符秋雨,王飛蝦,張峰,鄭仕中,付金柏

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023;2.江蘇省中醫(yī)院藥學(xué)部,江蘇 南京 210029)

肝纖維化是病毒性肝炎、酒精或非酒精性肝病、免疫性肝病、藥物性肝病等的共同病理過程,其終末階段將發(fā)展為肝硬化、肝衰竭或肝細(xì)胞癌[1-2],嚴(yán)重威脅人類的健康與生命,然而臨床一直缺乏有效治療藥物。深入探究肝纖維化的發(fā)病機(jī)制具有重要意義[3]。在肝損傷期間,靜息的肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell,HSC)激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞后,促進(jìn)細(xì)胞增殖、合成并分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM),過量的ECM導(dǎo)致肝纖維化[4]?，F(xiàn)有的研究表明,抑制HSC活化增殖和誘導(dǎo)其凋亡是治療肝纖維化的有效途徑[5]。此外,在實(shí)驗(yàn)性纖維化逆轉(zhuǎn)過程中觀察到衰老的HSC膠原蛋白生成和增殖減少[6]。因此,誘導(dǎo)HSC衰老為肝纖維化的防治提供了新的方向[7]。

肝臟作為重要代謝器官,對機(jī)體必需的多種物質(zhì)與能量代謝過程有特異性調(diào)節(jié)作用,這也深刻影響肝臟病理變化[8]。從代謝調(diào)控的角度研究肝纖維化發(fā)病機(jī)制,有望獲得特異性強(qiáng)的藥物靶標(biāo),從而推動安全高效抗肝纖維化藥物的研發(fā)。HSC活化是一個高度依賴物質(zhì)與能量代謝的過程。有研究表明,靜息的HSC和活化的HSC之間的代謝基因具有顯著性差異,其中蛋白質(zhì)代謝是HSC活化時的主要能量來源[9]。丙氨酸-絲氨酸-半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體2(Alanine-serine-cysteine transporter 2, ASCT2)作為谷氨酰胺主要轉(zhuǎn)運(yùn)載體,具有谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)功能,是極具潛力的肝纖維化治療靶標(biāo)[10]。中藥及其提取物等具有成分復(fù)雜多樣、功能廣泛、毒性低的獨(dú)特優(yōu)勢,在抗纖維化治療方面具有巨大的潛力[11]。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ是在中藥白術(shù)中發(fā)現(xiàn)的主要生物活性成分,已被證明具有抗氧化、抗腫瘤、抗過敏反應(yīng)、抗菌作用[12]。但目前在臨床上還缺乏白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ具有抗肝纖維化作用的研究,因此,我們需要進(jìn)行大量的臨床前實(shí)驗(yàn)證明白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的抗肝纖維化作用以及機(jī)制。近期的研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ具有抗腸纖維化和腎纖維化的作用[13-14]。此外,我們課題組前期發(fā)現(xiàn)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ是ASTC2的天然抑制劑,且通過抑制ASCT2發(fā)揮抗肝纖維化的作用[15],但白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ通過抑制ASCT2促進(jìn)HSC衰老的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。因此,我們擬研究白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對ASCT2依賴性谷氨酰胺代謝誘導(dǎo)HSC衰老抗肝纖維化的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

人肝星狀細(xì)胞株LX2購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 動物實(shí)驗(yàn)

SPF級雄性ICR小鼠(18～20 g)25只, 購買于杭州醫(yī)學(xué)院,生產(chǎn)許可證號:SCXK(浙)2019-0002。動物飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,飼養(yǎng)環(huán)境控制為12 h的明暗循環(huán),溫度為22 ℃,濕度為40%～60%。本實(shí)驗(yàn)已通過南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)(倫理批號:202009A043)。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物和試劑

藥物:白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ(MedChemExPress,HY-N0203)。

試劑:玉米油(金龍魚);CCl4(上海麥克林,C805325);魚藤酮(MedChemExPress,HY-B1756);氯喹(Chloroquine,CQ,MedChemExPress,HY-17589A);MitoTracker-RedCMXRos(ThermoFisher, M7152);雙熒光mRFP-eGFP-LC3(上海漢恒);JC-1試劑盒(上海碧云天,C2006);MDA(上海貝博,BB4709)、SOD(上海貝博,BB4711)、ROS(上海碧云天,S0033)試劑盒;EdU試劑盒(上海碧云天,C0071S);β-半乳糖苷酶(β-Gal)染色試劑盒(上海碧云天,C0602);Proteostat?Aggresome detection試劑盒(AmyJet Scientific,ENZ-51035-0025)。

抗體:β-actin(武漢愛博泰克,AC026);Goat anti-rabbit-IgG-HRP(武漢三鷹,10285-1-AP);α-SMA(武漢三鷹,14395-1-AP);LC3(武漢愛博泰克,A5618);CDKN2A/P16 INK4a(武漢愛博泰克,A23882);CDKN1A/P21(武漢愛博泰克,A19094);ASCT2 siRNA(江蘇凱基);LAMP1-RFP Plasmid (上?？吕?。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

電泳儀(Bio-RAD,PP-1151);酶標(biāo)儀(BioTek,Synergy2);凝膠曝光儀(Protein Simple,721BR027843);脫色搖床(Servicebio,TSY-A);離心機(jī)(Thermo,PIC017);電子天平(Sartorius,BSA224S-CW);倒置顯微鏡(Leica,DMIL);流式細(xì)胞儀 (Beckman Coulter,CytoFLEX);激光共聚焦顯微鏡(ZEISS,Airyscan 2)。

2 方法

2.1 小鼠肝纖維化模型的建立、分組及給藥方式

30只小鼠被隨機(jī)分為5組:空白組,模型組,低、中、高劑量組,每組6只。除空白組外,小鼠按5 mL·Kg-1腹腔注射含10% CCl4玉米油溶液,每周3次,連續(xù)8周,建立肝纖維化模型。從第 4 周開始,低、中、高劑量組分別腹腔注射20、30、40 mg·kg-1白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ。給藥4周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后異氟烷吸入麻醉小鼠,眼眶取血,隨后脫頸處死并取完整肝臟,將肝臟分為兩部分:第一部分用甲醛固定,第二部分在-80 ℃冷凍保存過夜。

2.2 組織病理學(xué)檢測

通過對肝組織樣本依次進(jìn)行石蠟包埋、切片、固定,接著在一系列分級的乙醇溶液中進(jìn)行脫水處理。觀察肝組織結(jié)構(gòu)及膠原沉積使用了HE、Masson、Sirius Red染色方法。最后使用倒置顯微鏡觀察和拍照。

酒店后場管理人員區(qū)域的溫度舒適性沒有前場要求高，從成本的角度考慮，可以采用非聯(lián)網(wǎng)型溫控面板，直接在本地控制即可滿足要求，若某些酒管需要遠(yuǎn)程控制，可以采用非聯(lián)網(wǎng)型溫控面板+BA樓控集中控制。

2.3 免疫組化

通過石蠟包埋肝組織樣本,然后按 4 μm 厚度對組織進(jìn)行切片。肝臟被快速固定在4%多聚甲醛中,然后依次進(jìn)行脫蠟脫水、檸檬酸抗原修復(fù)、PBS洗滌、3%雙氧水緩沖液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、3%BSA 封閉、加一抗(α-SMA)4 ℃孵育過夜、加二抗孵育 60 min、DAB 顯色、蘇木素復(fù)染、干燥脫水、封片處理,最后使用倒置顯微鏡觀察和拍照。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

LX2培養(yǎng)在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中,加入1%青霉素-鏈霉素抗生素,于37 ℃、5%CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ母液中按照所需濃度(40 μmol·L-1)取一定的體積,隨后加入到培養(yǎng)基中,混勻后繼續(xù)放至細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。同時,按照HiFectPlus 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑說明書(南京艾科軼生物,HiFectPlus-H-001)將LX2轉(zhuǎn)染ASCT2 siRNA,按培養(yǎng)基∶增強(qiáng)稀釋液∶轉(zhuǎn)染試劑:siRNA=1 000∶100∶2∶1的體積配制轉(zhuǎn)染體系,混合均勻后室溫靜置 30 min。隨后加入到另一個培養(yǎng)基中,混勻后繼續(xù)放至細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。

2.5 自噬流水平檢測

LX2轉(zhuǎn)染mRFP-eGFP-LC3,24 h后PBS洗滌3次。加入多聚甲醛固定15 min后,PBS洗滌3次。加入DAPI染色液染2 min,PBS洗滌3次。用抗淬滅劑封片。最后通過激光共聚焦顯微鏡觀察和拍照。

2.6 MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力

體外培養(yǎng)LX2細(xì)胞,細(xì)胞密度分布至90%左右時,消化收集細(xì)胞,加入完全培養(yǎng)基重懸,吸取200 μL細(xì)胞懸液加入到96孔板,每組設(shè)置6個復(fù)孔,提前配好藥物或試劑,待細(xì)胞貼壁后加入到96孔板中,作用24 h后,加入20 μL現(xiàn)配的MTT溶液(PBS配制,濃度為5 mg·mL-1),在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。孵育結(jié)束后,棄去上清,每孔加入150 μL DMSO,避光孵育10 min,酶標(biāo)儀波長設(shè)置為490 nm,檢測每個孔的吸光度。

2.7 Western blot檢測

將500 μL的細(xì)胞裂解液(PMSF∶磷酸酶抑制∶RIPA=1∶1∶100)加入500 mg的肝組織樣本或者大皿中,進(jìn)行研磨或者吹打,然后冰上裂解1 h,將裂解好的組織或者細(xì)胞放入管中,4 ℃下離心15 min,吸取上清、測濃度。在蛋白質(zhì)裂解物中加入相應(yīng)比例的Loading Buffer,在沸水浴中煮沸15 min。先制12%的凝膠,電泳分離蛋白后,將蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上,隨后用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜2 h,4 ℃下PVDF膜與相關(guān)一抗孵育過夜,次日二抗孵育2 h。超敏化學(xué)發(fā)光試劑A液與B液等體積混合均勻后加于PVDF膜上,并用凝膠成像儀顯影。使用 Image J 進(jìn)行條帶灰度定量。

2.8 細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶(Senescence-associated β-Galactosidase,SA-β-Gal)染色實(shí)驗(yàn)

按照SA-β-Gal染色試劑盒的說明書進(jìn)行操作,加入β-Gal固定溶液室溫孵育15 min,PBS洗滌3次,加入新鮮制備細(xì)胞染色工作溶液,在37 ℃避光條件下培養(yǎng)細(xì)胞過夜。最后使用顯微鏡觀察和拍照。

2.9 EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

按照EdU試劑盒的說明書進(jìn)行操作,在細(xì)胞收集前2 h用37 ℃預(yù)熱的EdU標(biāo)記。標(biāo)記后,用 4% 多聚甲醛將細(xì)胞固定10 min,并用 0.3% Triton X-100 透化。然后根據(jù)說明書中的步驟測定熒光強(qiáng)度。

2.10 MDA、ROS水平和SOD活力檢測

根據(jù)相應(yīng)試劑盒的說明書進(jìn)行操作,最后使用酶標(biāo)儀檢測其相應(yīng)水平。

2.11 線粒體膜電位檢測

在LX2細(xì)胞中加入JC-1染色工作液,在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min。在孵育期間,配制適量的JC-1 Buffer(1×),并放置于冰浴。孵育結(jié)束后,JC-1 Buffer(1×)洗滌3次。收集細(xì)胞,流式分析細(xì)胞內(nèi)膜電位的變化。

2.12 蛋白小體聚集分析

在LX2細(xì)胞中加入多聚甲醛固定15 min,PBS洗滌3次。加入0.1%曲拉通通透30 min。用Proteostat?染料孵育30 min,PBS洗滌3次。細(xì)胞核染DAPI 20 s,PBS洗滌3次。最后使用激光共聚焦觀察和拍照。

2.13 溶酶體數(shù)量檢測

LX2轉(zhuǎn)染LAMP1-RFP Plasmid,24 h后PBS洗滌3次。加入多聚甲醛固定15 min,PBS洗滌3次。加入DAPI染色液染2 min后,PBS洗滌3次。用抗淬滅劑封片。最后使用激光共聚焦顯微鏡觀察和拍照。

2.14 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計

3 結(jié)果

3.1 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ抑制ASCT2誘導(dǎo)HSC衰老

為了探究白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ抑制ASCT2對HSC衰老的作用,分別使用ASCT2 siRNA和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ處理LX2。MTT結(jié)果表明抑制ASCT2后,HSC細(xì)胞活力都有顯著下降(圖1A,P<0.01)。隨后,進(jìn)行EdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測HSC的增殖情況,結(jié)果顯示抑制ASCT2后,HSC細(xì)胞增殖能力下降(圖1B,P<0.01);接著,通過SA-β-Gal染色,發(fā)現(xiàn)ASCT2 siRNA以及白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ組的SA-β-Gal陽性染色細(xì)胞顯著高于空白組(圖1C,P<0.01)。以上結(jié)果驗(yàn)證了白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ通過抑制ASCT2誘導(dǎo)HSC發(fā)生衰老。

注:A.MTT檢測細(xì)胞活力;B.流式細(xì)胞術(shù)檢測EdU細(xì)胞增殖;C.光學(xué)顯微鏡觀察并定量SA-β-Gal衰老染色的細(xì)胞;與空白組比較,**P<0.01。標(biāo)尺=50 μm。圖1 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ抑制ASCT2誘導(dǎo)HSC衰老Fig.1 Atractylenolide Ⅲ inhibited ASCT2 to induce HSC senescence

3.2 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ抑制ASCT2誘導(dǎo)溶酶體依賴性的HSC衰老

為了進(jìn)一步研究ASCT2調(diào)控HSC衰老的機(jī)制,分別使用ASCT2 siRNA及白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ處理LX2。Western blot結(jié)果顯示LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值增大(圖2A,P<0.01),即表明溶酶體功能出現(xiàn)缺失。接下來,利用LC3探針及錯誤蛋白堆積ProteoStat染色檢測溶酶體功能,同時使用溶酶體標(biāo)記物L(fēng)AMP1的熒光質(zhì)粒檢測溶酶體數(shù)量,結(jié)果表明抑制ASCT2后,細(xì)胞的溶酶體數(shù)量增多、功能減弱(圖2B～F,P<0.01)。抑制ASCT2后加入CQ清除溶酶體,結(jié)果顯示加入CQ后細(xì)胞活力和自噬功能增加(圖2G～H,P<0.01)。通過溶酶體標(biāo)記物L(fēng)AMP1的熒光質(zhì)粒檢測溶酶體數(shù)量,結(jié)果表明抑制ASCT2后加入CQ,LAMP1的表達(dá)下調(diào)(圖2I～J,P<0.01)。綜上,以上結(jié)果證明白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ通過抑制ASCT2會使HSC中溶酶體數(shù)量增多,功能缺失,進(jìn)一步促進(jìn)自噬。

注:使用ASCT2 siRNA或白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ處理LX2細(xì)胞,A.Western blot檢測LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表達(dá)情況;B～C.LC3探針檢測溶酶體功能;D～E.溶酶體標(biāo)記物L(fēng)AMP1熒光質(zhì)粒檢測溶酶體數(shù)量;F.錯誤蛋白堆積ProteoStat染色檢測溶酶體功能。使用ASCT2 siRNA或白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ及CQ處理LX2細(xì)胞,G.Western blot檢測LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表達(dá)情況;H.MTT法評估細(xì)胞活力;I～J.溶酶體標(biāo)記物L(fēng)AMP1熒光質(zhì)粒檢測溶酶體數(shù)量;與空白組比較,**P<0.01;與ASCT2組比較,#P<0.05,##P<0.01;與白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ組比較,ΔΔP<0.01。標(biāo)尺=150 μm。圖2 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ抑制ASCT2誘導(dǎo)溶酶體依賴性的HSC衰老Fig.2 Atractylenolide Ⅲ inhibited ASCT2 to induce lysosome-dependent HSC senescence

3.3 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ通過抑制ASCT2介導(dǎo)的線粒體-溶酶體互作誘導(dǎo)HSC的衰老

為進(jìn)一步確定白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ抑制ASCT2使溶酶體數(shù)量增加,功能缺失的具體機(jī)制。首先使用ASCT2 siRNA及白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ處理LX2,試劑盒結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)MDA、ROS水平上升,而SOD活力下降(圖3A,P<0.01)。接下來,通過流式細(xì)胞術(shù)分析線粒體ROS水平和膜電位的情況,結(jié)果表明抑制ASCT2后線粒體ROS水平上升和線粒體膜電位下降(圖3B～C,P<0.01)。在抑制ASCT2后加入Rotenone清除線粒體,細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)得到了恢復(fù)(圖3D,P<0.01),同時通過溶酶體標(biāo)記物L(fēng)AMP1熒光質(zhì)粒及溶酶體探針觀察到加入Rotenone后,溶酶體數(shù)量下降到正常水平(圖3E～H,P<0.01)。以上結(jié)果證明了白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ抑制ASCT2會使線粒體ROS增多從而誘導(dǎo)HSC溶酶體依賴性的衰老。

注:使用ASCT2 siRNA或白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ處理LX2細(xì)胞,A.HSC細(xì)胞中MDA、SOD、ROS水平;B.流式細(xì)胞術(shù)檢測及定量分析線粒體ROS;C.流式細(xì)胞術(shù)測JC-1探針檢孵育后的線粒體膜電位。使用ASCT2 siRNA或白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ及Rotenone處理LX2細(xì)胞,D.HSC細(xì)胞中MDA、SOD、ROS水平;E～F.溶酶體標(biāo)記物L(fēng)AMP1熒光質(zhì)粒檢測溶酶體數(shù)量;G～H.溶酶體探針檢測溶酶體數(shù)量。與空白組比較,** P<0.01;與ASCT2組比較,## P<0.01;與白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ組比較,ΔΔ P<0.01。標(biāo)尺=150 μm。圖3 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ通過抑制ASCT2介導(dǎo)的線粒體-溶酶體互作誘導(dǎo)HSC的衰老Fig.3 Atractylenolide Ⅲ induced HSC senescence through inhibition of ASCT2-mediated mitochondrial-lysosomal interaction

3.4 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ通過誘導(dǎo)HSC衰老抗肝纖維化

接下來,為了探究白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ是否通過誘導(dǎo)HSC衰老抗肝纖維化,我們在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠中腹腔注射不同劑量的白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ,持續(xù)4周。HE、Masson和Sirius Red染色結(jié)果(圖4A)表明,與模型組相比,白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ改善肝臟組織破壞以及膠原沉積。Western blot結(jié)果(圖4B)表明白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ促進(jìn)HSC衰老指標(biāo)P16、P21的表達(dá)(P<0.01,P<0.001)。隨后,檢測了肝小葉中的SA-β-Gal陽性細(xì)胞,尤其是HSC。結(jié)果(圖4C)顯示,在白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ治療下的纖維化肝臟中,SA-β-Gal陽性細(xì)胞數(shù)量增加,而α-SMA表達(dá)減少。SA-β-Gal細(xì)胞與具有陽性α-SMA的細(xì)胞共定位并發(fā)揮負(fù)相關(guān)作用。以上結(jié)果證明白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ通過誘導(dǎo)HSC衰老抗肝纖維化。

注:A.HE、Masson和Sirius Red染色,標(biāo)尺=50 μm;B.Western blot分析衰老指標(biāo)P16和P21蛋白表達(dá);C.SA-β-Gal衰老染色以及α-SMA免疫組化染色的代表圖像和量化,標(biāo)尺=25 μm,箭頭表示SA-B-Gal 染色陽性的細(xì)胞。與空白組比較,***P<0.01;與CCl4組比較,##P<0.01,###P<0.001。標(biāo)尺=50 μm。圖4 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ通過誘導(dǎo)HSC衰老抗肝纖維化Fig.4 Atractylenolide Ⅲ inhibited liver fibrosis by inducing HSC senescence

4 討論

細(xì)胞衰老在肝纖維化的發(fā)展過程中扮演著關(guān)鍵的角色。肝星狀細(xì)胞作為肝纖維化的主要參與者之一,其衰老過程與纖維化的進(jìn)展密切相關(guān)[16]。衰老的肝星狀細(xì)胞在纖維化區(qū)域展現(xiàn)出明顯的特征,包括膠原蛋白生成減少和增殖活性降低。深入研究細(xì)胞衰老與肝纖維化之間的關(guān)聯(lián)有助于理解這一病理過程的分子機(jī)制。此外,通過干預(yù)細(xì)胞衰老的過程來調(diào)控肝星狀細(xì)胞的活性,有望防止或減緩肝纖維化的進(jìn)展[17]。這一領(lǐng)域的研究為未來開發(fā)更有效的肝纖維化治療方法提供了重要的啟示。

越來越多的研究表明,溶酶體-線粒體軸在細(xì)胞衰老中發(fā)揮重要作用[18]。溶酶體作為細(xì)胞內(nèi)主要的消化和降解器官,其功能障礙直接影響細(xì)胞內(nèi)的分子降解和循環(huán)[19]。當(dāng)溶酶體功能受損,無法有效地清除受損的線粒體和其他細(xì)胞器,會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂褐素等廢棄物質(zhì)的積累,而脂褐素的積累導(dǎo)致線粒體ROS水平的上升。同時,增加的 ROS 水平反過來又靶向溶酶體,形成一個惡性循環(huán)[5, 19]。這種線粒體與溶酶體之間的相互作用,被稱為溶酶體-線粒體軸,是細(xì)胞衰老的重要機(jī)制之一。因此,線粒體產(chǎn)生的ROS和溶酶體的功能障礙,都是觸發(fā)和加速細(xì)胞衰老過程的關(guān)鍵因素。通過深入研究這些機(jī)制,有望為延緩細(xì)胞衰老和治療與衰老相關(guān)的疾病提供新的策略和靶點(diǎn)。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ通過抑制ASCT2誘導(dǎo)線粒體ROS增多和膜電位降低,進(jìn)一步使溶酶體數(shù)量增加、功能缺失,從而促進(jìn)HSC衰老。此外,我們在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ通過誘導(dǎo)HSC衰老抗肝纖維化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ成為逆轉(zhuǎn)肝纖維化的有效藥物提供了理論依據(jù)。

慢性肝病進(jìn)展過程中無論病因如何,都涉及肝纖維化及傷口愈合反應(yīng)的持續(xù)性激活。因此,逆轉(zhuǎn)纖維化是降低慢性肝病發(fā)生率和死亡率,守護(hù)人類肝健康的關(guān)鍵事件。其中,活化的HSC又是肝纖維化病理機(jī)制的核心環(huán)節(jié),圍繞抗肝纖維化的研究大多與抑制肝星狀細(xì)胞活化有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過研究白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ抑制ASCT2影響線粒體-溶酶體互作誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞衰老的機(jī)制,為逆轉(zhuǎn)肝纖維化提供了新的治療思路,使ASCT2成為抗纖維化藥物研發(fā)的潛在靶點(diǎn)。盡管本實(shí)驗(yàn)揭示了白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ在體外對肝星狀細(xì)胞衰老的作用,并進(jìn)行了相關(guān)表型驗(yàn)證,但研究存在一定局限性。我們僅在體外環(huán)境中進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn),缺乏對復(fù)雜器官中各種分子和細(xì)胞類型相互作用的全面理解。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ在臨床應(yīng)用中的具體效果仍需進(jìn)一步的驗(yàn)證和研究。