吳與倫，張欣然，沈阿靈，劉麗雅，魏麗慧，陳友琴，方 翌*

（1.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新與轉化中心，福建 福州 350122；4.美國凱斯西儲大學醫(yī)學院，俄亥俄州 克利夫蘭 44106）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性炎癥性腸病，以黏膜和胃腸道生理改變?yōu)樘卣?，臨床表現(xiàn)為腹痛、便血、腹瀉、體質量減輕，但目前其發(fā)病機制尚不清楚［1］。UC 的主要病機以濕熱瘀血為標，脾腎虧虛為本；清熱化濕散瘀、止瀉止痢為其治法治則［2］。中醫(yī)藥治療UC 的歷史悠久，臨床療效確切，抗炎效果顯著［3］。清化腸飲是臨床治療UC 的常用方，方中厚樸苦燥降瀉，辛散溫通，入大腸經，是中醫(yī)學治療胃腸疾病要藥［4］。新橙皮苷作為厚樸中的活性成分，在最新的研究中被證實具有較強的抗炎、抗氧化、免疫調節(jié)等作用，可減輕DSS誘導的UC 小鼠結腸黏膜組織病理損傷，但其治療UC 中的作用機制尚未明確［5-7］。因此，本研究擬采用網絡藥理學分析和體內實驗，初步探討新橙皮苷治療潰瘍性結腸炎的相關機制，以期闡明新橙皮苷治療UC 的新機制和新靶點，為臨床研發(fā)治療UC 藥物提供新的實驗依據。

1 實驗材料

1.1實驗動物 30 只雄性SPF C57BL/6J 小鼠，8～10 周齡，體質量（21±3）g，購自上海SLAC 實驗動物科技有限公司，所有動物均飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF 級實驗室，動物使用許可證編號：SYXK（閩）2020-0002。本實驗已通過福建中醫(yī)藥大學倫理委員會批準（FJTCM IACUC 2022185）。

1.2實驗藥物的配制 新橙皮苷給藥劑量按照人與動物體型系數(shù)換算，每只小鼠按照0.1 mL/10 g 的灌胃劑量配制藥物，以蒸餾水配置0.5、5、50 mg/（kg·d）的新橙皮苷混懸液，超聲4～5 h 至液體充分溶解澄清透明，每日現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3實驗試劑 DSS 購自美國MP Biochemicals 公司（貨號：0216011080-100 g）；新橙皮苷購自北京MedChemExpress 有限公司，純度＞98.48%（貨號：HY-N0101）；便隱血（OB）試劑（匹拉米洞法）購自珠海市貝索生物技術有限公司（貨號：BA2020B）；4%多聚甲醛固定液、蘇木素溶液購自北京索萊寶公司（貨號：LA0427、G1140）；免疫組化超敏Ultra-SensitiveTMSP 試劑盒購自福州邁新生物技術有限公司（貨號：KIT-9710）；p-p38 一抗購自南京SAB公司（貨號：12322）；p38 一抗購自美國CST 公司（貨號：8690）。

1.4實驗儀器 生物組織脫水機和生物組織石蠟包埋機購自湖北孝感亞光有限公司；全自動石蠟切片機和倒置顯微鏡購自德國Leica 公司；熒光正置顯微鏡購自日本Nikon 公司。

2 實驗方法

2.1潰瘍性結腸炎疾病靶點的收集 以“ ulcerative colitis”為檢索詞，在GeneCards 數(shù)據庫（https：//www.genecards.org/）和DisGenet（http：//www.disgenet.org/）2 個數(shù)據庫中檢索UC 的相關人類基因靶點，并將2 個數(shù)據庫中的靶點取并集并刪除重復項。

2.2新橙皮苷作用靶點預測 在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據庫與分析平臺（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）、中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺（TCMIP，http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php）、Swisstargets數(shù)據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、Sym-Map（http：//www.symmap.org/）、BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）中檢索新橙皮苷潛在蛋白靶點，利用Unitprot 數(shù)據庫（http：//www.Unitprot.org/）將獲取的蛋白靶點校準其基因名并刪除重復項，與UC 的疾病相關靶點取交集獲得的新橙皮苷治療UC 的潛在靶點。

2.3GO 和KEGG 富集分析 將“2.2”項中預測的新橙皮苷治療UC 的潛在靶點基因名輸入DAVID數(shù)據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）中，設置物種為“ homo sapiens”，進行GO 和KEGG 富集分析，篩選P＜0.005的結果，從中選取KEGG 通路富集排名前20和GO 分類富集排名前10 的結果，使用R-Studio 軟件對結果進行可視化，并分別繪制相應氣泡圖。

2.4構建靶點相互作用（PPI）網絡 將“2.2”中新橙皮苷治療UC 的潛在靶點基因名導入STRING 生物信息學數(shù)據庫（https：//string-db.org/），設置物種為“ homo sapiens”，置信度設定＞0.9，獲取作用靶點的互作信息。通過Cytoscape 3.7.2 軟件繪制PPI 網絡圖，并對網絡圖進行拓撲結構分析，確定新橙皮苷治療UC 的核心靶點。

2.5小鼠潰瘍性結腸炎模型的構建 采用口服2%葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶液的方法建立潰瘍性結腸炎模型［8］，讓小鼠自由飲用7 d 2% DSS 溶液，DSS溶液每天更換1 次，第8～10 d 恢復正常飲水，第11 d 取材，期間正常飲食。

2.6分組與干預 小鼠適應性喂養(yǎng)7 d 后，在開始構建模型前，通過隨機數(shù)字表法將其分為對照組、模型組和低、中、高劑量組，每組6 只。構建模型后，對照組和模型組小鼠使用蒸餾水灌胃，低、中、高組（具體劑量參見“1.2”）使用配置好的不同濃度新橙皮苷溶液灌胃。

2.7疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分及體質量變化計算 造模期間每日通過盲法評估每只小鼠臨床特征：包括糞便性狀、體質量改變和便血程度情況，并參考JACKSON 等［9］的評估標準計算DAI 評分。同時，每日記錄小鼠體質量與給藥第1 天變化百分比，繪制小鼠體質量變化百分率折線圖［10-11］。

2.8結腸組織免疫組化檢測 給藥干預11 d 后取材，小鼠結腸組織固定于4%多聚甲醛中；24 h 后，進行組織梯度乙醇脫水及二甲苯石蠟透明，將結腸組織包埋于石蠟，切成4 μm 切片，用顯微鏡載玻片承載后60 ℃烘烤5 h，將其脫蠟至水化，以0.25%TritonX-100 的PBS 溶液破膜10 min。隨后，阻斷內源性過氧化物酶活性10 min，并用封閉液阻斷抗體非特異性結合1 h。將切片與p-p38 或p38 抗體在4 ℃下孵育過夜，然后與酶標二抗孵育1 h。最后使用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）試劑盒和蘇木素對樣本進行染色，然后在鏡下觀察并拍照。

2.9統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據進行分析。計量資料服從正態(tài)分布以（±s）表示，多組間體質量變化和免疫組化陽性率比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布的數(shù)據用［M（P25，P75）］表示，多組間DAI 評分比較采用秩和檢驗進行分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1新橙皮苷治療UC 的潛在作用靶點 由Gene-Cards 數(shù)據庫和DisGenet 數(shù)據庫檢索獲得2 374 個UC 疾病作用靶點，TCMSP、Swiss Target Prediction、TCMIP、SymMap、BATMAN-TCM 數(shù)據庫檢索合計獲取101 個新橙皮苷作用靶點。將新橙皮苷潛在蛋白靶點與UC 相關疾病靶點相映射，二者交集獲得51 個新橙皮苷治療UC 的潛在靶點，見圖1。

圖1 新橙皮苷治療UC 的潛在靶點

3.2GO 功能富集分析 采用DAVID 數(shù)據庫對新橙皮苷治療UC 的潛在靶點進行GO 功能富集分析，獲得50 個涉及生物過程（biological process，BP），包括對外源性刺激的反應、膠原分解代謝過程、細胞外基質分解、蛋白水解、基因表達的負調控、環(huán)氧合酶途徑等，見圖2；20 個細胞組分（cellular component，CC），包括細胞外基質、細胞外間隙、大分子復合物、外泌體、細胞質膜等，見圖3；42 個分子功能（molecular function，MF），包括內肽酶活性、金屬內肽酶活性、絲氨酸內肽酶活性、酶結合、相同蛋白質結合、轉錄共激活因子結合等。見圖4。

圖2 新橙皮苷生物過程分析圖

圖3 新橙皮苷細胞組分分析圖

圖4 新橙皮苷分子功能分析圖

3.3KEGG 通路分析 使用DAVID 數(shù)據庫對潛在靶點進行KEGG 通路分析，得到66 條通路，根據富集的基因數(shù)的多少進行排序，整理出排名前20 名，繪制氣泡圖。這些交潛在靶點主要富集的通路包括MAPK 信號通路、癌癥的發(fā)病途徑、化學致癌-活性氧、內分泌耐藥、雌激素信號通路、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE 通路、IL-17 信號通路等。見圖5。

圖5 潛在靶點KEGG 信號通路富集分析結果

3.4潛在靶點PPI 網絡的構建與分析 STRING 數(shù)據庫分析新橙皮苷治療UC 的潛在靶點，構建獲取50 個節(jié)點，172 條節(jié)點連接線的蛋白互作PPI 網絡。Cytoscape 3.7.2 軟件繪制PPI 網絡圖，節(jié)點平均度值為10.244 897 96，接近中心性平均值為0.515 360 558，介數(shù)中心度平均值為0.021 421 335。其中，有19 個節(jié)點度值＞平均數(shù)，包括：絲裂原激活蛋白激酶14（MAPK14；p38）、白蛋白（ALB）、環(huán)狀素受體1（ESR1）、纖維連接蛋白1（FN1）、胱天蛋白酶3（CASP3）、環(huán)氧合酶2（PTGS2）、成纖維細胞生長因子2（FGF2）、干擾素（IFNG）、前列腺素-內過氧化物合酶2（PTGS2）、胱天蛋白酶1（CASP1）等，以上節(jié)點為新橙皮苷治療UC 的核心靶點。見圖6。

圖6 新橙皮苷治療UC 潛在靶點蛋白PPI 互作圖

3.5不同劑量新橙皮苷對UC 小鼠體質量的影響 為進一步驗證網絡藥理學的分析結果，本實驗采用不同劑量新橙皮苷干預UC 模型小鼠，初步分析新橙皮苷的藥效和作用機制。結果表明，與對照組相比，模型組在服用DSS 后體質量出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05）；然而與模型組相比，低、中、高劑量干預后，體質量都出現(xiàn)顯著升高（P＜0.05）。見圖7。

圖7 新橙皮苷干預對UC 小鼠體質量的影響

3.6不同劑量新橙皮苷對UC 小鼠DAI 評分的影響 5 組小鼠的DAI 評分顯示，在第11 天時，對照組的小鼠DAI 評分為0；與對照組相比，模型組在服用DSS 后DAI 評分顯著上升（P＜0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量新橙皮苷干預都能顯著降低DAI 評分（P＜0.05）。見圖8。

圖8 新橙皮苷干預對UC 小鼠DAI 評分的影響

3.7不同劑量新橙皮苷對UC 小鼠結腸組織中pp38、p38 蛋白的影響 KEGG 富集到的關鍵通路MAPK 通路中重要組成部分p38（MAPK14）同樣在的PPI 蛋白互作網絡中富集到，結合圖5 和圖6 的分析結果，對排分靠前的MAPK 通路關鍵蛋白pp38 和p38 進行驗證分析。結果顯示：與對照組比較，模型組小鼠的結腸組織蛋白中p-p38 蛋白的表達水平顯著升高（P＜0.05），p38 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，低、中、高劑量組小鼠結腸組織蛋白p-p38蛋白的表達水平均顯著降低（P＜0.05），p38 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖9—12。

圖9 5 組結腸組織p-p38 蛋白陽性面積率比較

圖10 5 組結腸組織p-p38 蛋白表達（×400）

圖11 5 組結腸組織p38 蛋白表達（×400）

圖12 5 組結腸組織p38 蛋白陽性面積率比較

4 討 論

先前的研究發(fā)現(xiàn)，新橙皮苷可通過降低結腸組織中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β 的表達水平來發(fā)揮其對UC 的保護作用［5］。本研究通過TCMSP、Swiss Target Prediction、TCMIP、SymMap、BATMANTCM 數(shù)據庫進行新橙皮苷靶點的挖掘，并通過Dis-Genet 和GeneCards 數(shù)據庫進行UC 靶點的挖掘，篩選并確定新橙皮苷可能作用于UC的潛在靶點51個。通過KEGG 通路分析，富集到MAPK 信號通路、IL-17 信號通路、化學致癌-活性氧通路等信號通路。MAPK 信號通路的激活主要涉及JNK、ERK 和p38的磷酸化，進一步激活細胞核中的轉錄信號從而在細胞增殖與分化、凋亡、調節(jié)炎癥等生理和病理過程中發(fā)揮重要作用［12］。林雄［13］發(fā)現(xiàn)MAPK通路的激活可以促進NF-κB p65 的磷酸化，上調炎癥細胞因子如TNF-α、IL-6 和IL-1β 的表達水平，通過蒼術醇提物抑制MAPK 通路的激活可改善UC 癥狀。IL-17 是一種促炎因子，在多種細胞中都有表達，通過促進TNF-α、IL-6 等炎性因子的釋放，發(fā)揮擴大炎癥等功能［14］。馬杰等［15］研究結果表明，黃芩多糖可通過抑制IL-17 的表達發(fā)揮對UC 的治療作用?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）的過量累積導致細胞膜通透性增加，促進炎癥反應［16］。研究發(fā)現(xiàn)在UC 腸道黏膜中會過量生成ROS，促進組織損傷［17］。這些研究進一步佐證了新橙皮苷可能通過調控MAPK 信號通路、IL-17 信號通路、活性氧相關通路來發(fā)揮其對潰瘍性結腸炎的保護作用。

本研究通過構建新橙皮苷治療UC 的潛在作用靶點PPI 網絡圖，發(fā)現(xiàn)MAPK14（p38）、CASP1、PTGS2 等靶點可能參與新橙皮苷治療UC 的作用機制。陳賽等［18］研究證實白芍七物顆粒干預UC 小鼠，能降低p38 的磷酸化水平，通過阻斷NOXs-ROS-p38 信號通路的傳導，緩解UC 小鼠結腸組織的炎癥反應；EPSTEIN 等［19］研究證實，姜黃素可通過阻斷p38 MAPK 信號通路，減輕結腸黏膜組織的白細胞浸潤，有效治療DSS 誘導的UC 小鼠的結腸炎性病變。Caspase-1 是介導細胞焦亡所依賴的核心蛋白，它的激活是細胞焦亡經典途徑的核心，屬于免疫系統(tǒng)的重要組成部分［20］。研究表明，人炎性腸組織中Caspase-1 活化水平比正常腸組織中活化水平更高［21］。PTGS2 在調控免疫應答發(fā)揮重要作用，主要表達在單核細胞和腸上皮細胞中，在UC發(fā)展過程中對結腸黏膜愈合有促進作用［22］。這些研究提示新橙皮苷可能通過MAPK14（p38）、CASP1、PTGS2 等關鍵靶點的表達水平，調控相關免疫應答，治療DSS 誘導的UC 小鼠的結腸炎性病變。

UC 的主要臨床表現(xiàn)是腹痛、腹瀉、黏液膿血便等，DSS 為經典的UC 造模方法，利用DAI 評分能反映該模型中UC 體質量下降、腹瀉、黏液膿血便情況。本研究體內實驗中DSS 造模后的UC 小鼠出現(xiàn)了明顯的DAI 評分升高和體質量下降，而新橙皮苷可顯著降低DSS 誘導的UC 小鼠體質量下降和DAI評分升高，結果表明新橙皮苷可緩解DSS 誘導的UC 小鼠的UC 體質量下降、腹瀉、黏液膿血便癥狀。再以該模型驗證網絡藥理學分析富集出的MAPK14（p38）關鍵靶點，通過體內實驗的驗證，可得出以下結果：在DSS 誘導的UC 小鼠模型中，新橙皮苷干預能夠顯著逆轉模型組小鼠結腸組織中p38 蛋白磷酸化水平的升高，提示新橙皮苷對UC 的治療作用可能是通過發(fā)揮對p38 MPAK 通路的抑制而實現(xiàn)。

綜上，本研究通過網絡藥理學對新橙皮苷治療UC 的相關分子機制進行探討。采用體內實驗對新橙皮苷調控p38 MPAK 信號通路，進而起到抑制UC 的發(fā)生、發(fā)展進行驗證，為臨床中研發(fā)防治UC的藥物提供了有效的依據。不足之處在于，研究中僅對p38 MPAK 信號通路進行了探索驗證，并未對該通路上下游相關通路蛋白進一步分析，計劃在下一步的實驗中進行探究。