張千祎 郭紀(jì)敏 薛佳蕊 王淑青 劉巖，3

癌癥不僅是全球主要死因之一，也是阻礙人類期望壽命延長的重要因素[1]。原發(fā)性肝癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，全球第六大常見惡性腫瘤，近幾十年來發(fā)病率不斷上升[2]。其中肝細(xì)胞癌是一種常見的肝癌類型，約占所有原發(fā)性肝癌病例的90%[3]。子宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，具有高發(fā)病率和高死亡率，對(duì)世界各地?cái)?shù)百萬婦女的健康造成不利影響[4-5]。對(duì)這2種癌癥機(jī)制的研究，有助于發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，為肝癌和子宮頸癌的診斷和治療提供新方法。毗鄰鋅指結(jié)構(gòu)域的溴結(jié)構(gòu)域蛋白1A（bromodomain adjacent to zinc finger domain 1A，BAZ1A）又叫做Acf1[6]。BAZ1A在神經(jīng)發(fā)育、精子發(fā)生和細(xì)胞衰老中都發(fā)揮作用[7-9]。本研究發(fā)現(xiàn)，BAZ1A在肝癌和子宮頸癌中都高表達(dá)。并且不論在肝癌還是子宮頸癌中，BAZ1A表達(dá)水平較高組的癌癥患者預(yù)后更差。BAZ1A在肝癌和子宮頸癌中都發(fā)揮促癌作用。本研究聚焦BAZ1A在肝癌和子宮頸癌中的共同促癌機(jī)制，以更好地理解和認(rèn)識(shí)BAZ1A在癌癥發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般材料

人肝癌亞力山大細(xì)胞（primary liver carcinoma /poliomyelitis research foundation / 5，PLC/PRF/5）和人子宮頸癌海拉細(xì)胞（henrietta lacks，Hela）均購買于天津塞爾有限公司[細(xì)胞已經(jīng)過短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STR）驗(yàn)證]；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購買于安徽康源生物技術(shù)有限責(zé)任公司（貨號(hào)：KY-01002）；1%青霉素-鏈霉素、杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶均購買于美國Gibco公司（貨號(hào)：15140122、C11995500BT、25200056）；35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿、90 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿均購買于美國康寧公司；1×PBS購買于北京索萊寶科技有限公司（貨號(hào)：P1020）；siRNA購買于蘇州吉瑪基因股份有限公司（si-BAZ1A：5’-UGUUGCCUAGACCUUCAUCTT-3’，si-NC：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取出凍存的細(xì)胞于37 ℃水浴鍋中輕輕晃動(dòng)使其快速解凍，棄掉細(xì)胞懸液上清，加入新鮮的全培養(yǎng)基（含10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基）重懸，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24 h，中間可對(duì)其進(jìn)行換液。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，即可進(jìn)行細(xì)胞傳代。PBS清洗2遍，加入胰酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，后加入1 mL全培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液離心800 r/min，5 min。棄上清，加入1 mL全培養(yǎng)基混勻細(xì)胞，將細(xì)胞懸液以1∶2或1∶3的比例傳至90 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h左右，傳代3次以上即可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

實(shí)驗(yàn)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，轉(zhuǎn)染si-BAZ1A至肝癌PLC/PRF/5細(xì)胞和子宮頸癌Hela細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染NC-siRNA至肝癌PLC/PRF/5細(xì)胞和子宮頸癌Hela細(xì)胞為對(duì)照組，4組細(xì)胞分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。使用Trizol試劑從細(xì)胞樣本提取各組總RNA，送往上海中科新生命公司完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。首先對(duì)抽提的RNA進(jìn)行質(zhì)檢，樣本檢測(cè)合格后，用帶有Oligo（dT）的磁珠從1 μg的總RNA中純化mRNA。隨后加入fragmentation buffer將mRNA進(jìn)行隨機(jī)打斷。以mRNA片段為模板，用隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，然后加入緩沖液、dNTPs和DNA聚合酶Ⅰ合成cDNA第二鏈，隨后利用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，然后用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）富集得到最終的cDNA文庫。檢測(cè)文庫的插入片段長度和有效濃度，最后按照不同文庫目標(biāo)測(cè)序數(shù)據(jù)量不同，上機(jī)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 觀察指標(biāo)

肝癌組DEGs、子宮頸癌組DEGs、共有DEGs的獲?。桓伟┙MDEGs、子宮頸癌組DEGs、共有DEGs的基因本體論（gene ontology，GO）富集分析結(jié)果；肝癌組DEGs、子宮頸癌組DEGs、共有DEGs的京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析結(jié)果；肝癌組DEGs、子宮頸癌組DEGs、共有DEGs的蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction，PPI）分析結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 獲得DEGs

將樣品通過RNA測(cè)序后應(yīng)用R4.2.1軟件分析，采用“DESeq2”包對(duì)肝癌實(shí)驗(yàn)組測(cè)序結(jié)果和肝癌對(duì)照組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行差異分析，篩選出肝癌組DEGs，對(duì)子宮頸癌實(shí)驗(yàn)組測(cè)序結(jié)果和子宮頸癌對(duì)照組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行差異分析，獲得子宮頸癌組DEGs。應(yīng)用“ggplot2[3.3.6]，VennDiagram[1.7.3]”包篩選BAZ1A在肝癌和子宮頸癌里的共有DEGs并繪制韋恩圖。

1.4.2 GO和KEGG富集分析

應(yīng)用R（4.2.1）“clusterProfiler [4.4.4]”包分別對(duì)肝癌組DEGs、子宮頸癌組DEGs、共有組DEGs進(jìn)行GO和KEGG富集分析。應(yīng)用“ggplot2 [3.3.6]”包根據(jù)分析結(jié)果繪制柱狀圖和氣泡圖。

1.4.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

將肝癌組294個(gè)DEGs、子宮頸癌組DEGs前2 000個(gè)（篩選標(biāo)準(zhǔn)：P＜0.05，log2fold change絕對(duì)值＞1）、共有組170個(gè)DEGs導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/）獲取DEGs的高等置信度（＞0.900）的蛋白-蛋白對(duì)，隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開連接的節(jié)點(diǎn)，基于上述蛋白-蛋白對(duì)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。并使用Cytoscape（3.9.1）軟件根據(jù)Degree值尋找各組DEGs中的核心基因。

2 結(jié)果

2.1 KEGG富集分析結(jié)果

將肝癌組DEGs和子宮頸癌組DEGs分別進(jìn)行KEGG通路富集（P＜0.1），在2種癌癥里都顯著富集的KEGG通路包括細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用、焦點(diǎn)黏附、小細(xì)胞肺癌、人乳頭狀瘤病毒感染、病毒性致癌這些通路（圖1A，圖1B）。肝癌組共獲得294個(gè)DEGs、子宮頸癌組共獲得5 662個(gè)DEGs。對(duì)肝癌組DEGs和子宮頸癌組DEGs進(jìn)行Venn分析，篩選出170個(gè)共有DEGs（圖1C）。對(duì)共有DEGs進(jìn)行KEGG富集分析，共涉及9條通路：細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用、焦點(diǎn)黏附、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、小細(xì)胞肺癌、病毒性致癌、中性粒細(xì)胞胞外陷阱的形成、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、造血細(xì)胞譜系、酗酒（圖1D）。

圖1 DEGs的韋恩圖和KEGG富集分析氣泡圖

2.2 GO富集分析結(jié)果

將肝癌組DEGs、子宮頸癌組DEGs富集到P＜0.05的GO功能條目取交集，對(duì)共有的GO條目按每一條目中包含的差異基因數(shù)量降序排列，取前50個(gè)條目，在生物過程（biological process，BP）類別下按照癌癥的特征主要富集到發(fā)育和生長過程、BP調(diào)節(jié)、化學(xué)反應(yīng)和信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和定位、免疫系統(tǒng)過程。每類各取3項(xiàng)展示，不足3項(xiàng)的展示實(shí)際數(shù)目。（圖2A）。共有DEGs在BP條目中富集到的結(jié)果涉及多生物繁殖過程、核小體組裝、多細(xì)胞BP等；細(xì)胞組成（cellular component，CC）條目富集結(jié)果主要涉及蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物、DNA包裝復(fù)合物、整合素復(fù)合體等；分子功能（molecular function，MF）主要涉及酶抑制劑活性、蛋白質(zhì)異二聚化活性、激酶調(diào)節(jié)劑活性等（圖2B）。

圖2 各組DEGs的GO富集分析結(jié)果

2.3 差異基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

將肝癌組DEGs、共有DEGs以及篩選出的前2 000個(gè)子宮頸癌組DEGs導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中，從肝癌組生成的PPI網(wǎng)絡(luò)圖中篩選出2個(gè)核心基因：H4簇狀組蛋白5（H4 clustered histone 5，H4C5）、H4簇狀組蛋白14（H4 clustered histone 14，H4C14）；從子宮頸癌組生成的PPI網(wǎng)絡(luò)圖中篩選出3個(gè)核心基因：激太原1（kininogen 1，KNG1）、圓盤大MAGUK支架蛋白4（discs large MAGUK scaffold protein 4，DLG4）、分化簇44（cluster of differentiation，CD44）；從共有組生成的PPI網(wǎng)絡(luò)圖中篩選出1個(gè)核心基因：H2A簇狀組蛋白18（H2A clustered histone 18，H2AC18）。把篩選出的核心基因和與其相互作用的DEGs，再次導(dǎo)入Cytoscape軟件，生成核心基因及其相互作用基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。見圖3。

圖3 各組核心基因及其相互作用基因的PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

3 討論

目前BAZ1A的研究方向主要集中在神經(jīng)發(fā)育、精子發(fā)生和細(xì)胞衰老中，也有研究表明其與抑郁易感性有關(guān)，并調(diào)節(jié)應(yīng)激相關(guān)行為[10]。BAZ1A的失調(diào)可導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生，特別是癌癥。在乳腺癌、肺癌和白血病中發(fā)現(xiàn)BAZ1A高表達(dá)，并且這種高表達(dá)與不良的總生存期相關(guān)[9-11]。這表明BAZ1A在癌癥方面可能發(fā)揮著重要作用。

在本研究中，肝癌組DEGs、子宮頸癌組DEGs和共有DEGs都富集到的KEGG通路包括細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用通路和焦點(diǎn)黏附通路。細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間的特異性相互作用主要由整合素這種跨膜分子介導(dǎo)。整合素是主要的細(xì)胞黏附跨膜受體，作為細(xì)胞外基質(zhì)-細(xì)胞骨架連接體和轉(zhuǎn)換器，在細(xì)胞與其環(huán)境之間的信號(hào)傳遞中發(fā)揮著多方面的作用。除此之外，許多腫瘤研究發(fā)現(xiàn)整合素在腫瘤細(xì)胞遷移、黏附等生物學(xué)功能中發(fā)揮著重要作用[12-13]。焦點(diǎn)黏附位于上皮基底表面，由整合素、鈣蛋白、肌動(dòng)蛋白等多個(gè)蛋白質(zhì)組成。焦點(diǎn)黏附可以將周圍的細(xì)胞外基質(zhì)與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架整合在一起，是細(xì)胞與細(xì)胞外部基質(zhì)之間的一個(gè)重要連接點(diǎn)[14]。焦點(diǎn)黏附的形成和穩(wěn)定對(duì)于細(xì)胞增殖、遷移、分化、凋亡等過程都具有重要作用[14-16]。另外，肝癌組DEGs和子宮頸癌組DEGs都顯著富集的GO條目包括細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞黏附。本課題組之前的研究也表明，在肝癌和子宮頸癌細(xì)胞中敲低BAZ1A表達(dá)，肝癌細(xì)胞和子宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力減弱和凋亡水平升高。

本研究對(duì)肝癌組、子宮頸癌組以及共有DEGs進(jìn)行了PPI網(wǎng)絡(luò)分析，其中，在DEGs中處于核心位置的CD44是上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，是一種分布廣泛的細(xì)胞表面跨膜糖蛋白。CD44參與了多種細(xì)胞功能，包括增殖、遷移、侵襲和代謝等[17-18]。CD44可以黏附在細(xì)胞外基質(zhì)上，通過其胞外結(jié)構(gòu)域與透明質(zhì)酸和膠原蛋白結(jié)合，在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移中起到重要作用[19]。另外，CD44通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、黏附等多種功能，促進(jìn)病理性血管生成及其相關(guān)疾病的發(fā)展[20]。

綜上所述，在本研究中通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析，得出BAZ1A能夠通過細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用、焦點(diǎn)黏附等通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡，為闡明肝癌和子宮頸癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的思路。