平, 減輕氧化應(yīng)激, 還能通過(guò)抑制與氧化應(yīng)激相關(guān)的信號(hào)通路, 如核因子κB(NF-κB)和Nrf2 等, 從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。此外, 硒化合物還能通過(guò)激活細(xì)胞凋亡途徑, 影響細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá), 抑制細(xì)胞增殖并阻斷腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程。硒化合物還能抑制腫瘤微血管的形成, 切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)［9-12］。這些機(jī)制共同作用, 使硒化合物成為抑制腫瘤生長(zhǎng)的有力工具。TrxR 作為調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的關(guān)鍵分子, 已被證實(shí)其能有效抑制多種腫瘤的生長(zhǎng)［13-15］。TrxR 已成為國(guó)際上高度關(guān)注的新型抗腫瘤靶標(biāo)。本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn), 有機(jī)硒化合物能夠通過(guò)誘導(dǎo)ROS 產(chǎn)生, 引發(fā)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡, 但ROS 的產(chǎn)生機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。

硒化合物作為一類具有抗腫瘤潛力的化合物, 在本研究中顯示了通過(guò)靶向TrxR 抑制腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的分子機(jī)制。研究結(jié)果表明, 硒化合物能夠顯著抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移, 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［16-18］。這一發(fā)現(xiàn)為硒化合物在腦膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用提供了理論依據(jù), 并為未來(lái)的臨床治療提供了新的方向。通過(guò)抑制TrxR 的活性, 硒化合物導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的失衡, 這一改變直接影響到腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的正常功能, 抑制其生長(zhǎng)。同時(shí), 硒化合物還通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)蛋白的表達(dá), 激活細(xì)胞凋亡途徑, 進(jìn)一步促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的死亡［19,20］。

總之, 本研究揭示了硒化合物通過(guò)靶向TrxR 抑制腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的分子機(jī)制, 為硒化合物在腫瘤治療中的應(yīng)用提供了新的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)于開發(fā)新型抗腫瘤藥物, 提供更多治療腫瘤的選擇具有重要意義。本研究通過(guò)對(duì)腦膠質(zhì)瘤組織中TrxR和ROS 的表達(dá)進(jìn)行分析, 探討了硒化合物對(duì)腦膠質(zhì)瘤的影響。結(jié)果顯示, 硒化合物可能通過(guò)抑制TrxR 蛋白的活性增加細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平, 從而誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡, 抑制腫瘤的生長(zhǎng), 這為硒化合物在腦膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù), 也為未來(lái)基于TrxR 靶向的抗腫瘤藥物的研發(fā)和應(yīng)用提供了新的思路和方向。