*基金項(xiàng)目：安徽省教育廳高校自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2020A0445）

第一作者簡介：李晶晶（1997-），女，在讀碩士研究生，研究方向：中醫(yī)藥防治脾胃病。

△通信作者：王睿，E-mail：dsf221@163.com

摘要：目的" 運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探討馬齒莧-地錦草藥對治療潰瘍性結(jié)腸炎（UC）作用機(jī)制。方法" 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取馬齒莧-地錦草的有效活性成分，利用Uniprot3.7.2數(shù)據(jù)庫預(yù)測活性成分作用靶點(diǎn)，通過Gene-Cards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫獲取疾病基因，將藥物與疾病基因取交集后利用STRING數(shù)據(jù)庫研究二者相關(guān)性，并根據(jù)結(jié)果分析其潛在作用機(jī)制。結(jié)果" 經(jīng)過篩選得到目標(biāo)藥對關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白61個(gè)和分子信號通路169條，基因本體（GO）功能富集分析顯示主要有炎癥反應(yīng)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、脂多糖的細(xì)胞反應(yīng)等生物過程；京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析顯示馬齒莧-地錦草治療UC主要通過腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、核因子κB信號通路、Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路等發(fā)揮作用。結(jié)論" 馬齒莧-地錦草藥對治療UC具有多靶點(diǎn)、通路復(fù)雜、層次分明的特點(diǎn)，馬齒莧-地錦草潛在作用機(jī)制為日后臨床治療UC提供理論依據(jù)，并拓展了臨床運(yùn)用中醫(yī)藥治療UC的思路。

關(guān)鍵詞：馬齒莧-地錦草藥對；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；潰瘍性結(jié)腸炎；信號通路；作用機(jī)制

中圖分類號：R516.1""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號：1007-2349（2024）04-0058-08

Analysis of the Action Mechanism of Portulacae-Quinquefolia Pairs in theTreatment of Ulcerative Colitis by Network Pharmacology

LI Jing-jing1， WANG Rui2， CHA An-sheng2， LI Yi-fang3， WANG Fang1， HU Zi-zhao1

（1. Anhui University of Traditional Chinese Medicine， Hefei 230038， China; 2. The First Affiliated Hospital of Anhui University of Tradition Chinese Medicine， Hefei 230032， China; 3. School of Nursing， Anhui University of Traditional Chinese Medicine， Hefei 230022， China）

【Abstract】Objective： To explore the action mechanism of Portulaca-Quinquefolia pairs in the treatment of ulcerative colitis （UC） by network pharmacology. Methods： The active ingredients of Portulaca and Quinquefolia were obtained through TCMSP database， the target of active ingredients was predicted by using Uniprot3.7.2 database， and disease genes were obtained through Gene-Cards database and OMIM database. After the intersection of herbs and disease genes， the correlation between them was studied by using STRING database. The potential mechanism of action was analyzed according to the results. Results： After screening， 61 key target proteins and 169 molecular signaling pathways were obtained. Gene ontology （GO） functional enrichment analysis showed that the main biological processes were inflammation， negative regulation of apoptosis and cell reaction of lipopolysaccharide. The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） enrichment analysis showed that Portulaca-Quinquefolia pairs played its role in the UC treatment mainly through tumor necrosis factor （TNF） signaling pathway， nuclear factor κB signaling pathway， toll-like receptor signaling pathway and NOD-like receptor signaling pathway. Conclusion： Portulaca-Quinquefolia pairs have the characteristics of multiple targets， complex pathways and distinct layers in the treatment of UC patients. The potential action mechanism of Portulaca-Quinquefolia pairs provides a theoretical basis for the future clinical treatment of UC， and expands the clinical application of TCM in the treatment of UC.

【Key words】Portulaca-Quinquefolia Pairs; Network Pharmacology; Ulcerative Colitis; Signal Pathway; Action Mechanism

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerativecolitis，UC）是一種慢性非特異性炎癥性腸病，在不同程度上引起結(jié)、直腸黏膜及黏膜下層的連續(xù)性、融合性炎癥反應(yīng)。其特點(diǎn)是遷延難愈且反復(fù)發(fā)作，隨著病程延長，UC患者結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)隨之增加［1］。UC具體發(fā)病機(jī)制尚未明確，但現(xiàn)代研究已證實(shí)，環(huán)境、基因、腸道微生物及自身免疫等因素參與UC的發(fā)病過程［2］。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療UC主要采取對癥治療，雖短時(shí)間內(nèi)緩解率高，但隨著治療方法的臨床研究不斷加深，越來越多的問題被提出如生物制劑治療周期的長度與限度、預(yù)后效果及不同藥物的適用情況和不良反應(yīng)等仍有待解決［3］。

中醫(yī)將UC歸屬于“久痢”“腸澼”“泄瀉”“便血”等范疇。其病機(jī)以脾虛為本，濕熱瘀毒蘊(yùn)結(jié)腸道為標(biāo)，治療上應(yīng)遵循“發(fā)時(shí)指標(biāo)，平時(shí)治本”的原則，以健脾化濕，活血化瘀為基本大法。地馬煎劑為安徽省中醫(yī)院治療UC院內(nèi)方，具有健脾化濕、活血解毒之效。相關(guān)研究已證實(shí)地馬煎劑灌腸治療UC 可有效對抗氧化應(yīng)激，改善炎癥反應(yīng)［4］。其中馬齒莧、地錦草是方中主要藥對，中醫(yī)認(rèn)為二者均可清熱解毒，涼血止血止痢。相關(guān)研究表明馬齒莧、地錦草具有抗炎、抗氧化，免疫調(diào)節(jié)的作用，促進(jìn)損傷修復(fù)，改善患者結(jié)腸黏膜微循環(huán)，減輕UC癥狀［5-7］。二者配伍治療UC活動(dòng)期效果顯著，但關(guān)于馬齒莧-地錦草配伍治療UC具體作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究希望通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)一步探討分析馬齒莧-地錦草藥對治療UC的作用機(jī)制，為臨床用藥和研究提供參考依據(jù)。

1" 資料與方法

1.1" 馬齒莧-地錦草藥對的成分信息篩選及匯總" 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology And Analysis Plat-form，TCMSP），收集馬齒莧、地錦草主要化學(xué)成分，設(shè)定口服生物利用度（OB≥30％）、類藥性（DL≥0.18），篩選藥對符合條件的活性成分與相關(guān)靶點(diǎn)信息。

1.2" 活性成分作用靶點(diǎn)的獲取及收集" 將整理出的“馬齒莧-地錦草”藥物活性成分作用靶點(diǎn)信息，輸入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫，設(shè)定來源物種為“human”，整理出相關(guān)基因數(shù)據(jù)，獲得活性成分作用靶點(diǎn)。然后利用Cytoscape 3.9.1 軟件將活性成分與靶點(diǎn)進(jìn)行可視化分析。

1.3" 潰瘍性結(jié)腸炎關(guān)鍵靶點(diǎn)的收集" 運(yùn)用Gene-Cards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫獲取UC相關(guān)疾病靶點(diǎn)，然后將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫所得靶點(diǎn)數(shù)據(jù)去重整合。

1.4" “化合物-靶點(diǎn)-疾病”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建" 利用Venny 2.1.0軟件獲取藥物與疾病分別對應(yīng)的靶點(diǎn)的重合部分，即可得出藥物治療UC的關(guān)鍵靶點(diǎn)數(shù)據(jù)。

1.5" 構(gòu)建關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)" 利用STRING在線數(shù)據(jù)庫平臺，搜索藥對得到其治療UC的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白互作（PPI）關(guān)系，然后將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape中進(jìn)行可視化分析，并繪制與之相應(yīng)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6" 關(guān)鍵靶點(diǎn)生物過程及通路分析" 通過DAVID數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵靶點(diǎn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，從中獲取關(guān)鍵靶點(diǎn)的生物學(xué)信息，并分析其作用機(jī)制。

2" 結(jié)果

2.1" 馬齒莧藥對-地錦草的活性成分信息" 通過搜索TCMSP數(shù)據(jù)庫得到馬齒莧、地錦草化學(xué)成分分別為54個(gè)、38個(gè)。設(shè)定OB≥30%且DL≥0.18，篩選出馬齒莧、地錦草的潛在有效活性成分10個(gè)、12個(gè)，去重后共20個(gè)。見表1。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取馬齒莧、地錦草的活性成分作用靶點(diǎn)分別為394個(gè)、255個(gè)，將活性成分的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot，篩選出符合人類相關(guān)并已證實(shí)的基因，經(jīng)過去重后共得到330個(gè)靶點(diǎn)對應(yīng)基因。

2.2" “活性成分-靶點(diǎn)” 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析" 將馬齒莧、地錦草的有效活性成分進(jìn)行編號，發(fā)現(xiàn)二者共同有效活性成分兩個(gè)，即圖2中所示 A1、A2，分別代表kaempferol、quercetin。將19個(gè)二者有效活性成分及365個(gè)成分靶點(diǎn)對應(yīng)基因?qū)隒ytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)及可視化分析，見圖1。

2.3" 潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選" 通過Gene-Card平臺收集疾病相關(guān)靶點(diǎn)5139個(gè)，篩選符合Relevance score≥7.38的靶點(diǎn)323個(gè)；利用OMIM數(shù)據(jù)庫收集UC相關(guān)靶點(diǎn)基因531個(gè)，將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫結(jié)果去重，最終得到784個(gè)。

2.4" “藥物靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)” 的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析" 利用Venny 2.1.0軟件將相對應(yīng)的365個(gè)藥物靶點(diǎn)與784個(gè)疾病靶點(diǎn)取交集后得到61個(gè)共同靶點(diǎn)基因。見圖2。關(guān)鍵靶點(diǎn)具體為：PTGS1、PTGS2、RELA、CCND1、EGF、PPARG、TNFRSF1A、PLA2G4A、PTEN、SELP、TNFRSF1B、AKT1、VEGFA、BCL2、MMP2、CASP8、MMP1、HMOX1、CYP3A4、CTNNB1、F3、PIK3CG、BAX、NOS2、IKBKB、TNF、XDH、STAT1、ICAM1、SELE、VCAM1、GSTP1、EGFR、CDKN1A、MMP9、IL10、IL6、TP53、ERBB2、IL2、IFNG、IL4、CD40LG、MET、MMP3、IL1B、CCL2、CXCL8、DUOX2、SERPINE1、IL1A、MPO、NCF1、CHEK2、CLDN4、CRP、CXCL10、SPP1、IGF2、ALB、F2。

2.5" “馬齒莧-地錦草”治療UC的PPI網(wǎng)絡(luò)分析" 利用STRING數(shù)據(jù)庫平臺得到上述61個(gè)藥物-疾病靶點(diǎn)蛋白互作圖。見圖3。將置信度設(shè)置為大于0.4，然后將得到的61個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件行可視化分析，并繪制網(wǎng)絡(luò)圖。見圖4。其中排名前10位的關(guān)鍵靶點(diǎn)為：TNF、AKT1、IL6、PTGS2、VEGFA、ALB、IL1B、CCL2、TP53、CXCL8。

2.6" 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO富集分析" 對關(guān)鍵靶點(diǎn)基因在DAVID網(wǎng)站中進(jìn)行GO富集分析共獲得559個(gè)。其中生物過程463個(gè)、細(xì)胞組分38個(gè)、分子功能58個(gè)，分別選取前10個(gè)。結(jié)果見圖5。主要涉及炎癥反應(yīng)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、脂多糖的細(xì)胞反應(yīng)、基因表達(dá)的正調(diào)控、蛋白磷酸化的正調(diào)控、對藥物的反應(yīng)、細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)、凋亡過程的正向調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，DNA模板正調(diào)控等。

圖5" 關(guān)鍵靶點(diǎn)富集分析

2.7" KEGG通路分析" 將關(guān)鍵靶點(diǎn)基因在DAVID網(wǎng)站中行KEGG通路分析。得到Plt;0.05靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)的通路有168條，其中主要發(fā)揮作用的通路有：癌癥通路、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、核因子κB信號通路、Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、炎癥性腸病信號通路等。如圖6。

3" 討論

現(xiàn)代研究表明中草藥以多成分多靶點(diǎn)共同發(fā)揮作用、不良反應(yīng)少，可作為補(bǔ)充和替代療法治療UC［8-9］。本研究通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)篩選，得到馬齒莧-地錦草藥對潛在活性成分共22個(gè)，共同活性成分為槲皮素和山奈酚，二者均具有抗炎、抗氧化等生物活性。其中，山奈酚可有效減少機(jī)體炎性因子的合成與釋放，增強(qiáng)抗炎因子的轉(zhuǎn)錄活性，維持腸黏膜機(jī)械屏障的完整［10-11］。槲皮素是一種與山奈酚相關(guān)的黃烷醇，其發(fā)揮作用改善結(jié)腸炎癥損傷主要藥理作用表現(xiàn)在抗炎，抗氧化和止血［12］。

馬齒莧-地錦草的藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)去重整合后得到61個(gè)靶點(diǎn)基因。這些關(guān)鍵靶點(diǎn)在UC治療過程中的作用如下：IL-6與TNF均可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞活化參與調(diào)控腸道局部炎癥反應(yīng)。TNF具有抗感染、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)細(xì)胞增殖分化等積極作用，但TNF水平顯著升高時(shí)，可與多種細(xì)胞因子共同發(fā)揮作用，誘導(dǎo)機(jī)體炎癥介質(zhì)的釋放，引起炎癥反應(yīng)［13］。相關(guān)研究表明，IL-6過度表達(dá)可誘導(dǎo)局部炎性病變［14］。由此得出，UC病變的嚴(yán)重程度與TNF與IL-6表達(dá)水平呈正相關(guān)。此外，研究發(fā)現(xiàn)IL-6可能與結(jié)腸癌發(fā)病有關(guān)，IL-6的濃度可反映腫瘤大小、是否轉(zhuǎn)移及生存率［15］。研究表明受巨噬細(xì)胞中的炎癥介質(zhì)刺激，PTGS2可動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)急性期炎癥的發(fā)生與發(fā)展，與炎癥調(diào)控、細(xì)胞凋亡及組織損傷有關(guān)［16］。由此得出PTGS2、IL-6及TNF等炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因，是通過抗炎作用和免疫調(diào)控來達(dá)到治療UC的目的。

隨后對61個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因進(jìn)行KEGG通路分析得到168條通路。其中NOD樣受體信號通路是免疫細(xì)胞識別病原體，主要通過介導(dǎo)NF-κB通路、MAPK通路和自噬通路參與抗菌免疫應(yīng)答。此外，NOD樣受體還有獨(dú)特的與適應(yīng)性免疫應(yīng)答的連接通路，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起作用［17-18］。Toll樣受體信號通路失調(diào)可誘導(dǎo)慢性炎癥及腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，其異常激活又可導(dǎo)致NF-κB信號通路的激活和TNF、IL-6等炎癥介質(zhì)的過度表達(dá)，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)的發(fā)生［19］。研究發(fā)現(xiàn)通過NF-κB信號通路發(fā)揮對UC炎癥修復(fù)，是通過抑制其磷酸化和乙酰化［20］。綜上，馬齒莧-地錦草藥對改善UC炎癥損傷主要是通過抗炎和免疫調(diào)節(jié)。

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（收稿日期：2023-05-17）