張 婷，袁一心，嵇競(jìng)弘，龔泠靈，吳昕玲，劉靜波，尚曉敏

（吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林省營(yíng)養(yǎng)與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130062）

蛋白質(zhì)和多糖是食物中的兩種重要生物大分子，二者的相互作用可以調(diào)控食物結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定乳液、制備脂肪替代物和設(shè)計(jì)微膠囊等[1–4]。在水溶液中，蛋白質(zhì)與多糖通過(guò)靜電力驅(qū)動(dòng)形成復(fù)合凝聚體[5-6]。靜電相互作用強(qiáng)度主要取決于蛋白質(zhì)和多糖的種類、電荷密度、分子質(zhì)量，以及溶液體系pH值、溫度、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)/多糖復(fù)配比和生物聚合物濃度等[7-8]，通過(guò)調(diào)節(jié)這些因素可以有效獲得多尺度的復(fù)合凝聚體。濁度滴定法常用于監(jiān)測(cè)不同pH值條件下蛋白質(zhì)/多糖復(fù)合凝聚相行為變化過(guò)程。隨著pH值降低，復(fù)合體系會(huì)經(jīng)歷3 個(gè)臨界pH值，對(duì)應(yīng)4 種不同的相行為：當(dāng)pH＞pHc時(shí)，復(fù)合體系共溶；當(dāng)pHc＜pH＜pHφ1時(shí)，可溶性復(fù)合凝聚體形成；當(dāng)pHφ2＜pH＜pHφ1時(shí)，不溶性復(fù)合凝聚體發(fā)生宏觀相分離；當(dāng)pH＜pHφ2時(shí)，復(fù)合凝聚體完全解離回到共溶狀態(tài)[5,9]。雖然蛋白質(zhì)和多糖之間的相互作用機(jī)制已被廣泛研究，但對(duì)于特定來(lái)源的蛋白質(zhì)和多糖，其復(fù)合凝聚相行為和凝聚體的結(jié)構(gòu)變化仍有較大差異。

卵白蛋白（ovalbumin，OVA）是蛋清蛋白中含量最高的蛋白質(zhì)（約占54%）[10]，由385 個(gè)氨基酸組成（分子質(zhì)量為45 kDa），是影響蛋清蛋白加工特性的主要物質(zhì)。研究者們針對(duì)不同種類的OVA/多糖復(fù)合體系開展了系統(tǒng)研究，闡明了復(fù)合體系的相行為及物性變化[9,11-12]。Niu Fuge等[13]發(fā)現(xiàn)添加阿拉伯膠顯著改善了OVA溶液的乳化穩(wěn)定性，這是由于OVA與阿拉伯膠相互作用產(chǎn)生了高電荷的表面層，靜電排斥減少了液滴之間的相互作用。Xiong Wenfei等[14]發(fā)現(xiàn)電荷密度較高的羧甲基纖維素可以增強(qiáng)復(fù)合體系的網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)和黏彈性。綜上所述，蛋白質(zhì)和多糖之間的相互作用強(qiáng)度可以調(diào)控復(fù)合體系的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響復(fù)合體系的透明度、穩(wěn)定性和凝膠特性[15-16]。有研究發(fā)現(xiàn)，硫酸化多糖（如硫酸葡聚糖和κ-卡拉膠等）可以調(diào)控蛋清蛋白分子的電荷密度和構(gòu)象，從而調(diào)節(jié)其加工特性[17-18]。但這些硫酸化多糖在食品加工的實(shí)際應(yīng)用中存在一定的問(wèn)題，如硫酸葡聚糖不能用于食品加工；κ-卡拉膠是一種凝膠化多糖，在食品熱加工過(guò)程中會(huì)先于蛋白質(zhì)形成凝膠阻礙食品結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)。巖藻多糖（fucoidan，F(xiàn)UC）是一種天然的硫酸化多糖，具有無(wú)毒和高生物相容性的特點(diǎn)，其碳鏈結(jié)構(gòu)主要由含有硫酸基團(tuán)的巖藻糖殘基組成[19]。FUC是一種高電荷的水溶性陰離子聚合物，在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[20-21]，如抗傳染性非典型肺炎病毒、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化等[22-23]。因此，OVA/FUC不僅可作為安全、大容量的載體用于靶向給藥，還可作為具有生物活性的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)使用，在制備蛋白質(zhì)納米顆粒方面表現(xiàn)出充足的潛力[24]。目前針對(duì)FUC的研究仍局限于分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、活性檢測(cè)等方面，而關(guān)于FUC調(diào)控蛋白質(zhì)物性變化的研究較少。

目前針對(duì)OVA/FUC的相行為變化及相互作用機(jī)制鮮有研究，嚴(yán)重限制了OVA/FUC復(fù)合體系在食品加工中的應(yīng)用。因此，本研究采用濁度滴定法、Zeta電位測(cè)量等分析方法，測(cè)定OVA/FUC復(fù)合體系在不同蛋白質(zhì)/多糖復(fù)配比和鹽濃度下的相行為變化，明確二者復(fù)合凝聚的臨界pH值；利用圓二色光譜（circular dichroism，CD）、熒光光譜和流變學(xué)等手段，解析FUC對(duì)蛋白構(gòu)象和物性的影響，闡釋OVA和FUC相互作用的機(jī)制。以期為理解硫酸化多糖與蛋白質(zhì)相互作用機(jī)制奠定良好理論基礎(chǔ)，并為開發(fā)基于硫酸化多糖/蛋白質(zhì)復(fù)合凝聚體的功能性食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

OVA（純度≥98%）美國(guó)Sigma-Aldrich公司；FUC（純度85%）北京源葉生物科技有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、F-7000熒光分光光度計(jì) 日本島津公司；Discovery HR-1流變儀 美國(guó)TA儀器公司；MOS-450 CD儀 法國(guó)Bio-Logic公司；Starter2C pH計(jì) 奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 OVA和FUC儲(chǔ)備液的制備

準(zhǔn)確稱取適量OVA和FUC樣品分別溶解于去離子水中，制備得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的儲(chǔ)備液，在室溫條件下攪拌2 h后，置于4 ℃冰箱中過(guò)夜以保證樣品充分水合。添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的疊氮化鈉溶液避免細(xì)菌生長(zhǎng)。

1.3.2 OVA/FUC復(fù)合物的制備

將OVA與FUC的儲(chǔ)備液按不同質(zhì)量比（1∶1、5∶1、10∶1、20∶1和50∶1）進(jìn)行混合得到OVA/FUC復(fù)合溶液，同時(shí)保證復(fù)合溶液中生物聚合物的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，此時(shí)溶液中的pH值為6.0。為了研究離子強(qiáng)度對(duì)OVA/FUC復(fù)合物形成的影響，向OVA/FUC復(fù)合溶液（20∶1）中添加不同質(zhì)量的NaCl得到不同鹽離子濃度（c（NaCl）＝0、50、100、200、400 mmol/L）的OVA/FUC復(fù)合溶液。

1.3.3 濁度測(cè)定

利用濁度滴定法觀察樣品溶液復(fù)合凝聚過(guò)程中的濁度與pH值的關(guān)系。參照Yang Lan等[25]的方法，利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)處對(duì)OVA/FUC復(fù)合溶液的濁度進(jìn)行表征，比色皿的夾縫寬度為1 cm。用HCl溶液（0.1、0.5、1.0 mol/L）將OVA/FUC復(fù)合物的pH值從6.0調(diào)整到2.0，溶液的pH值每變化0.25時(shí)，取樣進(jìn)行濁度測(cè)定，并記錄其對(duì)應(yīng)pH值。

1.3.4 Zeta電位測(cè)定

參考Liu Jingbo等[9]的方法，將OVA儲(chǔ)備液、FUC儲(chǔ)備液、不同質(zhì)量比（1∶1、5∶1、10∶1、20∶1和50∶1）的OVA/FUC復(fù)合溶液和不同鹽離子濃度（c（NaCl）＝0、50、100、200、400 mmol/L）的OVA/FUC復(fù)合溶液稀釋10 倍后，利用激光納米粒度儀測(cè)定酸化過(guò)程中復(fù)合凝聚物表面的Zeta電位，平衡時(shí)間為120 s。

1.3.5 內(nèi)源熒光光譜測(cè)定

參照Antonov等[26]的方法，將不同pH值（4.5和6.0）樣品中的蛋白質(zhì)量濃度稀釋至0.5 mg/mL，在室溫條件下測(cè)定復(fù)合溶液熒光光譜。發(fā)射光譜范圍為300～450 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為270 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為3 nm，狹縫寬度為5 nm，激發(fā)電壓為400 V。

1.3.6 CD測(cè)定

根據(jù)Greenfield[27]的方法。將不同pH值（4.5和6.0）樣品中的蛋白質(zhì)量濃度稀釋到0.5 mg/mL，在室溫條件下用CD儀測(cè)定樣品溶液在200～250 nm范圍的CD。用不含蛋白質(zhì)溶液的光譜進(jìn)行校正。使用BESTSEL軟件（https://bestsel.elte.hu/index.php）分析光譜并對(duì)樣品二級(jí)結(jié)構(gòu)含量進(jìn)行計(jì)算。

1.3.7 流變特性測(cè)定

參照Wang Chenying等[28]的方法，使用配備直徑40 mm夾具的流變儀進(jìn)行流變測(cè)試。將大約1.5 mL樣品置于旋轉(zhuǎn)流變儀樣品盤上，夾具與樣品盤之間的間隙為1 mm，25 ℃穩(wěn)定30 min，以1%的應(yīng)變從0.1 rad/s到100 rad/s進(jìn)行頻率掃描得到樣品的儲(chǔ)能模量（G’）。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

2 結(jié)果與分析

2.1 OVA/FUC復(fù)合凝聚相行為分析

2.1.1 pH值對(duì)OVA/FUC復(fù)合凝聚的影響

多糖和蛋白質(zhì)之間產(chǎn)生復(fù)合凝聚現(xiàn)象是由于帶相反電荷的生物聚合物之間的靜電引力驅(qū)動(dòng)[29]。復(fù)合體系的pH值是決定生物聚合物表面電荷密度的關(guān)鍵。如圖1所示，在酸性滴定過(guò)程中，OVA/FUC復(fù)合物的濁度明顯高于OVA或FUC單一溶液，這主要?dú)w因于靜電引力作用促進(jìn)了蛋白質(zhì)和多糖之間形成復(fù)合凝聚體。在酸滴定過(guò)程中單一的FUC溶液相對(duì)澄清，其濁度低且相對(duì)恒定，這歸因于FUC分子表面的硫酸基團(tuán)產(chǎn)生了抑制多糖分子間聚集的強(qiáng)靜電斥力[30]。OVA的濁度取決于pH值，在OVA的等電點(diǎn)（pH 4.72）附近達(dá)到最大。對(duì)于OVA/FUC復(fù)合物，有4 個(gè)關(guān)鍵的pH值臨界點(diǎn)（pHc、pHφ1、pHmax和pHφ2），pHc為濁度曲線斜率初次變化時(shí)的pH值，pHφ1是濁度曲線斜率突然增大時(shí)的pH值，pHmax是濁度達(dá)到峰值時(shí)的pH值，而pHφ2值是濁度曲線下降至穩(wěn)定時(shí)的pH值[5]。當(dāng)pH＞pHc時(shí)，OVA與FUC在溶液中都帶負(fù)電，由于復(fù)合物之間的靜電排斥作用，OVA和FUC之間無(wú)法形成復(fù)合物（共溶區(qū)）。當(dāng)pHφ1＜pH＜pHc時(shí)，復(fù)合溶液濁度開始增加，表明溶液中OVA和FUC形成了具有一定散射光線能力的可溶性復(fù)合物[31]。當(dāng)pH值高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，依然可以通過(guò)靜電相互作用形成可溶性復(fù)合物，這主要是蛋白質(zhì)表面少量帶正電的氨基酸與聚陰離子多糖帶負(fù)電的硫酸基團(tuán)相互作用的結(jié)果，也稱之為“正電補(bǔ)丁”效應(yīng)[9]。隨著進(jìn)一步滴定，濁度急劇上升，當(dāng)pH＜pHφ1時(shí)，出現(xiàn)明顯的相分離，形成不溶性復(fù)合凝聚體。OVA和FUC之間的靜電相互作用在pHmax時(shí)達(dá)到最強(qiáng)，導(dǎo)致不溶性O(shè)VA/FUC復(fù)合凝聚體的積累量達(dá)到最大。而后，隨著pH值的不斷降低，由于多糖的質(zhì)子化，OVA/FUC復(fù)合凝聚物開始出現(xiàn)解離，乳濁液逐漸變澄清。但并未觀察到OVA/FUC復(fù)合凝聚物完全解離（即未出現(xiàn)pHφ2）[32]。主要原因在于含有硫酸基團(tuán)的FUC酸解離常數(shù)（pKa）較低，在強(qiáng)酸條件下仍然未被全部質(zhì)子化，因此即便在較低pH值時(shí)，OVA與FUC仍然存在強(qiáng)靜電吸引力，較難解離。OVA/硫酸葡聚糖互作體系及OVA/果膠體系在酸化過(guò)程中均存在類似現(xiàn)象[9,33]。

圖1 OVA、FUC和OVA-FUC復(fù)合溶液濁度隨pH值的變化Fig.1 pH-Dependent changes in turbidity of OVA,FUC and OVA-FUC mixed solutions

2.1.2 蛋白質(zhì)/多糖復(fù)配比對(duì)復(fù)合凝聚相行為的影響

蛋白質(zhì)/多糖復(fù)配比是影響復(fù)合物形成的關(guān)鍵因素之一，對(duì)復(fù)合體系的臨界pH值影響顯著[34]。本研究進(jìn)一步探討了無(wú)鹽添加條件下OVA/FUC復(fù)配比對(duì)復(fù)合凝聚體形成的影響。如圖2所示，隨著OVA/FUC質(zhì)量比的增加（從1∶1增加至50∶1），OVA/FUC復(fù)合體系的濁度曲線逐漸趨于正態(tài)分布（圖2a），臨界pH值向更高pH值遷移（圖2b）。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)/多糖質(zhì)量比為1∶1時(shí)，復(fù)合溶液濁度較低，表明FUC處于過(guò)量狀態(tài)，體系內(nèi)蛋白分子可完全結(jié)合到糖鏈上，此時(shí)體系靜電斥力較強(qiáng)，進(jìn)一步抑制了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)分子相互作用。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)/多糖質(zhì)量比從5∶1增加到50∶1時(shí)，復(fù)合溶液的濁度曲線逐漸呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，表明在較高蛋白質(zhì)濃度條件下促進(jìn)了復(fù)合凝聚體的形成，此時(shí)FUC糖鏈可結(jié)合多個(gè)OVA分子。圖2c為不同蛋白質(zhì)/多糖復(fù)配比復(fù)合凝聚物的外觀，質(zhì)量比為50∶1與20∶1的樣品隨著pH值降低出現(xiàn)了明顯的宏觀相分離，而在5∶1的體系中未觀測(cè)到類似現(xiàn)象。相分離由熱力學(xué)不相容而產(chǎn)生的排除體積效應(yīng)影響，而非絮凝作用[35]。綜上所述，當(dāng)OVA/FUC質(zhì)量比為20∶1時(shí)，OVA和FUC的結(jié)合達(dá)到飽和，二者在復(fù)合凝聚過(guò)程中形成最穩(wěn)定的復(fù)合凝聚體。

圖2 不同生物聚合物質(zhì)量比OVA-FUC復(fù)合溶液的濁度（a）、臨界pH值（b）和外觀（c）隨pH值的變化Fig.2 pH-Dependent changes in turbidity (a),critical pH (b) and appearance (c) of OVA-FUC mixed solutions with different mass ratios

2.1.3 離子強(qiáng)度對(duì)OVA/FUC復(fù)合凝聚的影響

鹽離子可通過(guò)靜電屏蔽作用調(diào)控生物聚合物之間的相互作用。本實(shí)驗(yàn)以O(shè)VA/FUC質(zhì)量比20∶1為條件制備復(fù)合溶液，分析NaCl濃度對(duì)OVA與FUC復(fù)合凝聚過(guò)程的影響。如圖3a所示，隨著NaCl濃度的增加，復(fù)合體系的濁度曲線在pH＜pHmax后逐漸趨于平緩。特別是當(dāng)鹽濃度大于50 mmol/L時(shí)，復(fù)合溶液的濁度曲線有一個(gè)較寬的平臺(tái)期。當(dāng)鹽濃度大于200 mmol/L時(shí)，濁度由于強(qiáng)靜電屏蔽效應(yīng)而顯著提升，溶液的表觀形貌進(jìn)一步證明了該變化趨勢(shì)（圖3a、c）。如圖3b所示，隨著鹽濃度的增加，pHc與pHφ1均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，而pHmax在鹽濃度提升至100 mmol/L時(shí)消失。這一現(xiàn)象可解釋為在低鹽濃度（0～100 mmol/L）條件下，鹽離子可在一定程度上提高生物聚合物的溶解度，促進(jìn)形成生物聚合物之間的靜電引力，誘導(dǎo)凝聚體形成。在高鹽濃度下，NaCl的競(jìng)爭(zhēng)性吸附抑制了OVA和FUC之間的靜電引力，導(dǎo)致臨界pH值的降低。Liu Jingbo等[9]對(duì)OVA/硫酸葡聚糖的相行為研究中同樣觀測(cè)到類似變化趨勢(shì)。

圖3 不同NaCl濃度OVA-FUC復(fù)合溶液的濁度（a）、臨界pH值（b）和外觀（c）隨pH值的變化Fig.3 pH-Dependent changes in turbidity (a),critical pH (b) and appearance (c) of OVA-FUC mixed solutions with different NaCl concentrations

2.2 OVA/FUC復(fù)合凝聚物的Zeta電位分析

靜電引力是水溶液中復(fù)合凝聚體形成的主要驅(qū)動(dòng)力[36]。此外，蛋白質(zhì)和多糖的表面電荷種類與大小受溶液中環(huán)境條件的影響。通過(guò)測(cè)定OVA、FUC和OVA/FUC復(fù)合物的Zeta電位解析OVA/FUC復(fù)合物在復(fù)合凝聚過(guò)程中的靜電復(fù)合機(jī)理。如圖4a所示，在酸滴定過(guò)程中所有樣品的Zeta電位均逐漸增加。本研究中測(cè)得OVA的等電點(diǎn)為4.58，與之前的研究結(jié)果接近（等電點(diǎn)為4.5）[37]。當(dāng)溶液的pH值大于OVA的等電點(diǎn)時(shí)，OVA分子帶負(fù)電，溶液pH值小于OVA等電點(diǎn)時(shí)則帶正電。FUC的pKa值極低，因此FUC溶液在整個(gè)酸性滴定過(guò)程中帶較高的負(fù)電荷[24]。當(dāng)溶液pH值小于OVA等電點(diǎn)時(shí)，二者帶相反電荷，可在靜電引力的驅(qū)動(dòng)下形成復(fù)合凝聚體。當(dāng)pH值從6.0降至5.0時(shí)，所有樣品的Zeta電位均未發(fā)生明顯變化，且?guī)в幸欢康呢?fù)電荷（Zeta電位＜-20 mV），結(jié)合濁度滴定結(jié)果可知，可溶性復(fù)合物形成時(shí)（pH＝pHφ1）體系的凈電荷相對(duì)較高。此外，當(dāng)溶液pH＜5.0時(shí)，OVA/FUC復(fù)合物（質(zhì)量比為20∶1和50∶1）的表面電位迅速增加，在酸滴定過(guò)程中經(jīng)歷了從帶負(fù)電到帶正電的過(guò)程。同時(shí)，OVA/FUC復(fù)合物（質(zhì)量比為20∶1和50∶1）的等電點(diǎn)與pHmax幾乎相同（圖2a），表明當(dāng)OVA/FUC復(fù)合物的凈電荷接近0時(shí)，凝聚體的堆積量達(dá)到最大。另外，當(dāng)質(zhì)量比＜20∶1時(shí)，過(guò)量的FUC導(dǎo)致復(fù)合物的Zeta電位增加幅度變小，在整個(gè)pH值范圍內(nèi)帶凈負(fù)電荷。這與2.1.2節(jié)的結(jié)果相吻合，在比例小于20∶1時(shí)沒(méi)有檢測(cè)到濁度的最大值。

圖4 不同質(zhì)量比（a）和不同NaCl濃度（b）OVA/FUC復(fù)合物的Zeta電位變化Fig.4 Changes in zeta potential of OVA/FUC mixtures with different ratios (a) and different NaCl concentrations (b)

不同鹽濃度的OVA/FUC溶液（質(zhì)量比為20∶1）中Zeta電位與pH值的關(guān)系如圖4b所示。在不含NaCl的溶液中，OVA/FUC的等電點(diǎn)為4.07。鹽離子的添加使復(fù)合物的等電點(diǎn)發(fā)生了輕微的左移，并且復(fù)合物的等電點(diǎn)隨著溶液中NaCl的濃度升高而降低，這是由于NaCl的靜電屏蔽作用[38]。在較高的離子強(qiáng)度下（c（NaCl）≥100 mmol/L），過(guò)量的離子屏蔽了聚合物的帶電活性位點(diǎn)，OVA和FUC之間的靜電引力減少，這導(dǎo)致過(guò)多的硫酸基團(tuán)無(wú)法與陽(yáng)離子氨基基團(tuán)結(jié)合。因此高NaCl濃度（c（NaCl）≥100 mmol/L）的復(fù)合溶液濁度在pH值小于OVA等電點(diǎn)時(shí)較高，且在低pH值時(shí)出現(xiàn)平臺(tái)期。此外，在整個(gè)pH值范圍內(nèi)，OVA/FUC復(fù)合物Zeta電位絕對(duì)值與溶液中鹽濃度的變化趨勢(shì)相反。Zeta電位絕對(duì)的大小與系統(tǒng)的穩(wěn)定性有關(guān)[39]，因此高鹽濃度會(huì)導(dǎo)致體系的穩(wěn)定性降低。Ding Lan等[40]也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，NaCl的加入導(dǎo)致殼聚糖/酪蛋白混合物Zeta電位的降低，促進(jìn)了復(fù)合物聚集的形成，降低了復(fù)合物的穩(wěn)定性。綜上，靜電相互作用為OVA/FUC凝聚體形成的主導(dǎo)力，且當(dāng)復(fù)合物的濁度達(dá)到峰值（pHmax）時(shí)，OVA與FUC帶有相反電荷。

2.3 OVA/FUC復(fù)合體內(nèi)蛋白質(zhì)構(gòu)象解析

2.3.1 內(nèi)源熒光光譜分析

在蛋白質(zhì)/多糖復(fù)合體系中，蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)變化與二者的復(fù)合凝聚過(guò)程密切相關(guān)。本研究進(jìn)一步分析OVA與FUC在共溶區(qū)間（pH 6.0）和靜電復(fù)合凝聚區(qū)間（pH 4.5）條件下的熒光光譜。由圖5a可知，pH 6.0條件下復(fù)合物的熒光強(qiáng)度峰值改變，表明OVA分子的內(nèi)部構(gòu)象發(fā)生了變化。與單一OVA溶液相比，少量FUC加入（質(zhì)量比為10∶1、20∶1、50∶1）使OVA熒光光譜出現(xiàn)一定程度的猝滅。然而，當(dāng)復(fù)合體系中的FUC過(guò)量時(shí)（質(zhì)量比為5∶1、1∶1），OVA的熒光強(qiáng)度峰值顯著提高，這表明蛋白質(zhì)內(nèi)部熒光基團(tuán)周圍微環(huán)境的極性增加和疏水性降低[41]。在pH 4.5時(shí)，OVA及OVA/FUC復(fù)合物的熒光強(qiáng)度顯著提升（圖5b），這與酸性條件下蛋白質(zhì)分子展開導(dǎo)致熒光基團(tuán)暴露有關(guān)[42]。值得注意的是，當(dāng)OVA/FUC的質(zhì)量比為5∶1和1∶1時(shí)，OVA熒光強(qiáng)度的最大值提升了5 倍。由相行為和Zeta電位結(jié)果可知，pH 4.5條件下質(zhì)量比為5∶1和1∶1的OVA/FUC復(fù)合物處于可溶性復(fù)合凝聚體區(qū)，此時(shí)復(fù)合體系中過(guò)量的聚陰離子抑制了OVA的聚集，使OVA分子在酸性條件下充分展開，熒光基團(tuán)大量暴露[43]，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度顯著提高。此外，在共溶區(qū)間內(nèi)FUC所有比例的復(fù)合均使OVA熒光峰值發(fā)生了明顯的紅移，這是由于OVA/FUC復(fù)合物的形成可能改變了OVA內(nèi)部色氨酸殘基所處的極性疏水微環(huán)境[44]，說(shuō)明疏水相互作用也參與了OVA/FUC復(fù)合物的形成。

圖5 不同生物聚合物比例下OVA/FUC復(fù)合物在pH 6.0（a）與pH 4.5（b）條件下的熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of OVA/FUC mixtures with different ratios at pH 6.0 (a) and pH 4.5 (b)

2.3.2 CD分析

為進(jìn)一步分析OVA與FUC復(fù)合凝聚過(guò)程中二者之間相互作用的分子機(jī)制，測(cè)定在pH 6.0與pH 4.5條件下不同比例OVA/FUC復(fù)合物的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果如圖6所示。蛋白質(zhì)中α-螺旋的特征峰位于約208 nm和222 nm波長(zhǎng)處，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角的特征峰位于約216 nm和206 nm波長(zhǎng)處[27]。如圖6a、b所示，單一OVA的光譜峰值位于約222 nm，F(xiàn)UC的加入使所有樣品的光譜峰發(fā)生了不同程度的藍(lán)移，表明OVA/FUC復(fù)合物中蛋白質(zhì)分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。在pH 6.0的復(fù)合溶液中，少量FUC的加入降低了OVA光譜峰的強(qiáng)度（質(zhì)量比≥10∶1）。相反，過(guò)量的FUC會(huì)導(dǎo)致OVA光譜的峰值增大（質(zhì)量比＜10∶1）。而當(dāng)復(fù)合溶液的pH值為4.5時(shí)，任何添加量的FUC均會(huì)使OVA光譜峰的強(qiáng)度降低，此時(shí)OVA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。由此可見(jiàn)，F(xiàn)UC的復(fù)合凝聚改變了OVA的二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象（α-螺旋與β-折疊）[45]。

圖6 OVA和OVA/FUC復(fù)合溶液在pH 6.0（a、c）和pH 4.5（b、d）時(shí)的CD及其二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量Fig.6 Circular dichrogram spectra and relative contents ofsecondary structure of OVA and OVA/FUC mixtures at pH 6.0 (a and c) and pH 4.5 (b and d)

為了進(jìn)一步量化FUC復(fù)合對(duì)OVA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，使用BESTSEL軟件分析了蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量，結(jié)果如圖6c、d所示。當(dāng)pH 6.0時(shí)，F(xiàn)UC的添加對(duì)OVA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響不顯著。當(dāng)pH 4.5時(shí)，F(xiàn)UC的存在使OVA的α-螺旋含量下降而β-折疊含量上升，這表明添加FUC后OVA分子發(fā)生了一定程度的解螺旋。此外，F(xiàn)UC對(duì)OVA的解螺旋效應(yīng)在50∶1時(shí)達(dá)到最大值，而在1∶1時(shí)達(dá)到最小值，該變化歸因于溶液中過(guò)量的陰離子對(duì)OVA二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的抑制作用。Zhang Ting等[43]在蛋清蛋白與硫酸葡聚糖的相互作用研究中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。Tang Honggang等[46]同樣發(fā)現(xiàn)帶有硫酸基團(tuán)卡拉膠的復(fù)合作用促進(jìn)了蛋清蛋白分子α-螺旋向β-折疊的轉(zhuǎn)變。然而大量研究表明，除硫酸化多糖外的其他陰離子多糖（如羧甲基纖維素）與蛋白質(zhì)的靜電復(fù)合對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響，這一現(xiàn)象可能與多糖中的硫酸基團(tuán)有關(guān)。

2.4 OVA/FUC復(fù)合凝聚體流變學(xué)特性分析

為更深入地了解OVA/FUC凝聚體的宏觀特性，利用頻率掃描進(jìn)一步探究了在pH 4.5條件下NaCl濃度和OVA/FUC質(zhì)量比對(duì)凝聚體黏彈性的影響。儲(chǔ)能模量（G’）反映復(fù)合體系的黏彈性，是溶液中大分子相互交聯(lián)形成大尺寸聚集體的結(jié)果[47]。如圖7a所示，復(fù)合溶液的G’隨著FUC的添加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且在OVA/FUC質(zhì)量比為20∶1時(shí)達(dá)到最大值，表明在該條件下復(fù)合溶液中蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)程度達(dá)到最大，聚集體的尺寸達(dá)到最大。相反，當(dāng)質(zhì)量比為5∶1或1∶1時(shí)，OVA/FUC復(fù)合物的G’遠(yuǎn)低于OVA，這一結(jié)果與相行為結(jié)果基本相符，此條件下的OVA/FUC復(fù)合物處于可溶性復(fù)合凝聚階段和共溶階段，體系中大量的聚陰離子阻礙了蛋白質(zhì)分子的進(jìn)一步聚集。Niu Fuge等[48]研究表明，由于空間位阻效應(yīng)，高度支化的多糖在混合體系中比線性大分子難以形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)。因此，過(guò)多的FUC削弱了復(fù)合體的復(fù)合凝聚過(guò)程中的聚集行為。不同鹽濃度下的流變結(jié)果表明，隨著鹽濃度的增加，樣品的G’呈現(xiàn)先減小后增加的趨勢(shì)（圖7b）。這可能是由于在pH 4.5溶液體系中少量鹽的加入會(huì)抑制OVA與FUC之間的相互作用，削弱復(fù)合物的相互交聯(lián)。在50 mmol/L的NaCl濃度下，體系的G’最低。然而，當(dāng)NaCl濃度達(dá)到400 mmol/L時(shí)，OVA/FUC凝聚體的G’達(dá)到最大值。這可能是由于高鹽促進(jìn)了OVA分子的變性，從而促進(jìn)了OVA分子間的聚集。這些結(jié)果與濁度和Zeta電位隨離子強(qiáng)度的變化基本一致。綜上所述，體系中過(guò)量蛋白質(zhì)或多糖的存在影響凝聚體的G’，這歸因于體系的排斥力和空間位阻效應(yīng)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)/多糖結(jié)合接近飽和時(shí)，復(fù)合體系作為一個(gè)電中性的整體，分子間排斥力最小，導(dǎo)致OVA/FUC質(zhì)量比為20∶1的復(fù)合物表現(xiàn)出最高的G’。

圖7 pH 4.5條件下不同質(zhì)量比（a）和NaCl濃度（b）的OVA/FUC復(fù)合溶液的G’Fig.7 G’ of OVA/FUC mixtures with different mass ratios (a) and NaCl concentrations (b) at pH 4.5

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)探究了pH值、離子強(qiáng)度和生物聚合物質(zhì)量比對(duì)OVA和FUC復(fù)凝聚相行為的影響。隨著OVA/FUC復(fù)配比的增加，可以與FUC結(jié)合的OVA分子數(shù)量增加，復(fù)合物的臨界pH值（pHc和pHφ1）向高pH值方向移動(dòng)。當(dāng)OVA/FUC的質(zhì)量比從1∶1增加到5∶1時(shí)，由于OVA和FUC之間強(qiáng)烈的靜電相互作用，沒(méi)有出現(xiàn)明顯的pHmax。形成復(fù)合物的最佳OVA/FUC質(zhì)量比是20∶1，它表現(xiàn)出最高的濁度，且具有較高的儲(chǔ)能模量。OVA和FUC之間的靜電相互作用具有顯著的鹽離子依賴性。當(dāng)鹽的濃度小于100 mmol/L時(shí)，復(fù)合物的臨界pH值向更高的pH值方向移動(dòng)，表明低鹽離子濃度可促進(jìn)復(fù)合凝聚體的形成。然而當(dāng)鹽濃度大于100 mmol/L時(shí)，靜電屏蔽效應(yīng)會(huì)改變OVA與FUC之間的靜電復(fù)合狀態(tài)，臨界pH值顯著下降。同時(shí)，F(xiàn)UC的加入改變了OVA蛋白質(zhì)的分子構(gòu)象，促進(jìn)了OVA的解螺旋和三級(jí)結(jié)構(gòu)的展開。綜上所述，通過(guò)改變OVA和FUC溶液的復(fù)合條件可以調(diào)控二者的復(fù)合凝聚特性，本研究可為設(shè)計(jì)基于OVA/FUC復(fù)合物的新型水凝膠和功能性納米載體奠定理論基礎(chǔ)。