肖勛立，黃聰聰，武利雪，胡慧怡，何學(xué)珍，胡立業(yè)，喻理德*

(1.井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院 藥劑科，江西 吉安 343000；2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江西 南昌 330004)

肝臟作為人體重要的臟器，在整個物質(zhì)代謝過程中具有廣泛而多樣的功能，具有重要的研究價值。[1]肝臟的在體研究成本高，且容易受體內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境影響，而原代肝細(xì)胞的體外模型既能較好的保留肝臟的特異性功能，還可有效地降低研究成本，具有良好的重復(fù)性。[2]目前小鼠原代肝細(xì)胞的分離方法有多種，其中最經(jīng)典常用的方法為Seglen 1976年建立的肝臟原位兩步灌流法。[3-4]但兩步原位灌流法使用、發(fā)展至今，依然存在多方面不足導(dǎo)致原代肝細(xì)胞分離重復(fù)性不高，細(xì)胞獲得率較低，如小鼠血管較細(xì)針管容易扎破，導(dǎo)致灌流失??；灌流速度的把握不當(dāng)容易造成肝細(xì)胞的損傷；灌流過程中的操作不當(dāng)容易引起細(xì)胞污染等，這些因素使得小鼠原代肝細(xì)胞無法高效、穩(wěn)定的獲得。[5-7]除了小鼠原代肝細(xì)胞的分離問題，更困難的是其體外培養(yǎng)，原代肝細(xì)胞分離在體外培養(yǎng)過程中會快速地喪失其正常表型和特異性功能，并且會自發(fā)地加速凋亡，發(fā)生去分化現(xiàn)象。[8-10]因此，建立一種高效、穩(wěn)定的小鼠原代肝細(xì)胞分離和培養(yǎng)方法具有重要的科研和實際應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 材料實驗動物

6-8周齡的雄性C57BL/6小鼠，體重約25 g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，普通飼料飼養(yǎng)，實驗前24 h內(nèi)禁食。實驗主要試劑和儀器：胎牛血清(Gibico)，DMEM(Gibico)，膠原酶Ⅳ(Gibico)，青霉素/鏈霉素(索萊寶)，ITS-X(Gibico)，HGF(索萊寶)，NaCl(生工)，磷酸氫二鈉(生工)，KCl(sigma)，磷酸二氫鉀(sigma)，碳酸氫鈉(sigma)，EGTA(sigma),葡萄糖(sigma)主要儀器包括:二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo),細(xì)胞計數(shù)儀(Invitrogen)，倒置顯微鏡(OLYMPUS)

1.2 方法

1.2.1 試劑的制備

試劑名稱成份備注DHanks(1L)NaCl 8g,Na2HPO4 0.05g,KCl 0.4g,KH2PO4 0.06g,NaHCO3 0.35g,葡萄糖1g,用雙蒸水定容至1LHBSS(1L)NaCl 8g,Na2HPO4 0.05g,KCl 0.4g,KH2PO4 0.06g,MgSO4 0.098g,CaCl2 0.14g,葡萄糖1g,NaHCO3 0.35g,羥乙基哌嗪乙硫磺酸2.382g,調(diào)節(jié)PH至7.4,用雙蒸水定容至1L培養(yǎng)皿包被液明膠1g,用雙蒸水定容至1L0.4%臺盼藍(lán)溶液4g臺盼藍(lán),加雙蒸水至100mL,用濾紙過濾,4℃保存,使用時,加入PBS稀釋至0.4%PBS緩沖液8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4,加雙蒸水定容至1L灌流液0.19 g乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)溶解于1L DHanks溶液中,調(diào)節(jié)PH至7.4消化液10mg膠原酶Ⅳ溶解于50mL HBSS溶液高壓蒸汽滅菌或經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌,4℃保存?zhèn)溆?/p>

1.2.2 小鼠原代肝細(xì)胞的分離

1.2.3 小鼠原代肝細(xì)胞的活率和產(chǎn)量計算

在接種于培養(yǎng)皿前，加入適量體積的培養(yǎng)基重懸，獲得合適濃度的細(xì)胞懸液，再取少量體積的細(xì)胞懸液與0.4 %臺盼藍(lán)溶液等體積混合，室溫孵育3-5分鐘，用細(xì)胞計數(shù)板對所得小鼠原代肝細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，使用移液器將細(xì)胞/臺盼藍(lán)混合液分別滴加到蓋玻片上下兩側(cè)邊緣，在虹吸的作用下進(jìn)入蓋玻片下的計數(shù)池，然后在100倍顯微鏡下分別對8個大方格進(jìn)行計數(shù)，然后取平均值，最后通過計算得出小鼠肝細(xì)胞的活率和產(chǎn)量，計算公式為：細(xì)胞活率=無色透明細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100 %，細(xì)胞產(chǎn)量=大方格細(xì)胞數(shù)平均值×2×104×細(xì)胞懸液體積。

1.2.4 小鼠原代肝細(xì)胞的形態(tài)觀察

待小鼠原代肝細(xì)胞貼壁后，選擇不同的時間點，然后移棄培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基，用PBS多次清洗后，加入適量PBS短時間內(nèi)保持細(xì)胞活性，最后在顯微鏡下觀察肝細(xì)胞形態(tài)，并拍照。

1.2.5 小鼠原代肝細(xì)胞的糖原染色

PAS染色又稱糖原染色，能夠顯示糖原和其它多糖物資，可以用來鑒定肝細(xì)胞。將培養(yǎng)皿內(nèi)的原代肝細(xì)胞用PBS清洗后，加入95 %乙醇溶液固定，蒸餾水沖洗數(shù)次，待干；加入10 g/L的高碘酸溶液氧化10分鐘，蒸餾水沖洗數(shù)次，待干；加入雪夫染液室溫染色30分鐘，自來水沖洗3分鐘，再蒸餾水沖洗數(shù)次，然后用20 g/L甲基綠復(fù)染20分鐘，自來水沖洗，晾干，最后顯微鏡觀察拍照。

1.3 主要觀察指標(biāo)

通過倒置顯微鏡觀察小鼠原代肝細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征和鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 小鼠原代肝細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

小鼠原代肝細(xì)胞分離的具體步驟見方法1.2.1，本研究成功分離獲得原代肝細(xì)胞(見圖1)。

圖1 小鼠原代肝細(xì)胞的分離

小鼠原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)是使用含1 %胎牛血清的MCDB11：aMEM按1∶1比例混合，并添加ITS-X和HGF(終濃度10 ng/mL)的完全培養(yǎng)基。并使用提前用明膠包被的培養(yǎng)皿，37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞在培養(yǎng)4小時后待完全貼壁，棄培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗掉未貼壁細(xì)胞，添加新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，本研究成功的培養(yǎng)原代肝細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

2.2 小鼠原代肝細(xì)胞的產(chǎn)量和細(xì)胞活率

通過細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，每次實驗平均每只成年小鼠分離初步獲得的原代細(xì)胞數(shù)量約2×107個。利用臺盼藍(lán)染色后，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，幾乎所有肝細(xì)胞都對臺盼藍(lán)拒染，呈現(xiàn)無色透明狀，只有零星的幾個細(xì)胞被染成藍(lán)色，通過細(xì)胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)每次分離所獲得的小鼠原代細(xì)胞的活率均超過95%(見圖2)。

圖2 臺盼藍(lán)拒染檢測小鼠原代肝細(xì)胞存活率(×100)

2.3 小鼠原代肝細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

通過倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，分離所得的小鼠原代肝細(xì)胞在接種2 h后開始陸續(xù)的貼壁生長，此時細(xì)胞都呈現(xiàn)圓形或者橢圓形(見圖3a)。在肝細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，肝細(xì)胞完全貼壁生長，在顯微鏡下可見小鼠原代肝細(xì)胞呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，有橢圓形，多邊形，不規(guī)則三角形等，但是細(xì)胞界限明晰，胞漿透明，細(xì)胞核以單核、雙核為主，細(xì)胞核清晰可見(見圖3b)。在添加了ITS-X和HGF的特殊培養(yǎng)基中培養(yǎng)2W后，小鼠原代肝細(xì)胞如鋪路石般緊密排列，細(xì)胞依然呈不規(guī)則狀，多邊形，類圓形，細(xì)胞與細(xì)胞之間的界限明確，細(xì)胞核有單核、雙核，較好地保持了原代肝細(xì)胞的形態(tài)特征(見圖4a)，而對照組的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了改變(見圖4b)。

圖3a為小鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)2h后(×100)，b為培養(yǎng)24h后(×100)。

圖4 小鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)2W后(×200)a：實驗組，b：對照組

2.4 小鼠原代肝細(xì)胞的糖原染色

將小鼠原代肝細(xì)胞用PAS染色法染色后，在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞的胞漿內(nèi)均可見密集紫紅色糖原顆粒，而且視野內(nèi)幾乎所有細(xì)胞都被染成紫紅色，因此，分離所得肝細(xì)胞純度超過95 %(見圖5)。

圖5 糖原染色鑒定小鼠原代肝細(xì)胞的純度(×100)

3 討論

肝臟作為藥理學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)等研究的重要靶器官之一，除了在體研究外，目前已經(jīng)有了多種體外的肝臟模型可供選擇，而其中原代肝細(xì)胞被認(rèn)為是肝臟體外試驗最為簡單、有效的模型。[11]目前，小鼠原代肝細(xì)胞的分離方法主要包括：組織塊法、胰酶消化法、灌注分離法，其中最被認(rèn)可的分離方法為肝臟原位兩步酶灌流消化法。[12-15]針對肝臟原位兩步酶灌流消化法中還存在原代肝細(xì)胞產(chǎn)量和活率偏低，細(xì)胞容易污染，分離培養(yǎng)成本太高等問題，本研究通過不斷實驗，找到了相對應(yīng)的有效解決辦法。首先，本研究在實驗器械和操作臺標(biāo)準(zhǔn)消毒的基礎(chǔ)上，通過用75 %酒精給已麻醉的小鼠充分消毒，然后在打開腹腔前將小鼠的皮膚固定在遠(yuǎn)離腹部的位置，有效地減少了原代肝細(xì)胞在分離過程中的污染。其次，在提高原代肝細(xì)胞的獲得率和存活率方面，本研究通過改變消化液的膠原酶Ⅳ濃度、消化液的灌流速度和時間、細(xì)胞的離心速度和時間等，在確定了消化液的膠原酶Ⅳ的濃度為0.2 %，灌流速度為5 mL/分鐘，灌流時間為10分鐘，細(xì)胞分離后選擇低速離心，50 g離心5分鐘后，主要是通過盡量減少分離過程中對原代細(xì)胞的損傷，最終平均每只成年小鼠能夠分離得到約2×107個原代肝細(xì)胞，并且細(xì)胞存活率達(dá)95 %以上。由于分離培養(yǎng)成本太高限制了小鼠原代肝細(xì)胞的應(yīng)用，本研究通過優(yōu)化，將培養(yǎng)基中胎牛血清的濃度由10 %減少至1 %，發(fā)現(xiàn)小鼠原代肝細(xì)胞依然可以達(dá)到良好的貼壁和培養(yǎng)效果，生長速度也無明顯差異，這樣有效的減少了分離培養(yǎng)過程中的主要成本，更有利于原代肝細(xì)胞的推廣使用。

原代肝細(xì)胞雖然是肝臟研究有效的體外模型，但是其離體培養(yǎng)是一個難題。[15-16]研究發(fā)現(xiàn)，原代肝細(xì)胞在經(jīng)過酶的消化變成離體的單細(xì)胞后，會自發(fā)的加速凋亡，并且會發(fā)生去分化現(xiàn)象。[17-19]因此，通過改變培養(yǎng)基成分來提高小鼠原代肝細(xì)胞在培養(yǎng)中的成活率和成活時間，是原代肝細(xì)胞培養(yǎng)的重要考慮因素。[20-22]本研究在前期干細(xì)胞培養(yǎng)研究中受到啟發(fā)，嘗試在小鼠原代培養(yǎng)基中添加ITS-X和HGF兩種成分，測試了多種濃度，最終發(fā)現(xiàn)添加ITS-X和HGF(終濃度10 ng/mL)可以促使小鼠原代肝細(xì)胞有效地延長保持肝細(xì)胞的特殊形態(tài)和功能的時間。

綜上所述，本研究優(yōu)化了肝臟原位2步酶灌流消化法后，成功建立了一種高效、穩(wěn)定的小鼠原代肝細(xì)胞分離和培養(yǎng)方法，有效的提高了原代肝細(xì)胞的獲得率和存活率，并延長了原代肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)時間，為肝臟的體外研究提供了技術(shù)支持。