葉才博,陳祥宇,杜杰勇,楊玉彬,舒尊鵬,張莉

(1. 廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,廣東 廣州 510080;2. 廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院,廣東 廣州 510006;3.北京師范大學(xué)文理學(xué)院,廣東 珠海 519085)

血管老化是指血管的結(jié)構(gòu)和功能隨著年齡增長(zhǎng)而發(fā)生退行性改變的過程,是機(jī)體衰老的重要表現(xiàn)[1]。血管衰老能夠增加心血管疾病(Cardiovascular diseases,CVD)發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn),嚴(yán)重影響我國(guó)老年人群的健康狀況[2]。延緩血管衰老是降低CVD發(fā)生和發(fā)展的重要舉措,目前僅熱量限制具有明確的延緩衰老作用[3],因此,探尋延緩血管衰老的機(jī)制和有效措施已成為全社會(huì)研究的熱點(diǎn)。

中醫(yī)在抗衰老方面有著豐富經(jīng)驗(yàn),形成了獨(dú)具特色的方法和理論體系。中醫(yī)理論認(rèn)為,生命的本質(zhì)在于氣血,人體生長(zhǎng)壯老的過程都離不開氣血的變化?！皻馓撗觥笔侨梭w衰老的本質(zhì)之一[4],機(jī)體氣虛無力行血致血行瘀滯,氣血運(yùn)行不暢,加速機(jī)體衰老,通過益氣活血法可糾正氣虛血瘀之證,發(fā)揮延緩衰老的作用[5-6]。補(bǔ)陽(yáng)還五湯是益氣活血的經(jīng)典名方,能通過促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)損傷血管內(nèi)皮[7],清除自由基[8],改善免疫功能[9]等延緩衰老。研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)陽(yáng)還五湯及補(bǔ)陽(yáng)還五湯苷類組分能夠通過促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、遷移及成管等途徑發(fā)揮抗內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老的作用[10]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯能通過上調(diào)去乙酰化酶(Sirtuin1,SIRT1)表達(dá)抑制衰老相關(guān)血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)的遷移和侵襲[11],通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶Ⅱ(Matrix Metalloproteinase 2,MMP-2)延緩VSMCs衰老[12],然而其潛在作用機(jī)制暫未明了。

microRNAs(miRNAs)是目前研究較多的非編碼RNAs,通過堿基配對(duì)與靶基因形成部分共價(jià)結(jié)合,減少靶基因翻譯表達(dá)并降低其穩(wěn)定性,即轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,調(diào)節(jié)衰老相關(guān)關(guān)鍵分子通路中的基因和蛋白表達(dá),最終影響衰老引起的各種CVD的發(fā)生與發(fā)展[13]。自噬可通過降解受損蛋白質(zhì)和細(xì)胞器等參與衰老及衰老相關(guān)CVD的病理過程[14-15]。課題組前期miRNAs測(cè)序證實(shí)microRNA-665(miR-665)是年輕和衰老VSMCs中差異表達(dá)最顯著的miRNA[16],能通過調(diào)節(jié)下游靶基因lncRNA GAS5/Syndecan 1延緩VSMCs衰老[16-17]。研究發(fā)現(xiàn),miR-665與DNA損傷調(diào)節(jié)自噬調(diào)節(jié)因子1(DNA damage-regulated autophagy modulator1,DRAM1)存在結(jié)合位點(diǎn)[18],DRAM1能夠通過p53/DRAM1途徑誘導(dǎo)自噬溶酶體聚集,激活細(xì)胞自噬[19]。因此,miR-665可能通過靶向調(diào)節(jié)DRAM1調(diào)控自噬,進(jìn)而調(diào)控衰老。

研究表明,雌激素對(duì)青壯年雌性大鼠VSMCs具有抗應(yīng)激性衰老效應(yīng)[20],雌激素缺乏能促進(jìn)心肌細(xì)胞衰老[21]。因此,為了降低雌激素對(duì)自然衰老模型的影響,本研究采用自然衰老的雄性SD大鼠進(jìn)行補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù),檢測(cè)血管衰老、miR-665基因及自噬相關(guān)蛋白表達(dá),探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯延緩血管衰老的作用及自噬相關(guān)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制,為尋找并干預(yù)衰老相關(guān)的miRNAs及其調(diào)節(jié)的特定靶基因提供新的思路。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6只4周齡和30只20月齡無特定病原體(Specifiled pathogen free,SPF)級(jí)雄性SD大鼠,購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2018-0002,飼養(yǎng)環(huán)境:室溫為20～26 ℃,相對(duì)濕度為40%～70%,12 h晝夜更替,自由進(jìn)食和飲水。本研究經(jīng)廣東藥科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理編號(hào):GYFYGZR2017008),并且遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)法以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則。

1.2 細(xì)胞與試劑

293T細(xì)胞(ATCC,美國(guó));大鼠衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(Senescence associated β-galactosidase,SA-β-Gal)ELISA試劑盒(MM-71042R1,江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司);大鼠晚期糖基化終產(chǎn)物(Advanced glycation end products,AGEs)ELISA試劑盒(MM-0776R1,江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司);HE染液(G1005)、Masson三色染色液(G1006)和EVG染液(G1042)購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司;BestarTMqPCR RT kit(2220)、BestarTMqPCR MasterMix(2043)購(gòu)自DBI公司;雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒(E1910,Promega);miR-665 mimic和miR-NC由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成。抗體:DRAM1(GTX85483,美國(guó)Gene Tex公司);p16(WL01418,沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司);LC3Ⅱ/Ⅰ(83506,美國(guó)CST公司);p62(GB111998,武漢賽維爾生物科技有限公司);Beclin1(PB9076,博士德生物科技有限公司);GAPDH(60004-1-Ig)和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠/兔IgG(SA00001-1/SA00001-2)購(gòu)自Proteintech公司。

1.3 補(bǔ)陽(yáng)還五湯制備

補(bǔ)陽(yáng)還五湯方劑為黃芪四兩(120 g),當(dāng)歸尾二錢(6 g),赤芍一錢半(4.5 g),地龍一錢(3 g),川芎一錢(3 g),紅花一錢(3 g),桃仁一錢(3 g),購(gòu)自廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院。生藥按組分劑量配制混合,蒸餾水浸泡30 min,先后煎煮2次,取2次濾液合并,80 ℃水浴蒸發(fā)濃縮至每1 mL含原生藥材2 g,4 ℃冰箱保存,用前充分搖勻并加熱到室溫。

2 方法

2.1 分組與給藥

將6只4周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠設(shè)為年輕組,將30只20月齡SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組:衰老組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組和白藜蘆醇組,每組6只。補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中、高劑量組大鼠分別給予補(bǔ)陽(yáng)還五湯9.25、18.5、37.0 g·kg-1灌胃(分別相當(dāng)于成人用生藥量的0.5、1、2倍),白藜蘆醇組大鼠給予白藜蘆醇80 mg·kg-1劑量腹腔注射,用于驗(yàn)證補(bǔ)陽(yáng)還五湯延緩血管衰老的有效性。每日1次(補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組大鼠分2次灌胃),連續(xù)給藥14周。年輕組與衰老組大鼠灌胃等量的生理鹽水。根據(jù)倫理要求對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉后,打開胸腔,選取主動(dòng)脈弓以下長(zhǎng)約2 cm的胸主動(dòng)脈血管組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 ELISA法檢測(cè)血管SA-β-Gal活性和AGEs水平

根據(jù)ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作,約1 g大鼠胸主動(dòng)脈血管組織充分勻漿,2 000 r·min-1離心20 min后取上清液,用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中大鼠血管SA-β-Gal活性和AGEs水平。

2.3 血管組織HE、Masson和EVG染色

剪取主動(dòng)脈弓以下約0.5 cm胸主動(dòng)脈,8%中性福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋,切片厚度為4 μm。選取圓形或近似圓形的切片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。HE染色:石蠟切片脫蠟至水,HE染液染色,中性樹脂封片后顯微鏡下觀察血管組織結(jié)構(gòu)。Masson染色:石蠟切片脫蠟至水,Masson染液染色,1%醋酸漂洗分化,中性樹脂封片后顯微鏡下觀察血管組織膠原纖維沉積。EVG染色:石蠟切片脫蠟至水,EVG染液染色,三氯化鐵進(jìn)行背景分化,VG染液復(fù)染,中性樹脂封片后顯微鏡下觀察血管組織彈力纖維結(jié)構(gòu)。

2.4 qPCR檢測(cè)miR-665表達(dá)水平

根據(jù)說明書用TRIzol從大鼠胸主動(dòng)脈血管組織中提取總RNA。紫外分光光度儀上測(cè)RNA濃度,以1 μg總RNA為模板,按照Bestar qPCR RT Kit說明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,總體系為10 μL,合成cDNA第一鏈。采用染料法(SYBR Green Ⅰ)在Agilent StrataGene Mx3000P qPCR儀中進(jìn)行qPCR分析,U6用作內(nèi)參。數(shù)據(jù)按照2-ΔΔCt方法處理。所有引物由引物設(shè)計(jì)軟件3.0(Applied Biosystems)設(shè)計(jì)并由Invitrogen公司合成,序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.5 透射電鏡觀察血管自噬小體

大鼠胸主動(dòng)脈加入3%戊二醛固定4 h以上,PBS漂洗3次,每次10 min,4 ℃冰箱過夜。然后用1%鋨酸固定2 h,PBS漂洗3次,每次10 min,4 ℃冰箱過夜。不同濃度乙醇依次梯度脫水,無水丙酮和環(huán)氧樹脂滲透、包埋,烘箱內(nèi)烘烤固化,超薄切片機(jī)切片,3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色后進(jìn)行透射電鏡觀察。

2.6 雙熒光素酶報(bào)告

設(shè)計(jì)及合成包含miR-665結(jié)合位點(diǎn)的靶基因3′-UTR片段,將其插入至含熒光素報(bào)告基因的pmirGLO載體(Promega)中,構(gòu)建成DRAM1報(bào)告質(zhì)粒(野生型)。同時(shí)構(gòu)建DRAM1突變型報(bào)告質(zhì)粒。293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1天傳代至96孔板,第2天細(xì)胞生長(zhǎng)約50%～60%,用Lipofectamin 2000進(jìn)行miR-665 mimic和DRAM1報(bào)告質(zhì)粒聯(lián)合轉(zhuǎn)染。48 h后用雙熒光酶素報(bào)告系統(tǒng)(Promege, Madison,WI)進(jìn)行分析。

2.7 Western blot檢測(cè)p16、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、p62和DRAM1蛋白表達(dá)

用PBS沖洗胸主動(dòng)脈,將血管移入勻漿器,加入含蛋白酶抑制劑的組織裂解液進(jìn)行研磨,4 ℃條件下14 000 r·min-1離心10 min,取上清即組織總蛋白。15～30 μg組織蛋白樣品,12%SDS-PAGE電泳,100 V轉(zhuǎn)移1 h至硝酸纖維素薄膜,放入封閉液中37 ℃封閉1 h;一抗(p16 1∶500;Beclin1 1∶1 200;p62 1∶800;LC3Ⅱ/Ⅰ 1∶1 000;DRAM1 1∶1 000;GAPDH 1∶5 000)4 ℃過夜。反復(fù)洗膜后,用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠/兔IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h,洗膜后,滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑,放入化學(xué)發(fā)光儀顯影,用圖像分析測(cè)定各條帶灰度值作定量分析。

2.8 免疫組化法檢測(cè)DRAM1蛋白表達(dá)

大鼠胸主動(dòng)脈用4%多聚甲醛固定后常規(guī)脫蠟、梯度乙醇脫水、抗原修復(fù)及阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。組織切片用3%BSA室溫封閉30 min,加入DRAM1抗體(1∶400)孵育,4 ℃過夜。PBS漂洗3次后滴加生物素標(biāo)記二抗,室溫孵育50 min,PBS漂洗后滴加DAB顯色液,室溫孵育10 min。蘇木素復(fù)染3 min,1%鹽酸乙醇分化、氨水返藍(lán)、脫水封片、拍照。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯延緩血管衰老

SA-β-Gal的數(shù)量和大小隨著細(xì)胞衰老不斷累積,其活性與衰老程度緊密相關(guān),為體內(nèi)外鑒定細(xì)胞衰老的生物標(biāo)志物[22]。AGEs是非酶糖基化反應(yīng)的終產(chǎn)物,能直接反映衰老狀態(tài)和體內(nèi)糖基化水平,是檢測(cè)衰老的重要指標(biāo)[23]。p16的激活為細(xì)胞衰老發(fā)生的重要標(biāo)志,為細(xì)胞衰老的關(guān)鍵效應(yīng)物[24]。如圖1所示,與年輕組相比,衰老組大鼠血管SA-β-Gal活性、AGEs水平和p16蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01);與衰老組相比,不同劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯和白藜蘆醇干預(yù)均可使SA-β-Gal活性明顯下降(P<0.01),AGEs水平和p16蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05,P<0.01)。血管的組織形態(tài)也會(huì)隨著衰老而改變。如圖2所示,HE染色結(jié)果顯示,年輕組大鼠血管內(nèi)膜光滑,中膜細(xì)胞排列整齊,各層結(jié)構(gòu)完整清楚,形態(tài)分布規(guī)則;與年輕組相比,衰老組大鼠血管組織排列紊亂,中膜明顯增厚(P<0.01);與衰老組相比,不同劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和白藜蘆醇組大鼠血管組織排列相對(duì)整齊,中膜增厚程度明顯減輕,以補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量、高劑量及白藜蘆醇組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。Masson染色結(jié)果顯示,年輕組大鼠血管內(nèi)膜結(jié)構(gòu)平整,平滑肌細(xì)胞排列規(guī)則;與年輕組相比,衰老組大鼠血管平滑肌細(xì)胞增生并排列紊亂,膠原纖維明顯增加(P<0.01);與衰老組相比,不同劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯和白藜蘆醇干預(yù)明顯降低大鼠血管膠原纖維,以補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量、高劑量和白藜蘆醇組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。EVG染色結(jié)果顯示,年輕組大鼠血管彈力纖維排列整齊有序;與年輕組相比,衰老組大鼠血管彈力纖維出現(xiàn)明顯斷裂和排列紊亂;與衰老組相比,不同劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯和白藜蘆醇干預(yù)能減少大鼠血管彈力纖維的斷裂和紊亂。結(jié)果表明,補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠降低血管中SA-β-Gal活性、AGEs水平和p16蛋白表達(dá),改善血管形態(tài)和彈力纖維結(jié)構(gòu),減少血管組織膠原纖維,有效延緩血管衰老。

注:與年輕組比較,**P<0.01;與衰老組比較,圖1 各組大鼠血管組織SA-β-Gal活性、AGEs水平(n=5)和p16蛋白表達(dá)(n=3)Fig.1 SA-β-Gal activity, AGEs levels (n=5) and p16 protein expression (n=3) in vascular tissues of rats in each group

注:與年輕組比較,**P<0.01;與衰老組比較,圖2 各組大鼠血管組織HE、Masson和EVG染色Fig.2 HE, Masson, and EVG staining in vascular tissues of rats in each group

3.2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯下調(diào)衰老血管中miR-665基因表達(dá)

課題組前期miRNA芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-665是年輕和衰老VSMCs最差異表達(dá)的miRNA[16]。體內(nèi)qPCR檢測(cè)結(jié)果如圖3所示,與年輕組相比,衰老組大鼠血管中miR-665表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01);與衰老組相比,補(bǔ)陽(yáng)還五湯呈劑量依賴性下調(diào)血管中miR-665的表達(dá),以高劑量組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

注:與年輕組比較,**P<0.01;與衰老組比較,圖3 各組大鼠血管組織miR-665表達(dá)Fig.3 Expression of miR-665 in vascular tissues of rats in each group

3.3 補(bǔ)陽(yáng)還五湯增強(qiáng)衰老血管自噬水平

自噬在衰老進(jìn)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[25],LC3、Beclin1和p62參與了自噬發(fā)生的起始、延長(zhǎng)、成熟和降解,是判斷自噬過程的關(guān)鍵指標(biāo)[26]。如圖4所示,透射電鏡結(jié)果顯示,與年輕組相比,衰老組大鼠血管內(nèi)自噬小體數(shù)量明顯減少;與衰老組相比,補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)后血管內(nèi)自噬小體數(shù)量增加,以高劑量組增加明顯。Western blot結(jié)果顯示,與年輕組相比,衰老組大鼠血管中LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.01),p62蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01);與衰老組相比,不同劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯明顯上調(diào)Beclin1蛋白表達(dá)(P<0.05,P<0.01),中劑量和高劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯顯著上調(diào)LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)(P<0.01),下調(diào)p62蛋白表達(dá)(P<0.01)。

注:紅色箭頭代表自噬小體。與年輕組比較,**P<0.01;與衰老組比較,圖4 各組大鼠血管組織自噬小體數(shù)量及LC3、Beclin1、p62蛋白表達(dá)Fig.4 The number of autophagosomes and the protein expressions of LC3,Beclin1 and p62 in vascular tissues of rats in each group

3.4 miR-665靶向DRAM1基因并負(fù)調(diào)控DRAM1蛋白表達(dá)

miRNAs通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白/因子調(diào)控自噬通路是衰老相關(guān)調(diào)控的重要機(jī)制[27]。如圖5所示,TargetScan預(yù)測(cè)miR-665與自噬相關(guān)基因DRAM1的3'-UTR存在結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶基因報(bào)告發(fā)現(xiàn),與293T細(xì)胞聯(lián)合轉(zhuǎn)染miR-NC和野生型DRAM1報(bào)告質(zhì)粒組相比,聯(lián)合轉(zhuǎn)染miR-665 mimic和野生型DRAM1報(bào)告質(zhì)粒組的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01);293T細(xì)胞聯(lián)合轉(zhuǎn)染miR-NC和突變型DRAM1報(bào)告質(zhì)粒組與聯(lián)合轉(zhuǎn)染miR-665 mimic和突變型DRAM1報(bào)告質(zhì)粒組相比,熒光素酶活性無顯著差異。同時(shí),293T細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-665 mimic,Western blot檢測(cè)DRAM1蛋白表達(dá)水平,與miR-NC相比,miR-665 mimic可使DRAM1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。

注:與miR-NC比較,圖5 miR-665對(duì)下游自噬相關(guān)蛋白DRAM1的影響Fig.5 Effect of miR-665 on the downstream autophagy-related protein DRAM1

3.5 補(bǔ)陽(yáng)還五湯上調(diào)衰老血管DRAM1蛋白表達(dá)

為了觀察補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)miR-665下游自噬相關(guān)蛋白DRAM1表達(dá)的影響,如圖6所示,免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,與年輕組相比,衰老組大鼠血管中DRAM1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01);與衰老組相比,補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)呈劑量依賴性上調(diào)DRAM1蛋白表達(dá)水平,以高劑量組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blot分析結(jié)果與免疫組織化學(xué)結(jié)果一致,衰老能夠降低大鼠血管中DRAM1蛋白表達(dá)(P<0.01),補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)上調(diào)衰老大鼠血管中DRAM1蛋白表達(dá),以高劑量組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注:與年輕組比較,**P<0.01;與衰老組比較,圖6 各組大鼠血管組織DRAM1蛋白表達(dá)Fig.6 Expression of DRAM1 protein in vascular tissues of rats in each group

4 討論

隨著我國(guó)人口老齡化程度的不斷加深,衰老引起的CVD逐年增加,干預(yù)血管衰老迫在眉睫。中醫(yī)理論認(rèn)為,人體的生長(zhǎng)壯老反映氣血盛衰的過程,氣血失調(diào)、氣虛血瘀是人體衰老的主要機(jī)制[28]。清代著名醫(yī)家王清任總結(jié)發(fā)揮對(duì)氣虛血瘀致衰的認(rèn)識(shí),首創(chuàng)益氣活血法以及益氣活血名方補(bǔ)陽(yáng)還五湯,使后世醫(yī)家通過益氣活血法延緩衰老有理可循[5]。補(bǔ)陽(yáng)還五湯重用黃芪補(bǔ)益元?dú)庵?當(dāng)歸尾活血而不傷血,桃仁、紅花、赤芍、川芎活血祛瘀,地龍通經(jīng)活絡(luò),全方重在補(bǔ)氣以活血,通補(bǔ)兼施,祛瘀而不傷正。藥理研究發(fā)現(xiàn),黃芪-當(dāng)歸配伍[29]、羥基紅花黃色素A[30]和川芎[31]可通過提高抗氧化能力延緩衰老。課題組前期研究證實(shí)補(bǔ)陽(yáng)還五湯可抑制VSMCs的年齡相關(guān)遷移和侵襲[11],延緩VSMCs衰老[12]。本研究進(jìn)一步證實(shí)補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠降低衰老大鼠血管中SA-β-Gal活性、AGEs水平和p16蛋白表達(dá),改善血管形態(tài)和彈力纖維結(jié)構(gòu),減少血管組織膠原纖維,延緩血管衰老。

研究發(fā)現(xiàn),心力衰竭患者血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-665表達(dá)上調(diào),破壞冠狀動(dòng)脈微血管生成,過表達(dá)miR-665能夠增加血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[32];缺血再灌注小鼠心肌組織中miR-665表達(dá)上調(diào),過表達(dá)miR-665能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及增加線粒體氧自由基水平[33]。課題組前期的體外研究證實(shí),在衰老VSMCs中miR-665表達(dá)水平上調(diào)[16-17],本研究通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),衰老血管組織中miR-665表達(dá)水平同樣出現(xiàn)上調(diào),補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)能夠降低衰老大鼠血管miR-665的表達(dá),說明miR-665表達(dá)上調(diào)加速衰老進(jìn)程,補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠逆轉(zhuǎn)衰老引起的miR-665表達(dá)延緩血管衰老。

自噬是真核細(xì)胞在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下,受損細(xì)胞器和大分子物質(zhì)通過與溶酶體融合形成自噬小體,最終被及時(shí)清除的過程[34]。自噬發(fā)生時(shí),Beclin1招募胞漿中的自噬相關(guān)的蛋白,與位于自噬胞膜表面的LC3相互作用,參與形成自噬小體[35]。p62是自噬過程中的一種降解產(chǎn)物,當(dāng)p62被降解時(shí)表示自噬被激活[36]。衰老信號(hào)抑制細(xì)胞自噬,擾亂細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),激活衰老相關(guān)通路,導(dǎo)致衰老的發(fā)生[37]。研究發(fā)現(xiàn),心臟中的自噬水平隨著年齡增長(zhǎng)而降低,增強(qiáng)自噬能夠延緩心肌細(xì)胞衰老[38];在小鼠和人類肌肉中,LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而下降[39]。本研究結(jié)果顯示,衰老大鼠血管內(nèi)自噬小體數(shù)量減少,LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表達(dá)明顯下調(diào),p62蛋白表達(dá)明顯上調(diào),說明血管衰老伴隨著細(xì)胞自噬的受損。補(bǔ)陽(yáng)還五湯具有調(diào)控自噬的作用,能促進(jìn)缺血腦組織自噬發(fā)生[40-41]。本研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠增加血管組織自噬小體數(shù)量,上調(diào)LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表達(dá),下調(diào)p62蛋白表達(dá),表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠通過增強(qiáng)細(xì)胞自噬延緩血管衰老。

miRNAs能夠調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因或蛋白表達(dá)調(diào)控自噬通路[42-43]。研究發(fā)現(xiàn),miR-665與自噬關(guān)系密切,抑制真菌性角膜炎中miR-665-3p的表達(dá)可增加ATG5蛋白表達(dá),上調(diào)自噬并減輕炎癥[44]。miR-665在腸缺血再灌注損傷小鼠腸道組織中表達(dá)增加,自噬流減少;靶向抑制miR-665能夠下調(diào)ATG4B的表達(dá),恢復(fù)自噬流,緩解炎癥和減輕過度凋亡[45],說明miR-665的表達(dá)下調(diào)促進(jìn)下游自噬相關(guān)蛋白表達(dá),誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。本研究利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)出miR-665靶定下游自噬相關(guān)因子DRAM1,同時(shí)采用雙熒光素酶報(bào)告證實(shí)了miR-665與DRAM1能夠直接靶定,過表達(dá)miR-665后發(fā)現(xiàn)DRAM1蛋白表達(dá)下調(diào),表明miR-665靶向負(fù)調(diào)控DRAM1蛋白的表達(dá)。DRAM1能夠增加溶酶體酸化,促使溶酶體與自噬小體融合以及溶酶體中p62的降解,增加自噬小體的清除,增強(qiáng)自噬[46];過表達(dá)DRAM1能夠促進(jìn)自噬小體的形成,增加細(xì)胞質(zhì)中LC3的分布[47]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),衰老組大鼠血管中DRAM1蛋白表達(dá)水平下調(diào),補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠逆轉(zhuǎn)衰老引起的DRAM1表達(dá)下調(diào)且呈劑量依賴性增加其表達(dá)。所有的結(jié)果表明,衰老能夠上調(diào)miR-665表達(dá),抑制DRAM1蛋白表達(dá),減輕細(xì)胞自噬;補(bǔ)陽(yáng)還五湯通過抑制血管miR-665表達(dá)促進(jìn)DRAM1蛋白表達(dá),增強(qiáng)細(xì)胞自噬,延緩血管衰老(圖7)。

圖7 補(bǔ)陽(yáng)還五湯延緩血管衰老的可能機(jī)制Fig.7 Possible mechanism of Buyang Huanwu Decoction delaying vascular aging

綜上所述,本研究采用雄性SD大鼠自然衰老模型,清楚揭示了補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠明顯延緩血管衰老,這一過程伴隨自噬水平的改善。補(bǔ)陽(yáng)還五湯可能是通過靶向抑制miR-665促進(jìn)DRAM1蛋白表達(dá),改善血管自噬,達(dá)到延緩血管衰老的作用。目前,關(guān)于延緩血管衰老、降低衰老相關(guān)的CVD風(fēng)險(xiǎn)及潛在機(jī)制的研究已大量開展,本研究表明,補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠通過自噬相關(guān)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控發(fā)揮抗衰老作用,可能成為預(yù)防及治療衰老相關(guān)CVD的藥物。