羅欣,成鵬,陸茵,2,3,韋忠紅,3

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇省中藥藥效與安全性評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023;2.江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210023;3.江蘇省中醫(yī)藥與再生醫(yī)學(xué)研究國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023)

膽汁淤積是一種由肝內(nèi)外各種原因(藥物、病毒、肝內(nèi)外膽管發(fā)育異常等)所致的膽汁形成、分泌和(或)排泄障礙,使膽汁不能正常代謝而淤積于肝膽系統(tǒng)的疾病,膽汁酸特別是具有肝細(xì)胞毒性的疏水性膽汁酸在肝臟的蓄積是膽汁淤積性肝損傷的重要機(jī)制[1-2]。膽汁酸的代謝過程中,約有95%的膽汁酸在腸道中被重吸收并通過門靜脈系統(tǒng)進(jìn)入肝臟,重新結(jié)合并分泌到膽汁中,實(shí)現(xiàn)肝腸循環(huán)[3]。故促進(jìn)膽汁酸的排泄從而減少其重吸收是改善膽汁淤積所致肝損傷的重要策略。目前,熊去氧膽酸(Ursodesoxycholic acid, UDCA)已用于原發(fā)性膽汁性肝硬化的臨床治療。然而,仍然存在大量患者對UDCA治療反應(yīng)不佳,最終進(jìn)展為肝硬化和肝衰竭[4-5]。因此,迫切需要開發(fā)更為有效治療肝內(nèi)膽汁淤積的藥物。

丁香酸(Syringic acid, SA)是一種天然的酚類化合物,廣泛分布于橄欖、香料、葡萄、谷物及大青葉、石斛、馬蘭等中草藥中[6-7]。已有大量研究表明,SA具有抗氧化、抗微生物、抗炎、抗癌和保護(hù)心臟、肝臟等多種藥理作用[8-11]?，F(xiàn)有研究表明,在四氯化碳誘導(dǎo)的慢性肝損傷小鼠模型[12]中,靜脈注射SA可以顯著降低天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性和炎性細(xì)胞因子水平,改善肝臟纖維化。在結(jié)腸炎小鼠模型[8]中,SA通過調(diào)節(jié)腸道微生物組成從而保護(hù)腸黏膜屏障。然而,目前關(guān)于SA對肝內(nèi)膽汁淤積疾病的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制方面的研究較缺乏,本研究從SA對α-萘異硫氰酸酯(Alpha-nephthyl isothiocyanate, ANIT)誘導(dǎo)的膽汁淤積小鼠肝臟損傷的保護(hù)作用方面入手,基于膽汁酸代謝和腸道屏障功能探討其作用機(jī)制,為膽汁淤積肝損傷治療提供潛在藥物。

1 材料

1.1 動物

6周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠20只,體質(zhì)量(20±2)g,購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司,實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證:SCXK(滬)2017-0005,實(shí)驗(yàn)過程中所有操作均符合南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會規(guī)定,動物倫理號:202303A068。常規(guī)飼養(yǎng):自由飲食飲水,溫度(23±2) ℃,相對濕度(53±2)%,12 h黑暗光照周期,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物與試劑

丁香酸購自上海源葉生物科技有限公司(貨號:530-57-4);ANIT購自Sigma-Aldrich(貨號:N4525-10g);橄欖油購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(貨號:O108686-500mL);AST試劑盒(貨號:C010-2-1)、ALT試劑盒(貨號:C009-2-1)、ALP試劑盒(貨號:A059-2-2)、總膽紅素(TBIL)試劑盒(貨號:C019-1-1)、間接膽紅素(DBIL)試劑盒(貨號:C019-2-1)購自南京建成生物工程研究所;HE染色液購自雷根生物科技有限公司(貨號:DH0006);小鼠總膽汁酸檢測試劑盒購自Crystal Chem(批號:#80470);Hiscript RT Super Mix for qPCR(貨號:R323-01)與ChamQ SYBR qPCR Master Mix(貨號:Q331-02)購自諾唯贊生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

Mantra 1.0.1型組織切片成像系統(tǒng)(PE公司);1510型全波長酶標(biāo)儀(Thermo Fisher公司);AllegraX-30R型高速冷凍離心機(jī)(BECKMAN COULTER公司);BSA224S-CW分析天平(Sartorius公司);ABI-7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems life公司);HF-X質(zhì)譜儀(Thermo QE公司)。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥

20只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為對照組,模型組,丁香酸低、高劑量(70、140 mg·kg-1)組,每組5只。連續(xù)灌胃給藥7 d。對照組和模型組灌胃相應(yīng)體積的生理鹽水。第5天灌胃給藥2 h后,除對照組給予空白橄欖油外,其余各組動物均腹腔注射62.5 mg·kg-1ANIT的橄欖油進(jìn)行造模,記錄小鼠的體質(zhì)量變化。

2.2 臟器指數(shù)計(jì)算

分析天平稱量記錄小鼠肝質(zhì)量,根據(jù)公式對每只小鼠臟器指數(shù)進(jìn)行計(jì)算。臟器指數(shù)=肝質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

2.3 肝功能指標(biāo)及膽汁酸含量檢測

按照試劑盒說明書檢測小鼠血清中ALT、AST、ALP活性,DBIL、TBIL水平及肝臟和糞便中的膽汁酸含量。

2.4 HE染色觀察組織病理變化

小鼠組織用4%多聚甲醛固定后,乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后切成4 μm切片。隨后,脫蠟切片水洗后進(jìn)行HE染色,顯微鏡下觀察各組組織病理變化。

機(jī)制創(chuàng)新的原點(diǎn)意義可以體現(xiàn)在方方面面，例如，基于市場自發(fā)秩序，在中國這樣的大國內(nèi)部，不同地區(qū)之間資源稟賦和發(fā)展水平差異巨大，各地間完全可以通過合作，形成相互產(chǎn)業(yè)配套，實(shí)現(xiàn)最優(yōu)產(chǎn)出水平。

2.5 LC-MS/MS非靶向代謝組學(xué)分析

2.5.1 代謝物提取 吸取每例樣品100 μL,加入400 μL甲醇(-40 ℃預(yù)冷),渦旋10 min(4 ℃,2 000 r·min-1),離心5 min(12 000 r·min-1,4 ℃),取上清300 μL,真空濃縮至干。加入100 μL甲醇水溶液(甲醇∶水=1∶4,v/v)復(fù)溶,渦旋3 min(4 ℃,2 000 r·min-1),離心5 min(12 000 r·min-1,4 ℃),取上清進(jìn)行進(jìn)樣分析。

2.5.2 色譜分離 整個分析過程中樣品置于8 ℃自動進(jìn)樣器中,使用HSS T3色譜柱進(jìn)行分離。其中進(jìn)樣量5 μL,柱溫40 ℃,流速0.25 mL·min-1;色譜流動相A:5 mmol·L-1甲酸銨水,B:乙腈;C:0.1%甲酸水,D:0.1%甲酸乙腈;色譜梯度洗脫程序如下。①負(fù)離子:0～1 min,2%B;1～9 min,2%→50%B;9～12 min,50%→98%B;12～13.5 min,98%B;13.5～14 min,98%→2%B;14～17 min,2%B。②正離子:0～1 min,2%D;1～9 min,2%→50%D;9～12 min,50%→98%D;12～13.5 min,98%D;13.5～14 min,98%→2%D;14～17 min,2%D。樣本隊(duì)列中插入QC樣品,用于監(jiān)測和評價系統(tǒng)的穩(wěn)定性及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。

2.5.3 質(zhì)譜采集 每例樣品分別采用電噴霧電離(ESI)進(jìn)行正離子和負(fù)離子模式檢測。質(zhì)譜條件:電離源:ESI離子源;鞘氣流速:30;輔助氣:10;噴霧電壓:2.5 kV(+)/2.5 kV(-); S-Lens RF:50;毛細(xì)管溫度:325 ℃;輔助氣溫度:300 ℃;二級碰撞能量(NCE):30;隔離窗口m/z1.5,Top N=8。掃描范圍:m/z70～1 050,掃描方式:正、負(fù)離子分別掃描。

2.5.4 代謝物鑒定 原始數(shù)據(jù)經(jīng)Compound Discovery程序進(jìn)行峰對齊、保留時間校正和提取峰面積。代謝物結(jié)構(gòu)鑒定使用Compound Discovery程序經(jīng)精確質(zhì)量數(shù)匹配(<10×10-6)和二級譜圖匹配的方式,檢索HMDB、KEGG、METLIN等數(shù)據(jù)庫注釋物質(zhì)。

2.6 qPCR檢測結(jié)腸緊密連接蛋白表達(dá)

稱取80 mg結(jié)腸組織加入研磨管,加1 mL TRIzol裂解至組織消失。取勻漿每管加入200 μL氯仿,劇烈振搖15 s,室溫靜置3 min,12 000 r·min-1,4 ℃,離心15 min。吸取上層水相加入等量異丙醇,來回顛倒,室溫靜置3 min,12 000 r·min-1,4 ℃,離心15 min。棄上清,1 mL 75%乙醇洗滌,7 500 r·min-1,4 ℃離心10 min。棄上清,置于通風(fēng)櫥內(nèi)干燥至透明。加入30 μL DEPC水溶解RNA,55 ℃孵育10 min。Nano DropTMOne/One C檢測RNA濃度及純度,將樣本稀釋為500 g·L-1。按試劑盒說明逆轉(zhuǎn)成cDNA,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見表1,點(diǎn)板,上機(jī)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 丁香酸對膽汁淤積小鼠肝臟指數(shù)的影響

如表2所示,與對照組相比,模型組小鼠肝臟指數(shù)顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,SA低劑量和高劑量組肝臟指數(shù)顯著降低(P<0.01),提示丁香酸緩解了ANIT小鼠肝臟的水腫情況。

表2 丁香酸對ANIT小鼠肝臟指數(shù)的影響Table 2 Effect of syringic acid on liver index

3.2 丁香酸對膽汁淤積小鼠肝功能的影響

注:與對照組比較,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001;與模型組比較,圖1 丁香酸對ANIT小鼠肝功能的影響Fig.1 Effect of syringic acid on liver function in ANIT mice

3.3 丁香酸對膽汁淤積小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響

如圖2所示,對照組肝組織結(jié)構(gòu)正常,肝細(xì)胞排列整齊,肝細(xì)胞間肝竇明顯清晰,無明顯組織病理學(xué)損傷。模型組小鼠肝組織明顯多處肝細(xì)胞腫脹、局灶性壞死,匯管區(qū)及肝竇伴大量炎性細(xì)胞浸潤。與模型組相比,丁香酸組小鼠肝細(xì)胞排列較為緊密,形態(tài)較為正常,未見明顯壞死區(qū)域,匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤及小葉間膽管破壞明顯減弱,表明丁香酸可有效改善ANIT小鼠的肝臟損傷。

注:箭頭指向炎性浸潤。標(biāo)尺=100 μm。圖2 丁香酸對ANIT小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響Fig.2 Effect of syringic acid on pathological changes of liver tissue in ANIT mice

3.4 丁香酸對膽汁淤積小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響

如圖3所示,與對照組相比,模型組出現(xiàn)明顯淋巴細(xì)胞浸潤,隱窩形態(tài)異常且數(shù)量減少;與模型組相比,丁香酸組淋巴細(xì)胞浸潤減少,隱窩結(jié)構(gòu)趨于正常,杯狀細(xì)胞數(shù)量增加。

圖3 丁香酸對ANIT小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響(標(biāo)尺=100 μm)Fig.3 Effect of syringic acid on pathological changes of colon tissue in ANIT mice(Scale bar=100 μm)

3.5 丁香酸對膽汁淤積小鼠結(jié)腸緊密連接蛋白mRNA表達(dá)的影響

如圖4所示,與對照組相比,模型組小鼠結(jié)腸中ZO-1、Occludin、Claudin-5的mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05);與模型組相比,SA低劑量組結(jié)腸中Claudin-5的表達(dá)顯著升高(P<0.05),SA高劑量組結(jié)腸中ZO-1、Occludin、Claudin-5的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。表明ANIT小鼠的腸道上皮細(xì)胞緊密連接損傷,而丁香酸可以改善這種腸道機(jī)械屏障的損傷。

注:與對照組比較,#P<0.05;與模型組比較,圖4 丁香酸對ANIT小鼠結(jié)腸緊密連接蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of syringic acid on colonic tight junction protein expression in ANIT mice

3.6 丁香酸對小鼠血清代謝物的影響

3.6.1 代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性分析 模型組與SA高劑量組小鼠血清樣本代謝產(chǎn)物PLS-DA得分如圖5所示,2組的代謝產(chǎn)物存在明顯分離,表明其代謝產(chǎn)物間存在顯著差異。其中模型組與SA高劑量組正離子模式下參數(shù)模型(對Y變量數(shù)據(jù)集)可解釋度(R2Y)和模型可預(yù)測度(Q2)分別為0.993和0.675,負(fù)離子模式下R2Y和Q2分別為0.983和0.735,正、負(fù)離子模式數(shù)據(jù)建立的PLS-DA模型未發(fā)生過擬合,表明模型有較好的穩(wěn)定性和可靠性。

正離子模式 負(fù)離子模式圖5 模型組和丁香酸高劑量給藥組PLS-DA圖(A)及置換檢驗(yàn)圖(B)Fig.5 PLS-DA plots (A) and permutation plots (B) in model group and syringic acid high-dose dosing group

3.6.2 丁香酸給藥組調(diào)控的代謝物篩選 為了進(jìn)一步分析丁香酸治療膽汁淤積小鼠調(diào)控的代謝物,根據(jù)差異倍數(shù)FC>2或FC<0.5且P<0.05的篩選標(biāo)準(zhǔn),血清中變化的代謝產(chǎn)物用火山圖、表格進(jìn)行展示。結(jié)果表明,共篩選到40種顯著變化的代謝產(chǎn)物,其中上調(diào)代謝物11種,下調(diào)代謝物29種,包括脂質(zhì)和類脂分子、類苯類化合物和有機(jī)氮化合物等?；鹕綀D中紅色代表上調(diào)的代謝物,藍(lán)色代表下調(diào)的代謝物。其中差異倍數(shù)變化最大(|log2FC|≥5)的代謝產(chǎn)物包括膽汁酸、棕櫚酰肉堿、3-乙酰苯酚和壬酸香草酰胺。詳見表3,圖6。

表3 SA高劑量組調(diào)控的血清代謝物Table 3 Serum metabolites regulated by the SA high dose group

(續(xù)表)

圖6 小鼠血清代謝產(chǎn)物火山圖Fig.6 The volcano map of metabolites in mice serum

3.6.3 代謝產(chǎn)物通路富集分析 如圖7所示,對模型組與SA高劑量組之間的不同代謝產(chǎn)物進(jìn)行KEGG通路富集分析,主要富集的通路包括代謝通路、次生代謝物的生物合成、次級膽汁酸生物合成、膽汁分泌和脂肪酸代謝,表明丁香酸可能通過促進(jìn)膽汁酸代謝緩解膽汁淤積性肝損傷疾病的進(jìn)展。

圖7 小鼠血清代謝產(chǎn)物KEGG通路富集分析Fig.7 The KEGG pathway of metabolites in mice serum

3.7 丁香酸對膽汁淤積小鼠肝臟中總膽汁酸含量的影響

如圖8所示,與對照組相比,模型組小鼠肝臟中總膽汁酸含量顯著升高(P<0.001);與模型組相比,丁香酸組小鼠肝臟中總膽汁酸含量下降顯著(P<0.001),表明丁香酸能減少肝臟膽汁酸的堆積。

注:與對照組比較,###P<0.001;與模型組比較,圖8 丁香酸對ANIT小鼠肝臟中總膽汁酸含量的影響Fig.8 Effect of syringic acid on total bile acid concentration in liver in ANIT mice

3.8 丁香酸對膽汁淤積小鼠糞便中總膽汁酸含量的影響

如圖9所示,與模型組相比,丁香酸組小鼠糞便中總膽汁酸含量顯著升高(P<0.05,P<0.01),提示丁香酸能促進(jìn)ANIT小鼠的膽汁酸排泄從而改善其膽汁淤積性肝損傷。

注:與模型組比較,圖9 丁香酸對ANIT小鼠糞便中總膽汁酸含量的影響Fig.9 Effect of syringic acid on total bile acid concentration in feces in ANIT mice

4 討論

膽汁淤積性肝病是指膽汁肝腸循環(huán)受阻與有毒性膽酸鹽積聚引起肝毒性的一類疾病,最常用的化學(xué)造模藥物是ANIT[13]。ANIT可通過破壞膽管上皮細(xì)胞導(dǎo)致膽汁引流阻塞,也會使肝小葉間膽管周圍產(chǎn)生炎癥反應(yīng)及膽管增生、阻塞,使肝細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞變性、壞死,引起高膽紅素血癥[14]。本研究利用腹腔注射ANIT造小鼠肝內(nèi)膽汁淤積模型,避免了ANIT對胃腸道的直接損傷,且不會影響口服藥物的吸收[15]。

膽汁淤積常見的檢測指標(biāo)包括反應(yīng)肝細(xì)胞損傷的ALT與AST,黃疸診斷指標(biāo)ALP、TBIL與DBIL[16-17]。故本研究對各組小鼠血清ALT、AST、ALP活性及TBIL、DBIL水平進(jìn)行檢測,并結(jié)合肝臟病理組織的觀察。結(jié)果表明,丁香酸給藥可顯著降低ANIT小鼠血清中ALT、AST、ALP活性和TBIL、DBIL水平,減輕肝細(xì)胞局灶性壞死及炎性細(xì)胞浸潤情況,表明丁香酸可有效改善膽汁淤積小鼠膽道阻塞,減輕膽汁淤積小鼠肝細(xì)胞損傷。

腸道屏障作為腸-肝相互作用的解剖和功能基礎(chǔ),是抵御病原微生物的重要防線,在維持膽汁酸平衡中發(fā)揮重要作用。腸黏膜屏障損傷將促進(jìn)毒性微生物或抗原內(nèi)容物轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入肝臟,引發(fā)肝臟炎癥及損傷。膽汁酸具有調(diào)節(jié)肝臟代謝、塑造腸道菌群和維持腸道完整性的重要信號功能。膽汁酸信號是維持黏液層,緊密連接和腸道-血管屏障完整性的關(guān)鍵[18]。此前的研究也發(fā)現(xiàn),在肝硬化大鼠中,膽汁酸以及FXR激動劑可改善腸道屏障功能障礙和減少細(xì)菌易位[19-20]。而腸道上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的物理和生物學(xué)功能,對于維持腸道屏障至關(guān)重要,緊密連接蛋白包括Claudin、Occludin、ZO-1等共同控制著上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)過程和黏膜屏障的通透性[21]。近期一項(xiàng)研究表明,膽汁酸受體TGR5通過影響JAM-A表達(dá)和磷酸化,加強(qiáng)了膽道上皮屏障功能,從而改善膽汁淤積小鼠的肝損傷[22]。因此,本研究進(jìn)一步探討了丁香酸對于腸道屏障的影響。首先,我們對結(jié)腸組織進(jìn)行HE染色整體評價結(jié)腸損傷情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),相比于對照組,模型組小鼠結(jié)腸組織存在明顯病理損傷,丁香酸治療可以明顯改善ANIT小鼠的結(jié)腸損傷狀況。此外,qPCR驗(yàn)證了丁香酸可以促進(jìn)ANIT小鼠結(jié)腸組織中緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5 mRNA的表達(dá),表明丁香酸可以改善膽汁淤積小鼠的結(jié)腸上皮屏障損傷,這可能是丁香酸治療膽汁淤積小鼠的重要機(jī)制之一。

95%的膽汁酸通過肝腸循環(huán)維持膽汁酸池的穩(wěn)態(tài),其余的5%在腸道微生物作用下生成次級膽汁酸,并通過門脈循環(huán)重新吸收或排泄在糞便中[23]。因此,我們采用非靶向代謝組學(xué)對膽汁淤積小鼠內(nèi)源性代謝物進(jìn)行系統(tǒng)全面的分析,試圖找出丁香酸干預(yù)后調(diào)控的代謝物。結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型組和丁香酸高劑量組之間存在40個不同的代謝產(chǎn)物,其中包括11個上調(diào)和29個下調(diào)代謝物,并且脂質(zhì)分子膽汁酸和棕櫚酰肉堿在其中下調(diào)最為顯著,KEGG通路主要富集到次生代謝物的生物合成、次級膽汁酸生物合成及膽汁分泌通路,表明丁香酸可能是通過促進(jìn)膽汁酸的代謝從而改善膽汁淤積疾病。接著,我們進(jìn)一步測定了小鼠肝臟和糞便中的總膽汁酸含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)丁香酸治療后ANIT小鼠肝臟中的膽汁酸含量顯著降低,而糞便中膽汁酸含量增加,表明丁香酸促進(jìn)了膽汁淤積小鼠的膽汁酸排泄。

綜上,本研究通過建立ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積小鼠模型,發(fā)現(xiàn)丁香酸對膽汁淤積性肝損傷具有一定保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能是通過改善腸上皮屏障和促進(jìn)膽汁酸的代謝改善小鼠的肝臟損傷。