唐永濤， 汪 晨,， 成永旭， 孫云飛，趙良杰， 錢 晨， 楊穎飛

(1. 上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部稻漁綜合種養(yǎng)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；2. 信陽農(nóng)林學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，河南 信陽 464000；3. 山東景明海洋科技有限公司，山東 東營 257000)

絲狀藻廣泛存在于各種養(yǎng)殖及自然水體，不但影響了景觀、環(huán)境，而且死亡后腐爛產(chǎn)生有毒有害氣體也會對養(yǎng)殖動物或自然水域生物多樣性構(gòu)成威脅[1-4]。尤其在蝦蟹養(yǎng)殖中，絲狀藻暴發(fā)不但抑制水草的生長，而且會纏繞蝦蟹引起死亡[5]，由于目前還沒有安全有效的控制手段，養(yǎng)殖戶多選擇市面上流行的殺絲狀藻藥，而這些殺絲狀藻藥多篩選自農(nóng)用除草劑，存在較大的安全隱患，每年都出現(xiàn)一些養(yǎng)殖戶因殺絲狀藻而造成養(yǎng)殖損失的案例。

在絲狀藻生態(tài)學(xué)研究中，關(guān)于絲狀藻發(fā)生誘因的觀點(diǎn)很多，如基質(zhì)[6]、水流[7]、光照[8]、溫度[9]、營養(yǎng)鹽[10]及休眠孢子[11]等。筆者曾大量走訪江蘇、安徽的中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)池塘，發(fā)現(xiàn)在一些隸屬于同一家養(yǎng)殖戶的池塘，其環(huán)境、水源、池塘情況均基本相同，卻出現(xiàn)絲狀藻發(fā)生有無的差異現(xiàn)象。鑒于以上情況，基質(zhì)、水流、溫度、光照的因素基本可以排除。事實(shí)上，關(guān)于絲狀藻的發(fā)生，多數(shù)的觀點(diǎn)認(rèn)為水體氮磷等營養(yǎng)鹽的增加是主要原因[12-14]。實(shí)施磷減排或控制溶解性磷措施后，安大略湖和Windermere 流域剛毛藻生物量分別降低60%[15]和90%[16]。但是，1995—2006 年，五大湖下游地區(qū)再次暴發(fā)剛毛藻水華[17]，但事實(shí)上，這個(gè)時(shí)期五大湖的近岸水域并沒有檢測到水體總磷水平有增加趨勢[10]。由此可見，決定剛毛藻生物量高低的因素可能不僅限于營養(yǎng)鹽的多寡。許多絲狀藻類能形成孢子和配子，也即有世代交替現(xiàn)象[18-19]，而且配子或孢子在冬天或春天發(fā)生較多[18,20]。但是，目前有關(guān)外源帶入絲狀藻繁殖體引起絲狀藻發(fā)生多停留在理論推測層面，而證實(shí)這種關(guān)系的研究還很少?；谝陨显?，實(shí)驗(yàn)針對性地選擇了同一家養(yǎng)殖戶、同一片養(yǎng)殖區(qū)域的有絲狀藻塘和無絲狀藻塘，重點(diǎn)從營養(yǎng)鹽、絲狀藻繁殖體和人為操作三個(gè)方面進(jìn)行對比研究，以期找出導(dǎo)致絲狀藻發(fā)生的關(guān)鍵因素，為后續(xù)防控研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2019 年3 月5 號，選擇中華絨螯蟹養(yǎng)殖初期，在常州市金壇區(qū)，按照同一家養(yǎng)殖戶、同一塊區(qū)域位置鄰近、環(huán)境條件基本相同的原則，篩選出5 組有絲狀藻塘和無絲狀藻塘，編號1～5 組，其中有絲狀藻塘依次編號為1-1、2-1、3-1、4-1、5-1，對應(yīng)的無絲狀藻塘依次編號為1-2、2-2、3-2、4-2、5-2，對應(yīng)的水源依次編號為1-3、2-3、3-3、4-3、5-3。重點(diǎn)對比每組有絲狀藻塘、無絲狀藻塘和水源的水體、底泥營養(yǎng)鹽水平、絲狀藻繁殖體數(shù)量和人為操作三個(gè)方面。

1.2 樣品采集

每個(gè)池塘及水源按照中間位置和左右兩邊的位置共設(shè)3 個(gè)采樣點(diǎn)，采集中層水樣和表層10 cm 泥樣，采集好的樣品放于冰盒中并快速帶回實(shí)驗(yàn)室處理。

1.3 樣品測定與分析

水質(zhì)測定 pH 現(xiàn)場測定，根據(jù)《水和廢水監(jiān)測與分析方法》第4 版，采回的水樣用堿性過硫酸鉀消解，紫外分光光度法測定總氮(TN)，采用鉬酸銨分光光度法測定總磷(TP)。按照《水質(zhì) 葉綠素a的測定 分光光度法》(HJ 897-2017)測定葉綠素a(Chl.a)含量。水樣經(jīng)過0.45 μm 濾膜抽濾，濾膜經(jīng)10 mL 90%丙酮4℃避光萃取12 h后(每4 h 搖勻1 次)，依次測定750、664、647、630 nm波長下的吸光度值，然后計(jì)算Chl.a的含量。

底泥生物可利用性氮磷測定 底泥放于玻璃培養(yǎng)皿中在室內(nèi)通風(fēng)自然晾干，充分研磨成粉末后，每個(gè)樣稱取20.0 g 放于自封袋中，寄送到蘇州夢犀生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行生物可利用性氮含量和生物可利用性磷含量的測定。底泥生物可利用性氮的測定方法：取風(fēng)干土2.0 g 于擴(kuò)散皿中，采用堿性溶液水解土壤，釋放出的NH3經(jīng)硼酸吸收后，再用標(biāo)準(zhǔn)酸滴定，然后計(jì)算土壤中速效氮的含量。底泥生物可利用性磷的測定方法：稱取0.05 g 研磨過篩的土樣，用弱堿性提取堿溶性磷和吸附態(tài)磷，后用鉬銻抗比色法測定。

絲狀藻繁殖體檢測 每個(gè)底泥樣品取約10 g，用離心管盛裝，凍存-30 ℃。取250 mL 水樣，用0.45 μm 濾膜抽濾后，將濾膜于-30 ℃凍存，并與泥樣一起用干冰冷凍寄送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行DNA 提取及后續(xù)繁殖體檢測(所用引物為，雙正向引物：A23SrVF1：GGACARAAAGACCCTATG，A23SrVF2：CARAAA GACCCTATGMAGCT 和雙逆向引物A23SrVR1：AGATCAGCCTGTTATCC，A23SrVR2：TCAGCC TGTTATCCCTAG)。重點(diǎn)關(guān)注絲狀藻的主要組成種，即水綿(Spirogyra)和剛毛藻(Cladophora)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的初步處理，用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析。P＜0.05認(rèn)為有顯著差異。

2 結(jié)果

對比5 組有絲狀藻塘和無絲狀藻塘發(fā)現(xiàn)，組1 無絲狀藻塘采用約1 500 kg/hm2的生石灰進(jìn)行了清塘，且早春初次進(jìn)水為深井水，而有絲狀藻塘則未清塘(表1)。組2 中，有無絲狀藻池塘均采用約150 kg/hm2的漂白粉進(jìn)行了清塘，其余操作也基本相同，不同的是有絲狀藻塘在養(yǎng)殖初期從外源引進(jìn)伊樂藻，暴發(fā)絲狀藻后又潑灑了硫酸銅(3.75 kg/hm2)，但絲狀藻并沒有得到明顯控制，而無絲狀藻塘未從外源引入伊樂藻。組3 中，無絲狀藻塘采用約225 kg/hm2的漂白粉進(jìn)行了清塘，而有絲狀藻塘未清塘，其余管理措施均相同。組4 中，無絲狀藻塘進(jìn)行了長時(shí)間的曬塘，并且在進(jìn)水時(shí)采用了氨基酸肥水，而有絲狀藻塘?xí)裉習(xí)r間比無絲狀藻塘短了20 d，且沒有肥水措施，其余操作相同。組5 中，有無絲狀藻塘管理操作均相同。

表1 調(diào)查池塘的重要管理操作記錄Tab. 1 Records of important management operations in the ponds investigated

各池塘水體及水源氮磷濃度對比如表2 所示，組1、組3 和組5 共三組有絲狀藻塘pH 值顯著高于無絲狀藻塘和水源(P＜0.05)，組2 有絲狀藻塘與無絲狀藻塘之間無顯著差異(P＞0.05)，組4 無絲狀藻塘顯著高于有絲狀藻塘(P＜0.05)。對于TN含量，組2 和組4 有絲狀藻塘顯著高于無絲狀藻塘和水源(P＜0.05)，組1 和組5 無絲狀藻塘顯著高于有絲狀藻塘(P＜0.05)，組3 則三組之間無顯著差異(P＞0.05)。對于TP 含量，組1、組3、組4和組5 四組的有絲狀藻塘、無絲狀藻塘和水源之間均無顯著差異(P＜0.05)，僅組2 的無絲狀藻塘顯著高于有絲狀藻塘和水源(P＜0.05)。對于Chl.a含量，組1、組2、組3 和組4 這四組的無絲狀藻塘均顯著高于有絲狀藻塘(P＜0.05)。

表2 不同池塘及水源水化學(xué)指標(biāo)Tab. 2 Water chemical indexes of different ponds and water sources

5 組有絲狀藻塘的生物可利用性氮含量為9.58～23.57 mg/kg，平均為(15.72±3.60) mg/kg；5組無絲狀藻塘的生物可利用性氮含量為9.63～15.40 mg/kg，平均為(13.22±1.97) mg/kg；5 組水源的生物可利用性氮含量為3.85～20.13 mg/kg，平均為(9.47±2.97) mg/kg (圖1)。5 組有絲狀藻塘平均可利用氮含量較無絲狀藻塘高2.50 mg/kg。組1 中有絲狀藻塘、無絲狀藻塘及水源之間生物可利用性氮含量無顯著差異(P＞0.05)。組2、組3 中，有絲狀藻塘與無絲狀藻塘之間生物可利用性氮含量均無顯著差異(P＞0.05)，且二者均顯著高于水源生物可利用性氮含量(P＜0.05)。組4 中，有絲狀藻塘生物可利用性氮含量顯著高于無絲狀藻塘(P＜0.05)，而無絲狀藻塘顯著高于水源(P＜0.05)。組5 中，有絲狀藻塘與無絲狀藻塘之間生物可利用性氮含量無顯著差異(P＞0.05)，而無絲狀藻塘顯著高于水源(P＜0.05)。

圖1 5 組池塘各底泥樣本的生物可利用性氮含量圖中不同字母代表組內(nèi)差異顯著(P＜0.05)，下同。Fig. 1 Bioavailable nitrogen content of sediment samples from 5 groups of ponds In the figure, different letters in the same group represent significant differences (P＜0.05); the same below.

5 組有絲狀藻塘的生物可利用性磷含量為36.32～103.65 mg/kg，平均為(72.26±10.57) mg/kg。5 組無絲狀藻塘的生物可利用性磷含量為29.55～70.32 mg/kg，平均為(50.33±12.62) mg/kg。5 組水源的生物可利用性磷含量為4.55～122.20 mg/kg，平均為(51.13±31.89) mg/kg (圖2)。5 組有絲狀藻塘平均生物可利用性磷含量較無絲狀藻塘高21.93 mg/kg。組1 中，有絲狀藻塘、無絲狀藻塘及水源之間生物可利用性磷含量無顯著差異(P＞0.05)。組2 和組3 中，有絲狀藻塘與無絲狀藻塘之間生物可利用性磷含量無顯著差異(P＞0.05)，但二者均顯著高于水源(P＜0.05)。組4 和組5 中有絲狀藻塘生物可利用性磷含量均顯著高于無絲狀藻塘(P＜0.05)，而無絲狀藻塘與水源之間無顯著差異(P＞0.05)。

圖2 5 組池塘各底泥樣本的生物可利用性磷含量Fig. 2 Bioavailable phosphorus content of sediment samples from 5 groups of ponds

為了進(jìn)一步探究氮磷與絲狀藻發(fā)生的關(guān)系，對各池塘及水源的底泥生物可利用性氮磷比做了分析(圖3)。由圖可知，有絲狀藻塘底泥生物可利用性氮磷比值為0.170～0.301，平均為0.230±0.058。無絲狀藻塘底泥生物可利用性氮磷比值為0.217～0.410，平均為0.290±0.059。水源底泥生物可利用性氮磷比值為0.139～0.916，變化幅度較大，平均為0.369±0.08。無絲狀藻塘底泥的生物可利用性氮磷比值較有絲狀藻塘高0.060。另外，有絲狀藻塘和無絲狀藻塘的生物可利用性氮磷比曲線走勢相似，且無絲狀藻塘底泥生物可利用性氮磷比值在5 組中均高于有絲狀藻塘，組1～5 分別高0.071、0.047、0.025、0.116、0.039，占對應(yīng)有絲狀藻塘的生物可利用性氮磷比值分別為34.98%、27.65%、8.31%、39.46%、21.20%，平均為26.32%。

圖3 5 組池塘各底泥樣本的生物可利用性氮磷比Fig. 3 Bioavailable N/P ratios of sediment samples from 5 groups of ponds

本次調(diào)查中，各組樣本檢測到的主要真核生物屬如圖4 (水體)和圖5 (底泥)所示。其中在水體和底泥中共檢測到5 個(gè)水綿屬，分別為Spirogyra_sp._1_AS-2014、Spirogyra_sp._4_AS-2014、Spirogyra_sp._5_AS-2014、Spirogyra_sp._9_AS-2014、Spirogyra_sp._M1843，1 個(gè)剛毛藻屬，為Cladophora_sp._JIAC-WT-filamentous_2。圖4 和 圖5 反映水綿屬和剛毛藻的OTUs 相對量極低。

圖4 5 組池塘各水樣OTUs 熱點(diǎn)圖1.未定屬；2.微擬球藻屬；3.突柄桿菌屬；4.隱藻屬；5.線蟲共生菌屬(暫定屬)；6.斜片藻屬；7.巴夫藻屬；8.衣藻屬；9.黃桿菌屬；10.柄裸藻屬；11.水綿屬；12.綠梭藻屬；13.擬小球藻屬；14.金色藻屬；15.科利氏藻屬；16.四豆藻屬；17.鐮刀菌屬；18.魚鱗藻屬；19.粗盤藻屬；20.海鏈藻屬；21.Durinskia (多甲藻目新屬)；22.聚球藻屬；23.棲湖菌屬；24.柵列藻屬；25.全溝藻屬；26.霍奇金氏菌屬(暫定屬)；27.麥克屬；28.深海鐵桿菌屬；29.索囊藻屬；30.剛毛藻屬。Fig. 4 Heatmap of OTUs in water samples from 5 groups of ponds 1. unclassified; 2. Nannochloropsis; 3. Prosthecobacter; 4. Cryptomonas; 5. Candidatus_Xiphinematobacter; 6. Plagioselmis; 7. Pavlova; 8. Chlamydomonas; 9. Flavobacterium; 10. Colacium; 11. Spirogyra; 12. Chlorogonium; 13. Parachlorella; 14. Chrysochromulina; 15. Koliella; 16. Tetrabaena; 17.Falcomonas; 18. Mallomonas; 19. Trachydiscus; 20. Thalassiosira; 21. Durinskia; 22. Synechococcus; 23. Limnohabitans; 24. Scenedesmus; 25. Teleaulax; 26. Candidatus_Hodgkinia; 27. Mychonastes; 28. Mariprofundus; 29. Choricystis; 30. Cladophora.

圖5 5 組池塘各底泥樣本OTUs 熱點(diǎn)圖1.未定屬；2.土圈菌屬；3.微擬球藻；4.突柄桿菌屬；5.藍(lán)菌屬；6.柵列藻屬；7.小環(huán)藻屬；8.聚球藻屬；9.微胞藻屬；10.擬小球藻屬；11.無隔藻屬；12.擬單胞藻屬；13.豐佑菌屬；14.粗盤藻屬；15.線蟲共生菌屬(暫定屬)；16.擬圓孢藻屬；17.綠棒菌屬；18. Durinskia (多甲藻目新屬)；19.盤裸藻屬；20.構(gòu)屬；21.鱗孔藻屬；22.衣藻屬；23.海鏈藻屬；24.裸藻屬；25.西索恩氏菌屬；26.眉藻屬；27.扁裸藻屬；28.眼裸藻屬；29.剛毛藻屬；30.水綿屬。Fig. 5 Heatmap of OTUs in sediment samples from 5 groups of ponds 1. unclassified; 2. Pedosphaera; 3. Nannochloropsis; 4. Prosthecobacter; 5. Cyanobium; 6. Scenedesmus; 7. Cyclotella; 8. Synechococcus; 9. Microcystis; 10. Parachlorella; 11. Vaucheria; 12. Monodopsis; 13. Opitutus; 14. Trachydiscus; 15. Candidatus_Xiphinematobacter; 16. Sphaerospermopsis;17. Chlorobaculum; 18. Durinskia; 19. Discoplastis; 20. Broussonetia; 21. Lepocinclis; 22. Chlamydomonas; 23. Thalassiosira; 24. Euglena; 25. Chthoniobacter; 26. Calothrix; 27. Phacus; 28. Euglenaria; 29. Cladophora; 30. Spirogyra.

依據(jù)圖4 中的數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)了水綿屬和剛毛藻屬OTUs 在各組水體中分布的情況(圖6)。在5組15 個(gè)水樣中，共檢測到9 個(gè)樣本有水綿屬OTUs，4 個(gè)樣本有剛毛藻屬OTUs，其中在組1、組3 和組5 的有絲狀藻塘中均檢測到了剛毛藻屬和水綿屬OTUs，在組1、組2 和組4 的無絲狀藻塘也檢測到了少量的水綿屬OTUs，在組1 的水源中均檢測到了少量剛毛藻屬和水綿屬OTUs，在組2 和組5 的水源中檢測到了少量水綿屬OTUs。

圖6 5 組池塘各水樣剛毛藻和水綿OUTs 數(shù)量統(tǒng)計(jì)Fig. 6 Number of Cladophora and Spirogyra OTUs in sediment samples from 5 groups of ponds

依據(jù)圖5 中的數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)了水綿屬和剛毛藻屬OTUs 在各組底泥中分布的情況(圖7)。在5組15 個(gè)泥樣中，共檢測到了12 個(gè)含有水綿屬或剛毛藻屬OTUs，其中9 個(gè)檢測到了水綿屬OTUs，9 個(gè)檢測到了剛毛藻屬OTUs。5 組有絲狀藻塘底泥中均檢測到了剛毛藻屬或水綿屬OTUs，組2、組4 和組5 無絲狀藻塘中檢測到剛毛藻屬或水綿屬OTUs，5 組水源底泥中，除組5 外，其余4 組均檢測到了剛毛藻屬或水綿屬OTUs。

圖7 5 組池塘底泥樣品剛毛藻和水綿OUTs 數(shù)量統(tǒng)計(jì)Fig. 7 Number of Cladophora and spirogyra OUTs in sediment samples from 5 groups of ponds

3 討論

通過檢測發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中絲狀藻主要組成種水綿和剛毛藻繁殖體分布廣泛，外源水水體、底泥中均檢測到了繁殖體，而且即使在一些無絲狀藻發(fā)生的池塘中，也在水體、底泥中檢測到了繁殖體的存在，表明在本次調(diào)查中，絲狀藻繁殖體的有無并不是決定絲狀藻是否發(fā)生的關(guān)鍵因素。值得注意的是，雖然絲狀藻繁殖體分布廣泛，但是繁殖體的豐度卻明顯低于其他大多數(shù)真核浮游藻類。

氮磷營養(yǎng)鹽是藻類生長的重要因子[21]，而池塘沉積物是養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)的 “匯” 和 “源”[22]，氮磷大部分沉積在底部沉積物中[23]。一般水產(chǎn)飼料中氮含量明顯高于磷含量，理論上沉積物中的氮含量要高于磷。但是，劉金金等[24]對養(yǎng)殖前中后期的凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)池塘沉積物檢測發(fā)現(xiàn)，沉積物中總氮并未見明顯積累。在本次調(diào)查中，也發(fā)現(xiàn)10 口池塘的生物可利用性氮磷比也均在0.5 以下。造成上述情況的原因有兩個(gè)方面：①氮的沉積率較磷低，氮的沉積率約為水體滯留率的3 倍，而磷則約為17 倍[25]；②有機(jī)氮在養(yǎng)殖系統(tǒng)中容易發(fā)生反硝化作用[25]和氨化作用[26]。因此，沉積物中的氮磷比并沒有預(yù)期的高。然而，氮磷比是藻類生長的關(guān)鍵因子，影響著藻類的生長和演替[27-28]。藻類細(xì)胞組成的原子比率C∶N∶P=106∶16∶1，當(dāng)?shù)妆刃∮?10∶1 則會出現(xiàn)氮抑制[29]。豐茂武等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在不同氮磷比條件下，浮游藻類最佳生長條件為氮磷比40∶1，藻類生長取決于氮的質(zhì)量濃度。朱旭宇等[30]研究也發(fā)現(xiàn)，氮磷比對浮游植物群落的豐度、物種數(shù)及葉綠素a含量都有重要影響，而且氮磷比越高浮游植物豐度越高，氮磷比越低則浮游植物豐度也越低。然而，在本次調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，作為養(yǎng)殖初期氮磷營養(yǎng) “源” 的底泥，其生物可利用性氮磷比均較低，尤其是有絲狀藻池塘，平均生物可利用性氮磷比低至0.23，較無絲狀藻塘低26.32%。劉金金等[24]研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦池塘的可利用氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 57.53～85.31 mg/kg，而本次調(diào)查中，有絲狀藻塘的生物可利用性氮含量僅為15.72 mg/kg。因此，底泥中低生物可利用性氮磷比疊加低于實(shí)際生物可利用性氮含量，導(dǎo)致了在養(yǎng)殖池塘進(jìn)水初期浮游藻類的生長繁殖嚴(yán)重受阻，然而，以剛毛藻、水綿為主要組成種的絲狀藻則具有很強(qiáng)的儲存硝酸鹽氮的能力，使得它們在開發(fā)和利用瞬態(tài)營養(yǎng)供應(yīng)方面有很強(qiáng)的競爭力[31-32]，并且它們具有很強(qiáng)的生理耐受性和可塑性，能在寡營養(yǎng)環(huán)境中改變自身的形態(tài)、繁殖和生長特點(diǎn)[33-35]，所以，在養(yǎng)殖池塘進(jìn)水初期，雖然浮游藻類較絲狀藻繁殖體有更高的豐度，但其在與絲狀藻的生態(tài)位競爭中仍處于劣勢，并且一旦絲狀藻在初期生態(tài)位競爭中占據(jù)優(yōu)勢，憑借其強(qiáng)生長繁殖能力，水體氮磷失衡就難以再逆轉(zhuǎn)，浮游植物也一直處于被抑制的低豐度狀態(tài)。本次調(diào)查的5 組池塘中，5 組有絲狀藻池塘的葉綠素a均低于無絲狀藻池塘，并且有4 組有絲狀藻池塘的葉綠素a顯著低于無絲狀藻池塘(P＜0.05)，此結(jié)果印證了上述結(jié)論。

研究表明，單獨(dú)依靠生石灰或漂白粉清塘并不能完全杜絕絲狀藻的發(fā)生，但可以作為一個(gè)輔助防控措施。而通過調(diào)控養(yǎng)殖系統(tǒng)的生物可利用氮含量及氮磷比來調(diào)控種間生態(tài)位競爭則是一個(gè)值得深入研究的、有前景的絲狀藻防控方向。

（作者聲明本文無實(shí)際或潛在的利益沖突）