查孝柱，謝曉梅，查光圣，曹 富，徐 源，查嬌嬌，檀 嘯

(1.安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 藥學(xué)院，安徽 安慶 246052；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230031；3.安徽光盛農(nóng)業(yè)股份有限公司，安徽 安慶 246632)

宣木瓜始載于《名醫(yī)別錄》，為常用中藥，具有平肝舒筋、和胃化濕的功效?！吨腥A人民共和國藥典》規(guī)定為薔薇科植物貼梗海棠(Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai)的干燥近成燙果實(shí)。[1]宣木瓜與寧夏枸杞、川杜仲、藏紅花并列為我國的四大名藥，具有很高的藥用價(jià)值。[2]近年來，安徽醫(yī)科大學(xué)、安徽中醫(yī)學(xué)院、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)等相關(guān)學(xué)者在宣木瓜的種質(zhì)資源、本草考證、化學(xué)組成、質(zhì)量評價(jià)分析和現(xiàn)代藥理學(xué)等方面進(jìn)行了較為深入的研究和探索;[3-18]但有關(guān)宣木瓜藥材燙曬加工方面的研究報(bào)道甚少。

木瓜一般在夏、秋二季果實(shí)綠黃時(shí)采收，藥典規(guī)定加工方法是“置沸水中燙至外皮灰白色，對半縱剖，曬干”(俗稱燙曬法)。我們調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前木瓜的產(chǎn)地加工方法主要有生曬法與燙曬法兩種，前者指將木瓜縱剖后直接曬干，后者則指經(jīng)沸水燙透后再曬干，一般認(rèn)為，燙曬法干燥時(shí)間較生曬法略短，但是在一周內(nèi)遇到陰雨天則更容易霉?fàn)€。實(shí)際上，隨宣木瓜產(chǎn)量增大，燙曬法因消耗大量薪柴而被藥農(nóng)漸漸停用，主要采用生曬法，與藥典要求不相符合。宣木瓜采收加工時(shí)值梅雨天，在曬干過程中常遭遇陰雨天氣導(dǎo)致藥材霉?fàn)€蟲蛀，藥農(nóng)遇此情況則改用烘干法；當(dāng)?shù)赜衅髽I(yè)在產(chǎn)地收購宣木瓜鮮品進(jìn)行集中人工控制條件加工，但存在加工工藝不一致，加工過程質(zhì)量監(jiān)控薄弱，工藝參數(shù)缺乏科學(xué)資料支撐等現(xiàn)象。

針對宣木瓜目前產(chǎn)地加工狀態(tài)和存在的問題，本課題組將研究生曬法對藥材質(zhì)量的影響，通過與燙曬法的藥材進(jìn)行質(zhì)量比較，探索人工控制條件的加工技術(shù)和最佳工藝，力求推出不受不良天氣影響，人工控制條件下的適宜加工方法；依據(jù)《中國藥典》和木瓜物質(zhì)組成、性質(zhì)等，增加過程控制和質(zhì)量評價(jià)。該研究將對闡明木瓜傳統(tǒng)加工方法的原理、建立宣木瓜藥材規(guī)范統(tǒng)一、科學(xué)合理的加工方法、對提高宣木瓜藥材質(zhì)量、促進(jìn)宣木瓜加工產(chǎn)業(yè)化、保障宣木瓜在中醫(yī)臨床應(yīng)用中的穩(wěn)定、安全及出色療效的發(fā)揮，對保護(hù)宣木瓜資源、傳承藥用最佳的美譽(yù)，提升宣木瓜的品牌效應(yīng)和市場競爭力等有著重要意義和實(shí)用價(jià)值。宣木瓜主要有效成分是山楂酸、齊墩果酸和熊果酸,[4-20]針對主要有效成分進(jìn)行工藝優(yōu)化才有重要的科學(xué)意義。

1 儀器與材料

儀器：安捷倫LC-1260 HPLC色譜分析儀，德國賽多利斯公司十萬分之一的BP211D電子天平；昆山市超聲儀器有限公司的KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器。

材料：山楂酸對照品(批號(hào)：141201)、齊墩果酸對照品(批號(hào)：140824)、熊果酸對照品(批號(hào)：141118)，分析純甲醇(上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司)，超純水，冰醋酸(上海潤捷化學(xué)試劑有限公司)，三乙胺(江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司)，色譜純甲醇(歐普森)。

2 方法

2.1 藥材收集

宣木瓜藥材采自安徽省宣城市宣州區(qū)新田鎮(zhèn)道地產(chǎn)區(qū)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院彭華勝教授鑒定為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai的果實(shí)。

2.2 不同加工方法制備樣品

2.2.1 燙曬法

將新鮮宣木瓜入沸水中燙2～3 min，撈出，縱剖，先將切面向上曬數(shù)日，再翻過來曬，日曬夜露直至?xí)窀?，編?hào)為A。將新鮮宣木瓜入沸水中燙2～3 min，撈出，縱剖，切片，曬法同燙曬法，編號(hào)為G。

2.2.2 生曬法

將新鮮宣木瓜縱剖后，曬法同燙曬法，編號(hào)為B。將新鮮宣木瓜縱剖，切片，曬法同燙曬法，編號(hào)為E。

2.2.3 烘干法

將新鮮宣木瓜入沸水中燙2～3 min，撈出，縱剖，切片，在60℃烘48 h至烘干，編號(hào)為C。將新鮮宣木瓜入沸水中燙2～3 min，撈出，縱剖，在60℃烘48 h至烘干，編號(hào)為D。將新鮮宣木瓜入沸水中燙2～3 min，撈出，縱剖，在60℃烘48 h至烘干，蒸汽蒸15 min，切片，再在在60℃烘48 h至烘干，編號(hào)為H。將新鮮宣木瓜入沸水中燙2～3 min，撈出，縱剖，在60℃烘48 h至烘干，潤48 h，切片，再在60℃烘48 h至烘干，編號(hào)為I。將新鮮宣木瓜直接切片100℃干燥20 min，然后60℃干燥48 h，編號(hào)為F。

2.3 山楂酸、齊墩果酸和熊果酸含量測定

2.3.1 色譜條件

Shim-pack CLC-ODS(M)色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇-水-冰醋酸-三乙胺的比為265∶35∶0.1∶0.05；檢測波長是210納米；流速：0.6毫升每分鐘；柱溫：20度；進(jìn)樣量20微升；理論塔板數(shù)在15000以上。[1,19]

2.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取山楂酸對照品0.06 mg、齊墩果酸對照品1.78 mg和熊果酸對照品0.83 mg，加甲醇定容至10 mL。

2.3.3 供試品溶液的制備

取宣木瓜細(xì)粉(過6號(hào)篩)約0.5 g，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞。超聲處理(功率250 W，頻率40k Hz)15 min，搖勻，放冷，過濾上清液，即得。色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品色譜圖及宣木瓜飲片色譜圖

2.3.4 線性關(guān)系考察

取山楂酸、齊墩果酸、熊果酸混合對照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，依次進(jìn)樣0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0以及10.0 μL，測定對照品吸收峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：山楂酸Y=0.47 178X-2.346 1，r=0.9999、齊墩果酸Y=0.472178X-2.3471，r=0.9999；熊果酸Y=0.58128X-3.04，r=0.9999。表明山楂酸在0.0510～5.749 μg、齊墩果酸在0.0701～5.953μg和熊果酸在0.0802～5.839 μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積積分值線性關(guān)系好。

2.3.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果山楂酸峰面積RSD=1.36%齊墩果酸峰面積RSD=1.30%，熊果酸峰面積RSD=1.59 %，表明精密度好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一份樣品(A)粉末6份，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣測定，結(jié)果山楂酸峰面積RSD=2.31 %，齊墩果酸峰面積RSD=2.47 %和熊果酸峰面積RSD=2.05 %，表明重復(fù)性好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液(A),在0、4 h、12 h、24 h、36 h、48 h進(jìn)樣測定，結(jié)果山楂酸峰面積RSD=1.34 %，齊墩果酸峰面積RSD=1.67 %，熊果酸峰面積RSD=1.82 %，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的宣木瓜樣品(A)粉末5份，每份約0.25 g，分別按1∶1質(zhì)量水平加入山楂酸、齊墩果酸和熊果酸對照品，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并進(jìn)行測定，計(jì)算加樣回收率。山楂酸加樣回收率為99.98 %，RSD=2.95 %；齊墩果酸加樣回收率為99.89 %，RSD=2.79 %；熊果酸加樣回收率為100.00 %，RSD=2.78 %。表明本方法準(zhǔn)確度好。

3 結(jié)果

分別取不同樣品進(jìn)行樣品含量測定，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備并進(jìn)行測定。結(jié)果見表1。從表中提示：宣木瓜山楂酸含量最高是烘干法，達(dá)到0.0079；宣木瓜齊墩果酸含量最高是燙曬法，達(dá)到0.5259；宣木瓜熊果酸含量最高是烘干法，達(dá)到0.291；宣木瓜總?cè)扑岷孔罡呤菭C曬法，達(dá)到0.7926。在不同的宣木瓜產(chǎn)地加工方法中，山楂酸含量變化范圍為0.0071-0.0078，相差0.0007；齊墩果酸含量變化范圍0.2997-0.5259，相差0.2262；熊果酸含量變化范圍0.1857-0.291，相差0.1053；總?cè)扑岷孔兓秶?.5801-0.7926，相差0.2125。提示宣木瓜產(chǎn)地加工方法對齊墩果酸影響最大，對山楂酸影響較小。

表1 不同宣木瓜加工方法三萜酸含量

4 討論

4.1 色譜條件的建立

采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱 Shim-pack CLC-ODS(M)(4.6 mm×250 mm，5 μm)，考察甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-水系統(tǒng)，并在流動(dòng)相中加入磷酸、氫氟酸、冰乙酸和三乙胺酸堿性調(diào)節(jié)試劑。不同木瓜加工樣品在流動(dòng)性為甲醇-水-冰乙酸-三乙胺(265∶35∶0.1∶0.05)中山楂酸、齊墩果酸和熊果酸之間以及它們與共存組分之間分離度均能達(dá)到1.5以上。通過二極管陣列檢測器在205～220 nm波長范圍檢測山楂酸、齊墩果酸和熊果酸的峰面積，以210 nm處有高的檢測響應(yīng)和低噪音干擾，所以確定檢測波長為210 nm。考察20～40℃柱溫下分離組分的色譜分離情況，發(fā)現(xiàn)20℃柱溫有很好的分離效果。在所建立的色譜條件下，山楂酸、齊墩果酸和熊果酸之間分離度均較好(R>1.60)，與相鄰組分色譜峰分離度也達(dá)到規(guī)定要求；山楂酸、齊墩果酸和熊果酸的保留時(shí)間分別為18.4 min、35.8 min和37.7 min。

4.2 供試品溶液的制備

考察了甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯和乙醚提取溶劑，結(jié)果表明甲醇和乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)山楂酸、齊墩果酸和熊果酸提取效率較高；從經(jīng)濟(jì)考慮，本實(shí)驗(yàn)采用甲醇為提取溶劑，并對溶劑用量進(jìn)行試驗(yàn)。考察提取溶劑體積(mL)與藥材質(zhì)量(g)比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1和50∶1進(jìn)行試驗(yàn)，確定加甲醇體積為25 mL?？疾炝思訜峄亓鳌⒊R界萃取、索氏提取、超聲與浸漬5種不同提取方式，結(jié)果表明超聲的提取率較高，本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取方式；并對超聲時(shí)間10 min、15 min、20 min、25 min和30 min進(jìn)行考察，結(jié)果表明：超聲時(shí)間對宣木瓜中山楂酸、齊墩果酸和熊果酸的提取率有明顯改變，本實(shí)驗(yàn)采用功率為250 W、頻率為40k Hz超聲處理15 min。

4.3 不同加工方法宣木瓜樣品山楂酸、齊墩果酸與熊果酸的特征性檢測

考察不同加工方法的宣木瓜山楂酸、齊墩果酸與熊果酸的分離檢測中發(fā)現(xiàn)，所用的十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱需要考慮C18色譜柱的填料的粒徑和色譜柱的柱長。考察了填料5 μm粒徑Shim-pack CLC-ODS(M)柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、大連依利特Hypersil ODS2柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Lab Instrument CO，LTD Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Welch Materials Ultimate XB C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、GL Sciences Inc.Inertsil ODS-SP柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Grace Apollo C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Welch Materials，Inc.Welch Materials Ultimate XB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Shim-pack VP-ODS柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)和填料3 μm粒徑Y(jié)MC-Pack Pro C18柱(4.6 mm×150 mm，3 μm)等色譜柱結(jié)果顯示，山楂酸、齊墩果酸和熊果酸在填料5 μm粒徑的C18柱、250 mm的柱長和20℃的柱溫能達(dá)到好的分離效果。在建立的色譜條件下，不同產(chǎn)地加工方法的宣木瓜樣品中的山楂酸、齊墩果酸和熊果酸之間分離度均較好(R>1.60)，與相鄰組分色譜峰分離度也達(dá)到中國藥典規(guī)定要求。

5 結(jié)論

(1)本研究建立了山楂酸、齊墩果酸和熊果酸的宣木瓜含量高效液相色譜方法，可以擴(kuò)大到含有山楂酸、齊墩果酸和熊果酸的中藥材、中藥飲片和中成藥。

(2)本研究以山楂酸、齊墩果酸和熊果酸的含量為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)了燙曬、生曬和直接烘干3個(gè)的不同產(chǎn)地加工方法，對宣木瓜的加工方法進(jìn)行了考察，研究在不同干燥方法下宣木瓜山楂酸、齊墩果酸和熊果酸的含量上的規(guī)律，結(jié)果顯示，燙曬法在三萜酸含量上均高于生曬法，這與朱晨晨[9]碩士論文相符；表明藥典規(guī)定的傳統(tǒng)加工方法燙曬法是自然條件下優(yōu)選宣木瓜干燥的科學(xué)方法，也提示了宣木瓜傳統(tǒng)加工燙曬法的科學(xué)內(nèi)涵。宣木瓜不同產(chǎn)地加工方法對其中山楂酸、齊墩果酸、熊果酸的含量有顯著影響，宣木瓜藥材經(jīng)果燙、曬、蒸、烘等加工處理，可以提高山楂酸、齊墩果酸和熊果酸的總含量，但是其中山楂酸含量變化不大而齊墩果酸和熊果酸含量變化很顯著，進(jìn)一步證明了山楂酸、齊墩果酸和熊果酸對熱的穩(wěn)定性，提示了宣木瓜藥材燙曬法的產(chǎn)地加工方法的科學(xué)性。與王曉閣[20]研究不同產(chǎn)地加工法對宣木瓜藥材中齊墩果酸和熊果酸的熱穩(wěn)定性一致。

(3)生曬法中切半曬在三萜酸上均高于生曬法中切片曬燙曬法中切半均高于燙曬法中切片。在新鮮木瓜切制成飲片的方法中，在三萜酸含量上，燙曬后烘48 h用水潤48 h再在60℃烘48 h的方法比燙曬后烘48 h用蒸汽蒸15 min再在60℃烘48 h方法主要化學(xué)成分含量高。結(jié)果表明最佳干燥成藥材的方法是燙曬，其主要有效化學(xué)成分山楂酸、齊墩果酸和熊果酸分別是0.0076、0.5259和0.2571，總?cè)扑釣?.7926；發(fā)現(xiàn)最佳干燥成飲片的方法為燙曬后烘48 h用水潤48 h再在60℃烘48 h的方法，其主要有效化學(xué)成分含量高，山楂酸、齊墩果酸和熊果酸分別是0.0071、0.4425和0.291，總?cè)扑釣?.7406。