魏麗慧，程 瑛，謝 意，彭 軍，沈阿靈，3*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新與轉(zhuǎn)化中心，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122；3.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122）

高血壓是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素。我國有超過3.3 億人患有高血壓，已成為日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題［1-2］。高血壓患者因長期壓力過載可導(dǎo)致左室肥厚、心肌纖維化等改變，心臟進(jìn)行性重構(gòu)，最終出現(xiàn)心力衰竭，嚴(yán)重危害居民身心健康［3］。因此，進(jìn)一步探究更為有效的高血壓防治途徑，減緩心臟的損害尤為關(guān)鍵。

乙氧基血根堿（Ethoxysanguinarine，ETH）是血根堿氨化乙醇提取過程的結(jié)晶產(chǎn)物。2021 年課題組首次發(fā)現(xiàn)乙氧基血根堿具有降低血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的高血壓小鼠血壓及改善心臟功能的作用［4］，但其改善心臟功能的具體作用機(jī)制有待深入研究。心肌纖維化是高血壓患者心臟損傷的主要病理改變［5］，預(yù)防心肌纖維化在高血壓性心臟病的治療中至關(guān)重要。因此，本研究從心肌纖維化角度探討了乙氧基血根堿改善AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓心臟功能障礙的作用及其可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動物 36只雄性，SPF級，8周齡，C57BL/6小鼠，體質(zhì)量（28±2） g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供，動物使用許可證號：SYXK（閩）2019-0007。飼養(yǎng)在SPF 級環(huán)境中（溫度：22～26 ℃，黑暗/光明各12 h）。本研究方案經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（審批號：FJTCM IACUC 2022051）。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 Masson 染色試劑（貨號：G1340）購自北京索萊寶科技有限公司；天狼星紅染色試劑（貨號：PH1099）購自福州飛凈生物科技有限公司；增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）（貨號：ab29）購自英國Abcam 公司；TGF-β1（貨號：ABP52598）、GAPDH（貨號：ABL1021）購自中國Abbkine Scientific 公司；Ⅰ型膠原（貨號：14695-1-AP）、Ⅲ型膠原（貨號：22734-1-AP）、纖維連接蛋白（FN）（貨號：15613-1-AP）購自美國Proteintech 公司；α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）（貨號：40482）、p-smad2（貨號：913429）、p-smad3（貨號：12838）、smad2（貨號：41442）、smad3（貨號：41445）購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad 公司；普通顯微鏡、偏光顯微鏡購自德國Leica 公司；低溫高速離心機(jī)購自美國Thermo公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1分組、造模及給藥 雄性C57BL/6 小鼠36 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，根據(jù)小鼠的基線血壓隨機(jī)分為空白組，模型組，低、中、高劑量組和陽性藥組。滲透泵置于生理鹽水中，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育過夜激活，采用1.5%～2%異氟烷吸入麻醉小鼠，消毒后皮下植入滲透微泵。除空白組外的其余各組小鼠皮下以500 ng/（kg·min）的速率釋放AngⅡ，空白組在泵內(nèi)注入等量生理鹽水，持續(xù)28 d；低、中、高劑量組從術(shù)后第1 天起分別給予0.1、1、10 mg/（kg·d）乙氧基血根堿灌胃，空白組和模型組給予等體積生理鹽水，陽性藥組給予10 mg/（kg·d）纈沙坦，連續(xù)灌胃給藥28 d。

2.2觀察指標(biāo)

2.2.1小鼠心臟纖維化 采用Masson 染色評估各組小鼠心臟纖維化的陽性染色情況。28 d 后麻醉處死小鼠。取出心臟，用4%多聚甲醛固定48 h，制作石蠟切片；切片進(jìn)行脫蠟至蒸餾水中，Weigert 鐵蘇木素液染5～10 min，沖洗液沖洗30 s；1%鹽酸酒精分化8 min，流水沖洗，麗春紅酸性復(fù)染液染色5 min，流水沖洗，1%磷鉬酸水溶液染5～10 min，1%的冰醋酸水溶液處理2 min；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡觀察小鼠心臟纖維化情況。每張切片隨機(jī)選取高倍鏡下的6 個視野，評估纖維化的陽性染色。

2.2.2小鼠心臟膠原沉積情況 采用天狼星紅染色評估各組小鼠心臟膠原沉積情況。心臟組織4 μm切片，常規(guī)脫蠟，然后用天狼星紅染色1 h，自來水沖洗，蘇木精染色8 min，自來水沖洗10 min。采用偏光顯微鏡400 倍鏡下觀察拍照。使用Image Pro-Plus 軟件，在6 個顯微鏡視野下評估膠原沉積的區(qū)域。

2.2.3Western blot檢測Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、PCNA、α-SMA、FN、TGF-β1、p-smad2/3 及smad2/3 蛋白表達(dá)量 取適量心臟組織樣本，裂解液裂解，4 ℃高速離心機(jī)（14 000 r/min）離心20 min。根據(jù)BCA 試劑盒說明書測定蛋白濃度。加入SDS 在100 ℃的金屬水浴鍋?zhàn)冃?。利用SDS-PAGE 膠進(jìn)行電泳，結(jié)束后，將其轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用牛奶在室溫下封閉2 h，4 ℃孵育Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、PCNA、α-SMA、FN、TGF-β1、p-smad2/3 及smad2/3 一抗過夜。用含0.2% Tween 的TBST 洗滌3 次，每次洗滌10 min，然后加入相應(yīng)的二抗在室溫繼續(xù)孵育2 h，用TBST洗滌3 次，最后加入ECL 顯影劑（A 液∶B 液＝1∶1），置于凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行成像、掃描。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0 軟件分析數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)圖繪制。在3 組或更多組之間進(jìn)行差異比較時(shí)，當(dāng)計(jì)量資料服從正態(tài)分布時(shí)用（±s）表示，使用單因素方差分析進(jìn)行比較，方差齊時(shí)使用LSD-t進(jìn)行事后檢驗(yàn)；當(dāng)方差不齊時(shí)使用Games-Howell 進(jìn)行事后檢驗(yàn)；當(dāng)計(jì)量資料不服從正態(tài)分布時(shí)用［M（P25，P75）］表示，采用非參數(shù)Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)用于比較數(shù)據(jù)的組間差異。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.16組小鼠心臟組織心肌纖維化程度及膠原沉積情況比較 與空白組比較，模型組小鼠心肌間質(zhì)和血管周圍出現(xiàn)明顯纖維化及膠原沉積（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高劑量組及陽性藥組心肌間質(zhì)和血管周圍纖維化及膠原沉積程度顯著減少，且作用呈劑量依賴性（P＜0.05）。圖1、表1、圖2、表2。

表1 6 組小鼠心肌纖維化程度比較（±s）

表1 6 組小鼠心肌纖維化程度比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與低劑量組比較，3） P＜0.05；與中劑量組比較，4） P＜0.05。

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表2 6 組小鼠心肌膠原沉積程度比較（±s）

表2 6 組小鼠心肌膠原沉積程度比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與低劑量組比較，3） P＜0.05；與中劑量組比較，4） P＜0.05。

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圖1 6 組小鼠心肌間質(zhì)及血管周圍心肌纖維化情況（Masson 染色，×400）

圖2 6 組小鼠心肌間質(zhì)及血管周圍心肌膠原沉積情況（天狼星紅染色，×400）

3.26 組小鼠心臟組織中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)情況 與空白組比較，模型組小鼠心臟組織中Ⅰ型、Ⅲ型膠原的蛋白表達(dá)均顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，低中高劑量及陽性藥組心臟組織中Ⅰ型、Ⅲ型膠原的蛋白表達(dá)均顯著減少（P＜0.05）。見圖3、表3。

表3 6 組小鼠心臟組織中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)量比較（±s）

表3 6 組小鼠心臟組織中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)量比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與低劑量組比較，3） P＜0.05；與中劑量組比較，4） P＜0.05。

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圖3 6 組小鼠心臟組織中Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原蛋白條帶圖

3.3小鼠心臟組織中PCNA 蛋白表達(dá)情況 與空白組比較，模型組心臟組織中PCNA 的表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高劑量及陽性藥組心臟組織中PCNA 的表達(dá)均明顯減弱（P＜0.05），表明乙氧基血根堿處理顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞的增加。見圖4、表4。

表4 6 組小鼠心臟組織PCNA 蛋白表達(dá)量比較（±s）

表4 6 組小鼠心臟組織PCNA 蛋白表達(dá)量比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

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圖4 6 組小鼠心臟組織PCNA 蛋白條帶圖

3.46 組小鼠心肌成纖維細(xì)胞α-SMA、FN 蛋白表達(dá)情況 與空白組比較，模型組心臟組織中α-SMA及FN 蛋白的表達(dá)增加（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高劑量組及陽性藥組心臟組織中α-SMA 及FN的蛋白表達(dá)均顯著減少（P＜0.05）。見圖5、表5。

表5 6 組小鼠心臟組織α-SMA 及FN 蛋白表達(dá)量比較（±s）

表5 6 組小鼠心臟組織α-SMA 及FN 蛋白表達(dá)量比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與低劑量組比較，3） P＜0.05；與中劑量組比較，4） P＜0.05。

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圖5 6 組小鼠心臟組織α-SMA、FN 蛋白條帶圖

3.56 組小鼠心臟組織TGF-β1、p-smad2/3 及smad2/3 蛋白表達(dá)情況 與空白組比較，模型組小鼠心臟組織中TGF-β1 的蛋白表達(dá)、p-smad2/smad2 比值及p-smad3/smad3 比值顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高劑量組及陽性藥組心臟組織中TGF-β1 的表達(dá)、p-smad2/smad2 比值及p-smad3/smad3 比值均顯著下降（P＜0.05）。見圖6、表6。

表6 6 組小鼠心臟組織TGF-β1 蛋白表達(dá)量、p-smad2/smad2 比值和p-smad3/smad3 比值比較（±s）

表6 6 組小鼠心臟組織TGF-β1 蛋白表達(dá)量、p-smad2/smad2 比值和p-smad3/smad3 比值比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與低劑量組比較，3） P＜0.05；與中劑量組比較，4） P＜0.05。

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圖6 6 組小鼠心臟組織中TGF-β1、p-smad2/3 及smad2/3 蛋白條帶圖

4 討 論

高血壓性心臟病是高血壓最常見的并發(fā)癥之一，最終可引起心力衰竭導(dǎo)致患者死亡。本課題組在前期抗高血壓新藥及機(jī)制研究過程中發(fā)現(xiàn)，降壓新成分乙氧基血根堿具有顯著降低AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓小鼠血壓及改善心臟功能的作用［4］。研究表明心肌纖維化是高血壓患者心臟損傷的主要病理改變［5］，表現(xiàn)為正常心臟組織中出現(xiàn)膠原的過度沉積、排列紊亂、比例失調(diào)，心臟纖維化不僅加重心肌缺血缺氧，而且心室順應(yīng)性下降，經(jīng)過一系列的變化最終導(dǎo)致心室腔逐漸擴(kuò)大，心室收縮和舒張功能均嚴(yán)重受損，進(jìn)而出現(xiàn)心力衰竭［5-8］。故預(yù)防心肌纖維化在高血壓性心臟病的治療中至關(guān)重要。

RAAS 的激活是心肌纖維化的主要原因，AngⅡ在這一過程中起著重要的調(diào)控作用［9-10］。AngⅡ可通過激活血管緊張素Ⅰ型受體，刺激心肌成纖維細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白的表達(dá)，引起心肌纖維化［10］。因此，它可加速高血壓心力衰竭［10-12］。為此，本研究觀察乙氧基血根堿對AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓小鼠心肌纖維化的影響。首先觀察乙氧基血根堿對心肌纖維化及膠原沉積情況的影響，結(jié)果表明乙氧基血根堿治療可以顯著降低高血壓小鼠的心肌纖維化及膠原蛋白的堆積，并顯著下調(diào)心臟組織中Ⅰ型、Ⅲ膠原蛋白表達(dá)。

生理情況下，心臟受到外界損傷刺激時(shí)，心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，肌成纖維細(xì)胞增殖并向損傷部位遷移，合成膠原，修復(fù)損傷的心肌組織。病理狀態(tài)下，如AngⅡ等細(xì)胞因子作用于心肌成纖維細(xì)胞，心肌成纖維細(xì)胞被過度激活，向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并大量增殖分泌膠原蛋白，這些膠原蛋白在損傷部位累積，在初始階段時(shí)起到維持心臟結(jié)構(gòu)和功能的作用，但隨著心臟纖維化程度的加重，最后出現(xiàn)心力衰竭。為此，本項(xiàng)目還觀察了心肌成纖維細(xì)胞增殖及心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的標(biāo)記物PCNA 及α-SMA 蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓小鼠心肌，PCNA 及α-SMA 蛋白表達(dá)顯著升高，經(jīng)乙氧基血根堿治療后PCNA 及α-SMA 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)?？梢娨已趸鶋A可能是通過減輕心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖這一過程，發(fā)揮改善高血壓導(dǎo)致心臟損傷。

研究表明TGF-β1/smad2/3 通路在多種心肌纖維化模型中被激活［13-14］。TGF-β1 通過激活smad2和smad3 磷酸化，并將其信號傳遞至細(xì)胞核內(nèi)，影響多種促纖維化過程的關(guān)鍵介質(zhì)，促進(jìn)組織纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)在AngⅡ刺激后，心臟組織中TGFβ1 蛋白表達(dá)升高，p-smad2/smad2 比值及p-smad3/smad3 比值增加，乙氧基血根堿治療可降低AngⅡ誘導(dǎo)的心臟組織中TGF-β1 的蛋白表達(dá)及p-smad2/smad2 和p-smad3/smad3 的比值。

綜上，本研究證實(shí)乙氧基血根堿可顯著減輕AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓心肌纖維化，可能是通過調(diào)控TGF-β1/smad2/3 通路抑制心肌成纖維細(xì)胞的分化。